הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

Summary

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

פרעות התפתחותיות אדם, כגון ממיקרוצפלוס-, ניתן ללמוד בצורה גרועה רק במודלים של בעלי חיים בשל העובדה כי מוח האנושי יש משטח קליפת מוח מורחב, תכונה ייחודית ושונת חיות לא אנושיות.

היבט זה עושה התפתחות המוח האנושי תהליך מורכב כי לא ניתן ללמוד מספיק בתוך 2D, במערכת תרבית תאים במבחנה. מתעוררים טכניקות התרבות 3D לאפשר לדור של organoids דמויי רקמה מתאי גזע מושרים (iPSCs). במבחנת הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבות השעית 3D מאפשר ההיווצרות של סוגי תאים שונים במועד ובאזור ספציפי, והוליד רקמות מאורגנות, מרובדת ^{1, 2, 3.} הודות מעבד כי חלוץ בטכנולוגיות תרבות 3D ו demystified המורכבת של היווצרות איברים, החלה מתאי גזע,פתחנו שיטה חזקה של יצירת organoids המוח להתוות אירועים מוקדמים של התפתחות מוח אנושית מודל ממיקרוצפלוס- במבחנה ^{1, 2, 3.} ראוי לציין כי התאמנו בשיטה המקורית שפיתח לנקסטר ואח. ¹ כדי ליצור organoids מוחין. שיטה זו שונתה על פי דרישות הניסוי שלנו.

מטרת מחקר מ ואח 'גבריאל. היה לנתח את המנגנונים התאיים ומולקולריים של תחזוקת תאי גזע עצבית במהלך התפתחות המוח. על מנת לעשות זאת, מחקר המכניסטי בוצע באמצעות ניתוח ובתאים עצביים (NPCs) ב organoids מוח 3D נגזר חולה ממיקרוצפלוס- ^4. החולה הזה נשא מוטציה CPAP, חלבון centrosomal נשמר הנדרשים biogenesis centrosome ^5. היפו מקובלהתזה היא כי ממיקרוצפלוס- הוא התוצאה של דלדול של ברכת NPC, זה עלול לנבוע גם למוות של תאים או בידול מוקדם ^{1, 6, 7, 8, 9.}

על ידי ניתוח אזורי חדרית (VZs) של organoids המוח ממיקרוצפלוס-, הודגם כי מספר משמעותי של NPCs לעבור חלוקת התא סימטרית, בניגוד organoids המוח נגזר מתורם בריא ^4. ניתוחים מיקרוסקופים וביוכימיים נרחבים של organoids מוח microcephalic חשפו תפקיד לא צפוי עבור CPAP מבולגן ריסים בזמן ^4. באופן ספציפי, CPAP מוטציה מזוהה עם פירוק cilium מפגר מחדש כניסת מחזור התא מתעכבת, מה שמוביל את הבידול המוקדם של NPCs ^4. תוצאות אלו מצביעות על תפקיד עבור ריסים ב ממיקרוצפלוס- ו המעורבות EIR במהלך מלא הנוירוגנזה גודל המוח ^10.

חלקו הראשון של פרוטוקול זה הוא תיאור של שיטת שלושת השלבים ליצירת organoids המוח הומוגנית. כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול לנקסטר המקורי הותאם ו שונה שמתאים למטרות שלנו ^1. ראשית, iPSCs אדם מתורבת מצב מזין ללא מוגדר על Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) מטריקס. צעד זה ימנע את הווריאציות של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מזין תלוי. בפרוטוקול זה, בדומה להשפעת בידול העצבי להקים אפיתל עצבית מתחילה ישירות iPSCs. אם תדלג גוף embryoid (EB) צעד ההיווצרות, את ההתמיינות העצבית בצורה מבוקרת יותר וביים. גישה זו מגבילה את ההיווצרות הספונטנית undirected של שכבות תאי ניבט אחרות, כגון המזודרם ו endoderm. על ידי יישום פרוטוקול זה, neurospheres המכיל רוזטות עצבית ניתן לקצור ביום 5 עבור EHS הטבעת מטריקס ותרבות השעיה נייחת. מדיום organoid המשמש את הצעד השלישי של הפרוטוקול שלנו הוא השלים עם dorsomorphin ו SB431542. Dorsomorphin הוא מעכב מולקולות קטנות של חלבון העצם morphogenic (BMP), וכן SB431542 מעכב את TGFβ / Activin / מסלול איתות קטרים. השילוב של גורמים אלה יכול לקדם בידול עצבי בצורה יעילה יותר מאשר חומצה רטינואית לבד ^{11, 12, 13, 14.}

בסך הכל, שינויים אלה מאפשרים לדור לשחזור של organoids המוח, עם וריאציות מינימאליות ברחבי organoids. חשוב לציין, שיטה זו יושמה כדי ליצור organoids המוח microcephalic וחסונה מן iPSCs החולה, הנושאות מוטציות בגנים המשפיעים centrosomes והדינמיקה מחזור התא.

החלק השני של פרוטוקול זה נותן הוראות להכנת brAin organoids לניתוח ופרשנות של ליקויים הסלולר ממיקרוצפלוס-. זה כולל קיבוע, cryosectioning, מכתים immunofluorescent, ואת ניתוח מיקרוסקופי confocal. פרוטוקול זה יספק את הקורא עם תיאור מפורט של תוצאות צפויות ובליווי לפרשנות.

Protocol

דור 1. של המוח Organoids (23 ימים)

1. ייזום של neuroectoderm (5 ימים)
   הערה: לשים לב לנקודות הבאות יש לשקול לפני תחילת הבידול. שיטת תכנות מחדש (lentiviral-, Sendai-virus-, episomal-, או microRNA מבוסס וכו ') כדי להשיג iPSCs האנושי באופן אידיאלי צריכה להיות זהה עבור כל המטופל ולשלוט קווי iPSC. ערכות והוראות התכנות מחדש שונים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו זמינים ^{15, 16, 17, 18.} איכות קווי iPSC האנושי הוא המפתח להגשמת בידול אופטימלי. נטר מורפולוגיה המושבה ואת התא עם מיקרוסקופ ולאמת מגוונת" ידי בדיקת הביטוי של סמנים כגון Oct3 / 4, Nanog, או TRA-1-60.
   1. האדם תרבות iPSCs בתנאים מזין ללא במדיום על צלחת מצופה Engelbreth-הולם-נחילמטריקס (EHS).
      הערה: Grow iPSCs אדם מזין חופשי סרום ללא לשמור על מצב התרבות מוגדר להימנע צעד נוסף להסרת תאי מזין עכבר עוברי (MEFs) לפני תחילת הבידול. מספר המעבר האופטימלי עבור iPSCs האדם להתחיל טווחי בידול מפסוק 15 על תכנות מחדש למעבר 70 בסך הכל. כאשר passaging, לנתק מושבות hiPSC כתאי המצרפי באמצעות פתרון ניתוק התא מתאים עם לחץ מכאני נמוך טפטף סרולוגיות 2-מיליליטר להעביר אגרגטים תבשיל חדש. הימנע ניתוק תאים בודדים, כמו זה עלול להשרות התמיינות אפופטוזיס ברוב קווי iPSC. עוד נמסר כי לטווח ארוך, passaging מתא בודד יכול להגדיל שינויים הגנומי האנושי iPSCs ^{19, 20.} הימנע נהלי תא ריחוק, אשר דורשים צעד צנטריפוגה להסיר פתרון ריחוק, כמו זה מקטין את הכדאיות הכללית של iPSCs. מִבְחָןכל התרבויות עבור זיהומים מיקרוביאליים, במיוחד mycoplasma, על בסיס קבוע, כי זה עלולה לשנות את איכות iPSCs ויכולת הבידול שלהם.
      1. מעיל צלחת תרבות 60 מ"מ רקמת עם מטריקס EHS לפי הוראות היצרן.
      2. להפשיר aliquot של 1 x 10 ⁶ iPSCs האנושי. זרעים iPSCs בצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ מצופה מטריצה EHS ו המכיל 5 מ"ל של מדיום (ראה טבלה חומרים). שינוי המדיום יומי המעבר לאחר 5 עד 7 ימים כאשר מגיעים תאים ~ 80% confluency.
         הערה: פרוזדור, iPSCs מופשר ב 80% confluency באמצעות שיטות סטנדרטיות, כגון ניתוק האנזים ללא מושבות ^21, לפחות פעם אחת לפני תחילת הבידול. בקיצור, להסיר את מדיום iPSC, לשטוף את התאים פעם עם 37 מחומם מראש ° של בינוני נשר Modified של C Dulbecco: F12 מזין תערובת (DMEM / F12), דגירת iPSCs הבאה היצרןהוראות שימוש ריאגנט (ראו טבלת חומרים). אין לעבור את זמן דגירה המומלצת כדי למנוע ניתוק תאים בודדים. iPSCs אדם צריך להיות מנותק צף כמו אגרגטים, לא תאים בודדים כמו. הם יכולים להיות מועברים לאחר מכן מנות מצופות מטריקס חדשים EHS; למשל, iPSC אגרגטים מן המנה 60 מ"מ אחד יכולה להיות מופצת 4 מנות 60 מ"מ חדשים.
      3. בדוק mycoplasma עם ערכת גילוי mycoplasma על פי הוראות היצרן. השתמש רק iPSCs mycoplasma-חופשי, כמו mycoplasma יכול לשנות את יכולת הבידול של iPSCs.
   2. לנתק iPSCs (80% ומחוברות) ולהכין השעית תא בודד באמצעות B. ריאגנט
      1. שטפו את iPSCs פעם עם מחומם מראש (37 ° C) DMEM / F12.
      2. להוסיף B מגיב מחומם מראש (למשל, 1 מ"ל בצלחת 60 מ"מ) דגירה iPSCs עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO _2.
      3. פליק 20 פעמים עם אצבע על הצד התחתון שלהמנה לנתק את iPSCs. בדקו את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ.
      4. פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה בצלחת 5 פעמים עם micropipette 1 מ"ל.
      5. להוסיף 3 מ"ל של מדיום לדלל 1 מ"ל של B מגיב ולאסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
      6. בעדינות לסובב את iPSCs (500 XG) במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של B בינוני לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
         הערה: שימו לב באמצעות B בינוני בלבד עבור resuspension. המנעו משימוש בינוני, מכיוון שהיא מכילה ריכוז גבוה מדי של bFGF, אשר עלול לעכב את הבידול.
   3. לדלל את ההשעיה התא 4.5 x 10 ⁵ תאים לכל מ"ל ב B בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Rho-מזוהה מעכב חלבון קינאז (Y-27,632).
   4. הוספת 100 μL לכל היטב צלחת לא חסיד, נ-תחתונה, 96-היטב.
      הערה: ודא התאים מופצים באופן שווה susפנסיה ידי ניעור הצינור בכל פעם לפני להוציא 100 חלקים μL. חשוב שכל היטב צריך להכיל מספר תאים שווה ערך על מנת לקבל neurospheres הומוגנית בגודל ובצורה (עגול, משטחים מוגדרים).
   5. בעדינות לסובב את הצלחת עם התאים ב 500 טמפרטורת XG ואת מקום 3 דקות לדגור 37 ° C ו 5% CO _2.
   6. שינוי המדיום יומי על ידי הסרת 50 μL והוסיף 50 μL של B הבינוני הטרי לתוך זה גם עבור 5 ימים הקרובים.

2. והטבעה Neurospheres במטריקס EHS (4 ימים)

1. הכן בינוני neurosphere ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C בינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 ללא (w / o) ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו (MEM), 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ ל אינסולין, ו 0.05 מ"מ β-mercaptoethanol.
2. אסוף את השנינות neurospheresחה 200 micropipette μL באמצעות קצה ~ 2 מ"מ לחתוך בעבר עם מספריים סטרילי.
3. מניחים את neurospheres כ 5 מ"מ אחד מהשני על הסרט פרפין (3 x 3 ס"מ ²⁾ בצלחת 100 מ"מ ריק ולהסיר בזהירות כמה שיותר המדיום הנותרים ככל האפשר.
4. להוסיף טיפה (7 μL) של מטריקס EHS על כל neurosphere יחיד.
5. דגירת מטריקס EHS יורד עם neurospheres עבור 15 דקות באינקובטור.
6. שטפו את neurospheres בקפידה מתוך הסרט פרפין ידי שטיפה אותם עם המדיום neurosphere. כדי לשטוף, להשתמש micropipette 1 מ"ל ו צלחת פטרי חדש 100 מ"מ המכיל 10 מ"ל של מדיום neurosphere.
7. דגירה neurospheres עבור 4 הימים הבאים ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום neurosphere טריים ביום 2.
   הערה: ודא כי המדפים בחממה הם שטוחים כך neurospheres מטריקס-מוטבע EHS לא יהיה גוש יחד בצד אחד של הצלחת.

3. Organoids ב השעיה רוטריתרבות (14 ימים)

1. כן בינוני מוח organoid ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C הבינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 w / o ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ MEM, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ אינסולין L, 0.5 מיקרומטר dorsomorphin, 5 מיקרומטר SB431542, ו 0.05 β-mercaptoethanol מ"מ.
2. מוסיפים 100 מ"ל של המוח organoid בינוני בקבוק אחד טווה באמצעות זרועות הצד שלה ולמקם אותם באינקובטור במשך מחמם מראש עבור דקות 20 לפחות.
3. הגדרת תוכנית ערבוב ב 25 סל"ד, בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: לפני העברת neurospheres EHS-מוטבע מטריצה ​​לתוך צלוחיות טווה, לוודא כי הם כל מופרדים. אם שניים או יותר מחוברים באמצעות מטריצת EHS, להפריד אותם על ידי חיתוך המטריצה ​​חיבור עם אזמל.
4. להעביר בזהירות את neurospheres EHS-מוטבע מטריצה ​​לתוך צלוחיות טווה המכיל 100 מ"ל של מדיום organoid לנוing פיפטה סרולוגיות 2 מ"ל. השתמש בנשק הצד של הבקבוק הטווה להעביר את neurospheres לתוך הבקבוק.
5. מניח את הצלוחיות טווים על פלטפורמת בחישה מגנטית באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2; זהו יום 0 של תרבות organoid.
6. שינוי המדיום פעם בשבוע (או בתדירות גבוהה יותר כאשר יש שינוי צבע) על ידי הסרת המחצית הבינונית ומוסיף אותה הכמות של מדיום חדש.
   הערה: כאשר לוקחים את צלוחיות טווה מתוך האינקובטור, להמתין 3-5 דקות כדי לתת organoids לשקוע לתחתית של הבקבוק. הסר את המדיום ידי הצבת קצה פיפטה זכוכית (מחוברת משאבה) על פני השטח של הנוזל; לשאוב את המדיום בזהירות באמצעות פתיחת צד אחד / זרוע של הבקבוק. מניפולציות אלה חייבים להיעשות מתחת למכסת המנוע למינרית.

ניתוח 4. של המוח Organoids

1. קיבוע של organoids
   1. אסוף את organoids ביום 14 של Wi תרבות הבקבוק טווהth micropipette מ"ל קיצוץ 1 (חתך ~ 5 מ"מ). שים את כל אותם בצלחת 60 מ"מ ו לשטוף אותם פעם אחת עם 5 מ"ל של DMEM / F12 חם עבור 3 דקות.
   2. הכן צינור 1.5 מ"ל עם 500 μL של paraformaldehyde 4% חם (PFA).
      זהירות: ילבש עור ומשקפי מגן ולעבוד מתחת למכסת מנוע בטיחות בעת הטיפול מקבע PFA.
   3. מניחים כל organoid בנפרד בכל צינור ולתקן אותם למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. אין לתקן את organoids יותר מ 60 דקות. כדי להזיז את organoids, להשתמש בלולאת חיסון או כל לתכנן אחרים כי הוא נוח.
   4. הסר את PFA לשטוף את organoids קבוע פעמיים עבור 10 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS.
   5. אחסן את organoids ב 1 מ"ל של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים, עד לשימוש נוסף.
2. המטעת organoids עבור Cryosectioning
   1. הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של סוכרוז 30% בפתרון מים מזוקקים לכל צינור כדי ליבש את organoids לפני cryofreezing אותם; לאחר הוספת sucrose פתרון, organoids יש צף על פני השטח. אחסן את organoids לילה פתרון סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס; על ידי למחרת organoids צריך שקע לתחתית של התחתית.
      הערה: ניתן לאחסן Organoids עד 3-5 ימים בבית 4 ° C בתמיסה סוכרוז, במידת הצורך.
   2. ממלאי תבנית ויניל דגימה עם 400 μL של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) ולהשתמש לולאת חיסון למקם organoid במרכז התבנית. סמן שפת התבנית עם שם המדגם.
   3. להקפיא את התבנית organoid המכילים בבית -80 ° C עד Cryosectioning.
   4. cryoslides זכוכית מעיל עם 0.1% פתרון פולי- L- ליזין (PLL) ב PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולתת את השקופיות להתייבש במשך 3 h. אחסן את השקופיות ב 4 ° C ו לחמם אותם לחדר ממוזג לפני השימוש.
      הערה: PLL ציפוי הוא צעד חשוב, כפי שהוא ימנע את פרוסות organoid מן צפתי משם. אוספים ושומרים פתרון PLL ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3חודשים. לפני שימוש חוזר, לסנן אותו עם מזרק 0.22 מיקרומטר ולתת לו חם לטמפרטורת החדר.
   5. סעיף cryofrozen organoids לתוך 20-50 פרוסות מיקרומטר בעובי על זכוכית מצופה PLL cryoslides ^22. תנו שקופיות עם חלקים להתייבש במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר. אחסן את הסעיפים ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.

5. Immunofluorescent מכתים סעיפים Organoid

הערה: האפיון הכללי של organoids, צביעה עם nestin, סמן ובתאים עצבי, ו Tuj1, סמן הפאן עצבי, מומלץ. כדוגמאות נוספות, מכתים immunofluorescent עם phospho-vimentin (p-Vim), אשר תוויות בתאי גליה רדיאלי המיטוטי הפסגה, ואת Arl13b, עבור cilium, מתוארים. כדי לבדוק אפופטוזיס, להשתמש במסוף deoxynucleotidyl transferase (TDT) dUTP ניק-End תיוג (TUNEL) assay. מניחים את השקופיות קופסת פלסטיק במהלך incubations כדי להגן עליהם מפני אבק, אור,וייבוש.

1. להפשיר את השקופיות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שטפו את השקופיות פעמיים עם 200 μL של גליצין PBS (0.225 גרם של גליצין ב PBS) עבור 3 דקות כדי להרוות את autofluorescence המושרה PFA.
3. Permeabilize הסעיפים עם 200 μL של 0.5% טריטון X100 / 0.1 Tween% בתמיסה PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לשטוף אותם פעמיים עם 200 μL של פתרון PBS-גליצין עבור 3 דקות.
5. דגירה אותם עם 200 μL של ג'לטין דגים 0.5% / 0.1% טריטון X100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C לחסום מחייב אנטיגן ספציפי.
   הערה: אם assay TUNEL נדרש, לבצע את assay לפי הפרוטוקול של היצרן. התחל עם assay TUNEL לפני ביצוע immunostaining, כיוון שהוא עלול להפריע נוגדנים משני להרוות fluorophores כאשר נעשה שימוש לאחר מכן.
6. לדלל את הנוגדנים בחסימת פתרון בריכוזים הבאים: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; ונוגדנים משניים, 1: 1000.
7. דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הראשון (למשל, nestin) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C..
8. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
9. לדלל את נוגדן 1 משני הראשון (אנטי העכבר 488): 1000 בחסימת פתרון דגירה השקופית 200 μL במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר. מעכשיו, תמיד להגן על שקופיות אור.
10. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
11. דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הבא (למשל, Tuj1) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
12. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
13. הוספת 200 μL של נוגדנים משני הבא (נגד ארנב 647) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
14. לשטוף 3 x 3 דקות. עם 200 μL של פתרון לחסימה.
15. הוספת 200 μL של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בכל קונצרט כלשהו 30 ננומטרentration ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר מכתים גרעיני.
16. לשטוף דק 2 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
17. לשטוף דק 1 x 1 עם 200 μL של מים מזוקקים ולתת החלקים להתייבש במשך 10-20 דקות, עד שאין טיפת מים ברורה גלויה יותר.
18. הר קטעים עם הטבעה בינוני. לאחסן אותם מפני אור ב 4 ° C עד מספר שבועות.
19. המשך עם ניתוח מיקרוסקופי לתמונה סקירה של אזור organoid, חדרית, צלחת קליפת המוח הפרימיטיבי, ותחומי עניין אחרים.
20. שימוש במיקרוסקופ confocal עם שמן 63X מסננים אובייקטיביים פלורסנט, נבחר על פי הנוגדנים משני הניאון מתויג צבע השמש ^{1, 10.}

תוצאות

הדור של organoids המוח דורש לפחות שלושה שבועות של culturing רציפה (איור 1A). כדי להשיג תוצאות לשחזור, אנו ממליצים כי החוקר מתעד כל צעד, חשוב, ימנע שינויים כלשהם לגבי רכיבים בינוניים, בנקודות זמן, וטיפול תא. הנה, אנחנו נותנים תמצית כיצד להעריך אם אבני דרך...

Discussion

MCPH היא הפרעה נוירו-התפתחותיות מורכבות אנושית שלא ניתן לסכם במודלים של בעלי חיים in vivo או תרבית תאים אנושיים פשוטים גישות במבחנה. הביטוי הקליני של MCPH מתחיל להופיע במהלך הטרימסטר הראשון, כאשר בתחילת נוירוגנסיס מתחיל. לפיכך, organoids מוח 3D מייצג מערכת ניסיונית אמי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers