JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Özet

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Giriş

Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir.

Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1, 2, 3 sebebiyet veren, zamanında ve bölgeye özgü bir şekilde, çeşitli hücre tiplerinin oluşmasını sağlar. 3D kültür teknolojilerini öncülük ve kök hücrelerinden başlayarak, organ oluşumu karmaşıklığını demystified laboratuarlar sayesindeinsan beyin gelişimi erken olayları tanımlamak için ve in vitro, 1, 2, 3 mikrosefali model beyin organoids üreten güçlü bir yöntem geliştirdi. Biz Lancaster ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem adapte olması dikkat çekicidir. serebral organoids 1 oluşturmak için. Bu yöntem deneysel gereksinimlerine göre değiştirildi.

Gabriel ve diğerleri arasından bir çalışmanın amacı. beyin gelişimi sırasında nöral kök hücre bakımı hücresel ve moleküler mekanizmaların analiz etmektir. Bunu yapmak için, mekanik bir çalışma mikrosefali hasta 4 türetilen 3D beyin organoids nöral projenitör hücreler (NPC) analiz ederek gerçekleştirildi. Bu hasta CPAP, sentrozom biogenezinin 5 için gerekli olan korunmuş centrosomal proteininde bir mutasyonun taşıdı. Bir yaygın olarak kabul hipoTez mikrosefali NPC havuz tükenmesi sonucu olduğunu ve bu, hücre ölümüne veya erken farklılaşma 1, 6, 7, 8, 9 ya da bağlı olabilir.

Mikrosefali beyin organoids ventriküler dilimleri (VZS) analiz ederek, bu NPC önemli sayıda sağlıklı bir vericiden 4 türetilmiş beyin organoids farklı olarak, asimetrik hücre bölünmesinin olmadığı gösterilmiştir. Mikrosefalik beyin organoids kapsamlı mikroskopik ve biyokimyasal analizler zamanında kirpikler sökme 4 CPAP için beklenmeyen bir rol ortaya çıkardı. Spesifik olarak, mutasyona uğramış CPAP NPC 4 erken farklılaşmasına yol açan, gecikmeli kirpik sökme ve gecikmeli hücre döngüsü yeniden giriş ile bağlantılıdır. Bu sonuçlar mikrosefali ve th cilia bir rol oynadığını düşündürmektedirnörogenez ve beyin büyüklüğü kontrol 10 sırasında EIR tutulumu.

Bu protokolün birinci parçası homojen beyin organoids oluşturmak için üç aşamalı bir yöntemi bir açıklamasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, orijinal Lancaster protokol adapte ve amacımızı 1 uyacak şekilde değiştirildi. İlk olarak, insan iPSCs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris üzerinde tanımlı bir besleyici içermeyen durumda kültürlenir. Bu adım, besleyici bağımlı pluripotent kök hücre kültürlerinin varyasyonları önler. Bu protokol, sinir farklılaşmasının indüksiyonu, sinir epiteli iPSCs şirketinden başlar oluşturulur. embriyoit gövde (EB) oluşturma aşamasını, daha kontrollü ve yönlendirilmiş bir şekilde sinir farklılaşma ilerler atlanarak. Bu yaklaşım, mezoderm ve endoderm gibi germ hücre katmanları, spontan ve yönsüz oluşumunu kısıtlar. Bu protokolü uygulayarak, nöral rozetler içeren Neurospheres EH için 5. günde hasat edilebilirS matrisi gömme ve sabit süspansiyon kültürü. Protokolde üçüncü adımı için kullanılan Organoid ortam dorsomorphin ve SB431542 ile takviye edilir. Dorsomorphin kemik morfojenik protein (BMP), küçük moleküllü inhibitörüdür ve SB431542 TGF / aktivin / düğüm sinyal yolunu inhibe eder. Bu faktörler bir araya sinir farklılaşmasını daha etkili bir tek 11, 12, 13, 14-cis retinoik asit teşvik edebilir.

Hep birlikte, bu modifikasyonların organoids boyunca en az varyasyonları ile, beyin organoids tekrarlanabilir üretilmesini mümkün kılmak. Önemli olarak, bu yöntem sağlam sentrozom ve hücre döngüsü dinamiklerini etkileyen genlerinde mutasyon taşıyan hasta iPSCs gelen mikrosefalik beyin organoids oluşturmak için uygulanmıştır.

Bu protokolün ikinci bölümü br hazırlamak için talimatlar verirain analizi ve mikrosefali hücresel kusurların yorumlanması için organoids. Bu tespit, krio-bölümleme, immünofloresan boyama ve odaklı mikroskopik analiz içerir. Bu protokol beklenen sonuçların ayrıntılı bir açıklama ile ve yorumlanması için rehberlik okuyucu sağlayacaktır.

Protokol

Beyin Organoids 1. Nesil (23 gün)

  1. Nöroektoderm başlatılması (5 gün)
    NOT: Aşağıdaki noktalar farklılaşma başlamadan önce düşünülmelidir. İnsan iPSCs elde etmek üzere yeniden programlama yöntemi (lentiviral- sendai-virüs- epizomal-, veya mikroRNA bazlı vs.), ideal hastada için aynı ve iPSC hatları kontrol edilmelidir. Çeşitli yeniden programlama kitleri ve yayınlanmış protokollere göre talimatları 15, 16, 17, 18 mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalite optimal farklılaşma gerçekleştirmek için bir anahtardır. Bir mikroskop ile koloni ve hücre morfolojisi Monitör ve Oct3 / 4, Nanog veya TRA-1-60 Markerlerin ekspresyonunu test ederek pluripotensini doğrulamak.
    1. Engelbreth-Holm-Swarm ile kaplanmış bir tabak üzerinde kültür ortamı A içinde besleyici içermeyen koşullar altında kültür insan iPSCs(EHS) matris.
      Not: İnsan iPSCs büyütün besleyici içermeyen ve serumsuz tanımlanmış bir kültür muhafaza edilmesi için ve farklılaşma başlamadan önce fare embriyonik besleyici hücreler (MEF'ler) çıkarılması için ek bir adım önlemek için. İnsan iPSCs için en uygun geçiş sayısı, toplam geçit 70 yeniden programlama üzerine geçit 15 farklılaşma aralığını başlatın. pasaj, yeni bir çanak agrega aktarmak için düşük mekanik stresle uygun bir hücre ayırma çözeltisi ve 2 ml serolojik pipet kullanarak agrega hücreleri gibi hiPSC koloniler ayırmak. bu en iPSC hatlarında farklılaşmayı ve apoptosis edilebileceği gibi tek hücrelere dissosiyasyonu kaçının. Uzun vadeli, tek-hücreli pasajlama insan iPSCs 19, 20 genomik değişiklik artırabilir olduğu bildirilmiştir. Bu iPSCs genel canlılığını azaltır, sıyrılma çözeltinin ayrılması için bir santrifüj aşamasını gerektirir hücre ayırma işlemleri, kaçının. Ölçekmikrobiyal kontaminasyonlarla, düzenli olarak özellikle mikoplazma, tüm kültürler bu iPSCs kalitesini ve bunların farklılaşma kapasitesinin değiştirmesi nedeniyle.
      1. Kaplama, üreticinin talimatlarına uygun olarak EHS matris ile bir 60 mm doku kültürü çanağı.
      2. 1 x 10 6, insan iPSCs bir kısım çözülme. EHS matris içinde kaplandı ve ortam A 5 mL (Malzeme Tablo) ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde iPSCs Seed. Hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında 5 ila 7 gün sonra günlük orta ve geçit değiştirin.
        Not: Geçiş farklılaşmasını başlamadan önce en az bir kez, örneğin koloni 21 enzim içermeyen ayrılması gibi standart yöntemler kullanılarak% 80 birleşme çözülmüş iPSCs. üreticinin aşağıdaki iPSCs Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), ve inkübe: Kısaca, iPSC orta kaldırmak önceden ısıtılmış 37 ° C Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı ile bir kez yıkama hücreleriReaktif A kullanılarak talimatları (malzeme tabloya bakınız). Tek hücrelere ayrışma önlemek için tavsiye edilen inkübasyon süresi aşmayın. İnsan iPSCs müstakil ve agrega gibi tek değil hücreleri olarak yüzen edilmelidir. Daha sonra, yeni EHS matris kaplı tabaklara transfer edilebilir; örneğin, iPSC bir 60 mm çanak 4 yeni 60 mm'lik tabaklara dağıtılabilir agrega.
      3. üreticinin talimatlarına göre bir mikoplazma algılama kiti ile mikoplazma için kontrol edin. mikoplazma iPSCs farklılaşma yeteneğine değiştirebilir olarak, sadece mikoplazma içermeyen iPSCs kullanın.
    2. iPSCs (% 80 kaynaşık), ayrıştırmaları ve reaktif B ile tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak
      1. Önceden ısıtılmış (37 ° C), DMEM / F12 ile bir kez iPSCs yıkayın.
      2. 37 ° C'de 5 dakika ve% 5 CO2 için iPSCs (60 mm tabak içinde, örneğin, 1 mL) önceden ısıtılmış reaktif B ilave edin ve inkübe edilir.
      3. tarafında ve alt tarafında bir parmak ile Flick 20 katçanak iPSCs ayırmak için. Mikroskop altında hücrelerin dekolmanı kontrol edin.
      4. 1 ml mikropipet ile tabak içinde yukarı ve aşağı 5 kez hücre süspansiyonu pipetle.
      5. reaktif B 1 mL seyreltik ve 15-ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu toplamak için ortam A 3 mL ekleyin.
      6. Yavaşça oda sıcaklığında 4 dakika boyunca iPSCs (500 x g) aşağı doğru döndürün.
      7. Ortam B'de 1 mL hücre pelletini ve bir hemositometrede hücre sayısını.
        NOT: yeniden süspanse edilmesi için sadece orta B'yi kullanarak farkında olun. Bu farklılaşmasını inhibe olabilir bFGF bir çok yüksek bir konsantrasyonda, olarak, ortam, bir kaçının.
    3. 10 uM rho-ilgili protein kinaz önleyicisi (Y-27632) ile desteklenmiş ortam B'de ml başına 4.5 x 10 5 hücre hücre süspansiyonu seyreltin.
    4. Bir yapışkan olmayan, V tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 100 uL ekleyin.
      NOT: emin olun hücreler eşit sus dağıtılır100 uL kısımları alınmadan önce tüpü her çalkalayarak pansiyon. Her bir boyut ve şekil (yuvarlak, oluşturulan yüzeylerin) içinde homojen nöroküreleri elde etmek üzere bir eşdeğer hücre sayısı içermelidir önemlidir.
    5. Yavaşça 3 dakika boyunca 500 x g'de oda sıcaklığında hücreler plaka aşağı spin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübe edin.
    6. 50 mcL kaldırılması ve önümüzdeki 5 gün boyunca her kuyuya taze ortam B 50 mcL ekleyerek günlük orta değiştirin.

EHS Matrix 2. gömülmesi Neurospheres (4 gün)

  1. W / olmadan (100 (h / h) takviyesi 2: 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak neurosphere orta hazırlayın o) A vitamini, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM esansiyel olmayan amino asitler (MEM), 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insülini, ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
  2. Neurospheres espri toplayınha bir ~ 2 mm uç kullanılarak 200 uL mikropipet daha önce steril bir makas ile kesilmiştir.
  3. Boş 100 mm tabak içinde yaklaşık 5 mm uzaklıkta parafin film (3 x 3 cm 2) üzerinde birbirinden nöroküreleri yerleştirin ve dikkatli bir sürede geri kalan ortam kadar çıkarın.
  4. Her bir neurosphere üzerine EHS matrisinin bir damla (7 uL) ilave edilir.
  5. EHS matris, bir kuluçka makinesi içinde 15 dakika için neurospheres ile damla inkübe edin.
  6. neurosphere ortamla onları yıkanmak suretiyle parafin filmden dikkatle nöroküreleri yıkayın. temizlemek için, 1 ml mikropipet ve neurosphere ortamı 10 mL içeren yeni bir 100 mm Petri kabı kullanılır.
  7. Sonraki 4 gün boyunca nöroküreleri inkübe ve 2 gün sonra, taze neurosphere orta 2 ml.
    NOT: EHS matris gömülmüş Neurospheres yemeğin bir tarafta yığın birlikte olmayacak şekilde kuluçka raflar düz olduğundan emin olun.

Bir döner süspansiyon 3. OrganoidsKültür (14 Gün)

  1. 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 100 (h / h) takviyesi 2 w / o 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak beyin Organoid orta hazırlayın Vitamin A, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM MEM, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insulin, 0.5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542 ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
  2. yan kollar üzerinden her bükme şişesi beyin Organoid ortamın 100 ml ilave edilir ve en az 20 dakika boyunca ön ısıtma için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
  3. üreticinin talimatlarına göre, 25 rpm'de bir karıştırma programı kurun.
    NOT: döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri aktarmadan önce, hepsi ayrıldığından emin olun. İki veya daha fazla EHS matris boyunca bağlı ise, bir bisturi ile bağlantı matrisi kesilerek ayırın.
  4. Dikkatle Organoid ortamın 100 mL içeren döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri transferi bize2 ml serolojik pipet ing. şişe içine nöroküreleri aktarmak için bükme şişesi yan kollarını kullanın.
  5. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile bir inkübatör içerisinde bir manyetik karıştırma platformu üzerinde döndürme şişeleri yerleştirin; Bu Organoid kültürün gün 0'dır.
  6. (Ya da daha sık bir renk değişimi olduğunda) orta yarısını kaldırılması ve taze ortam aynı miktarda ekleyerek haftada bir ortam değiştirin.
    Not: kuluçka döndürme şişeleri çekerken, organoids şişenin tabanına iner izin 3-5 dakika bekleyin. sıvının yüzeyi üzerinde (bir pompaya bağlı) bir cam pipet yerleştirerek orta çıkarın; dikkatli bir şekilde bir yan açıklık / şişenin kolu ile orta aspire. Bu manipülasyonlar laminer kaputun altında yapılmalıdır.

Beyin Organoids 4. analizi

  1. Organoids fiksasyonu
    1. spinner şişesi kültür wi 14. gününde organoids toplayınbir kesim 1 ml mikropipet (kesim ~ 5 mm) th. 60 mm tabak hepsini koyun ve 3 dakika için sıcak DMEM / F12 5 mL kez yıkayın.
    2. Sıcak% 4 paraformaldehit 500 uL (PFA) ile 1.5 ml tüp hazırlanır.
      Dikkat: PFA fiksatif tutarken bir emniyet başlık altında cilt ve göz koruması ve iş giyin.
    3. her biri ayrı ayrı ve her bir tüp içinde oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca, onları gidermek organoid yerleştirin. daha uzun 60 dakika boyunca organoids düzeltmek etmeyin. organoids taşımak için bir aşılama döngü veya uygun başka herhangi bir vasiyetle kullanın.
    4. PFA çıkarın ve 1 mL PBS ile her biri 10 dakika için iki kere sabit organoids yıkayın.
    5. sonraki kullanıma kadar, en fazla 7 gün boyunca 4 ° C'de 1 mL PBS içinde organoids saklayın.
  2. Cryosectioning için organoids katıştırma
    1. PBS çıkarın ve cryofreezing önce organoids kurutmak için tüp başına damıtılmış su çözeltisi içinde% 30 sukroz, 1 mL eklemek; Sukro ekledikten sonrase Çözelti organoids yüzeyde yüzen olmalıdır. 4 ° C'de sukroz çözeltisi gece boyunca organoids saklayın; Bir sonraki gün geçtikçe, organoids tüpün dibine batmış olması gerekirdi.
      Not: gerekirse Organoids, sukroz çözeltisi içinde 4 ° C'de en fazla 3-5 gün saklanabilir.
    2. Optimum kesme ısısı (OCT), bileşik 400 uL bir vinil numune kalıbı doldurmak ve kalıp merkezindeki bir organoid yerleştirmek için bir aşılama döngü kullanılır. Numune adıyla kalıp kenarını etiketleyin.
    3. cryosectioning kadar -80 ° C 'de organoid içeren kalıp dondurun.
    4. Kat cam, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 poli-L-lizin çözeltisi (PLL) ile cryoslides ve izin slaytlar, 3 saat boyunca kurutulur. 4 ° C'de slaytlar saklayın ve kullanmadan önce oda ılımana onları ısıtın.
      NOT: uzağa yüzmesini Organoid dilim önleyecektir olarak PLL-kaplama, önemli bir adımdır. Toplamak ve en fazla 3 kadar 4 ° C'de saklayın PLL çözeltisiaydır. tekrar kullanılmadan önce, 0.22 mikron bir şırınga ile filtre edilir ve oda sıcaklığına kadar sıcak sağlar.
    5. PLL kaplı cam üzerinde 20-50 um kalınlığında dilimler halinde Kısım cryofrozen organoids 22 cryoslides. bölümlerle Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca kurumasına izin verin. daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de bölümleri saklayın.

Organoid Bölümlerin 5. Immunofluorescent Boyama

NOT: Nestin, bir sinirsel kök işaretleyici ve Tuj1, bir pan-nöronal marker ile boyama organoids genel karakterizasyonu için, tavsiye edilir. Ek örnekler, mitotik apikal radyal glial hücreleri etiketler fosfo-vimentin (p-um), ve Arl13b ile immünofloresan boyama gibi, kirpiksi cisim için tarif edilmiştir. apoptozu test etmek için, DSB'leri (TdT) dUTP Nick Sonu Etiketleme (TÜNEL) deneyi kullanmaktadır. tozdan korumak için inkubasyon sırasında plastik bir kutu içinde slaytlar yerleştirin, hafif,ve kurutma.

  1. Oda sıcaklığında 30 dakika için slaytlar çözülme.
  2. PFA-kaynaklı otoflüoresan söndürmek için 3 dakika süre ile PBS-glisin, 200 uL (PBS içerisinde glisin 0.225 g) ile, iki kez slaytlar yıkayın.
  3. % 0.5 Triton X-100'ün 200 uL / ​​oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 Tween ile bölümleri permeabilize.
  4. 3 dakika için PBS-glisin çözeltisi 200 uL ile iki kez yıkanır.
  5. Spesifik olmayan antijen bağlanma bloke etmek için oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS içinde% 0.5 balık jelatini 200 uL /% 0.1 Triton X 100 ile inkübe edin.
    NOT: Bir TÜNEL deneme gerekiyorsa, üreticinin protokolüne uygun olarak tahlil gerçekleştirin. ikincil antikorlar müdahale ve sonrasında kullanıldığında fluorophores gidermek edebileceğiniz gibi, immun boyama yapmadan önce TÜNEL tahliline ile başlayın.
  6. Nestin, 1: aşağıdaki konsantrasyonlarda çözüm engelleme antikorlar seyreltilir 200; p-um, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 1:20; ve ikincil antikorlar, 1: 1,000.
  7. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 1-2 saat boyunca, ilk birincil antikor 200 uL (örneğin, Nestin) ile inkübe edin.
  8. bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
  9. bloke etme çözeltisi içinde 1.000 ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 200 uL slayt inkübe: ilk (anti-fare 488) sekonder antikoru 1 seyreltin. Şu andan itibaren her zaman ışıktan slaytlar korur.
  10. bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
  11. Oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C (örneğin, Tuj1) aşağıdaki primer antikor 200 uL kuluçkalayın.
  12. bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın.
  13. Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bir sonraki ikincil antikor (anti-tavşan 647) 200 uL ekleyin.
  14. 3 x 3 dakika yıkayın. bloke etme çözeltisi, 200 uL.
  15. 30 nM konsantre en az 4' , 200 uL, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyinnükleer boyama için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde entration.
  16. bloke etme çözeltisi 200 uL 2 x 3 dakika yıkayın.
  17. damıtılmış su 200 uL 1 x 1 dak yıkanır ve belirgin bir su damlası daha fazla görünür hale gelene kadar bölümler, 10-20 dakika boyunca kurumaya bırakın.
  18. orta gömme bulunduğu bölümleri monte edin. onları birkaç haftaya kadar 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak saklayın.
  19. görüntüye mikroskopik analizi organoid, ventriküler bölge, ilkel kortikal plaka ve ilgilenilen diğer alanlarında bir bakış ile devam edin.
  20. 1, 10, kullanılan floresan boya etiketli sekonder antikor göre seçilen bir 63X yağ objektif ve flüoresan filtreler ile konfokal mikroskop kullanın.

Sonuçlar

Beyin organoids üretilmesi, sürekli kültürleme (Şekil 1A), en az üç hafta gerekir. tekrarlanabilir sonuçlar başarmak için araştırmacı her adımda belgeleyen ve daha da önemlisi, orta bileşenleri, zaman noktaları ve baz muameleleri ile ilgili herhangi bir değişiklik önler öneririz. Burada, kritik kilometre taşları deney sonunda yeterli kalitede organoids elde etmek için ulaşılır eğer nasıl değerlendirileceğini bir özetini verir. 96 oyuklu bi...

Tartışmalar

MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrum...

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse 488InvitrogenA-11001Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647InvitrogenA-21245Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN systemIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12Gibco, US31331093Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Compound C; multiple suppliers
Embedding mediumAppliChemA9011, 0100Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrixCorning354277Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin Sigma-Aldrich, USG7765-250MLGelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
GlycineAppliChemA1067,1000Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)Sigma Aldrich, USBR452201-1000EAmultiple suppliers 
InsulinSigma-Aldrich, USI3536-100MGmultiple suppliers
L-glutamineGibco, US25030081L-glutamine (200 mM)
Medium AStem cell technologies#05850mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium BStem cell technologies#05835Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium CGibco, US21103049Neural Basal Medium
MEMGibco, US11140035MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonza, Switzerland#LT07-218Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
NestinNovus biologicalsNBP1-92717Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)AppliChemA3813, 05004% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tabletsGibco, US18912014See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Gibco, US15140122Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)Sigma-Aldrich, USP8920-100MLMultiple suppliers
pVimMBLD076-3SPhospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A Stem cell technologies# 05872Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B Sigma-Aldrich, USA6964-100MLAccutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 SMultiple suppliers
SB431542Selleckchem.comS1067Multiple suppliers
Spinner flask 250 mLIBS Integra Bioscience182026
SucroseAppliChemA4734, 1000Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slidesThermo scientific, USJ3800AMNZSlides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1Gibco, US17502048N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin AGibco, US12587010B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura, NL4583Multiple suppliers
Triton X-100AppliChemA1388,0500Multiple suppliers
TUJ1Sigma-Aldrich, UST2200β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assayPromega, USG3250DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biologyAppliChemA4974,0500Multiple suppliers
waterproof sheetBEMIS company, inc.PM996Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632 Selleckchem.comS1049ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanolGibco, US313500102-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

Referanslar

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?. Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 122iPSCssinirsel k k h crelerbeyin organoidsmikrosefalisentrozomlarbirincil kirpik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır