Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

Résumé

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Résumé

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

troubles neurodéveloppementaux humains, tels que microcéphalie, ne peuvent être mal étudiés dans des modèles animaux en raison du fait que les cerveaux humains ont une surface corticale étendue, une caractéristique unique différent des animaux non humains.

Cet aspect rend le développement du cerveau humain un processus complexe qui ne peut pas être suffisamment étudié dans une 2D, système in vitro de culture cellulaire. Nouvelles techniques de culture 3D permettent la génération d'organites analogue à un tissu à partir de cellules souches pluripotentes induites (CISP). La différenciation des cellules souches pluripotentes dans une culture en suspension 3D in vitro permet la formation de différents types de cellules en temps opportun et spécifique à la région, ce qui donne lieu à une organisation, d'un tissu stratifié ^{1, 2, 3.} Merci aux laboratoires qui furent les pionniers des technologies de culture 3D et démystifié la complexité de la formation d'organes, à partir de cellules souches,nous avons développé une méthode robuste de générer organites du cerveau pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et de modéliser microcéphalie in vitro ^{1, 2, 3.} Il est à noter que nous avons adapté la méthode originale développée par Lancaster et al. pour générer des organites cérébraux ^1. Cette méthode a été modifiée en fonction de nos exigences expérimentales.

Le but d'une étude de Gabriel et al. était d'analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'entretien des cellules souches neurales au cours du développement du cerveau. Pour ce faire, une étude mécaniste a été réalisée en analysant les cellules progénitrices neurales (PNJ) dans organites du cerveau 3D provenant d'un patient microcéphalie ^4. Ce patient effectue une mutation dans CPAP, une protéine centrosomale conservée nécessaire pour biogenèse centrosome ^5. Une hypo largement acceptéethèse est que microcephaly est le résultat d'une diminution de la piscine de l' APN, et cela peut être dû soit à la mort cellulaire ou de différenciation précoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

En analysant les zones ventriculaires (VZS) de organites du cerveau microcéphalie, il a été montré qu'un nombre important de PNJ subissent une division cellulaire asymétrique, contrairement organites du cerveau provenant d'un donneur sain ^4. De nombreuses analyses microscopiques et biochimiques des organites du cerveau microcéphalie ont révélé un rôle inattendu pour la PPC dans le démontage de ⁴ cil en temps opportun. Plus précisément, CPAP mutée est associée à un démontage de cil retardé et le cycle cellulaire retardée ré-entrée, ce qui conduit à la différenciation prématurée des NPC ^4. Ces résultats suggèrent un rôle dans microcéphalie et cilia eimplication EIR lors du contrôle de la neurogenèse et la taille du cerveau ^10.

La première partie de ce protocole est une description d'un procédé en trois étapes pour générer des organites homogènes du cerveau. Comme mentionné précédemment, le protocole de Lancaster original a été adapté et modifié en fonction de notre objectif ^1. Tout d'abord, iPSCs humains sont cultivées dans un état opérationnel sans matrice définie sur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Cette étape permet d'éviter les variations des cultures de cellules souches pluripotentes dépendant de l'alimentation. Dans ce protocole, l'induction de la différenciation de neurones pour former un épithélium neural commence directement à partir de iPSCs. En sautant l'étape de formation corps embryoïdes (EB), le produit de différenciation de neurones, d'une manière plus contrôlée et dirigée. Cette approche limite la formation spontanée et non orienté d'autres couches de cellules germinales, tels que le mésoderme et l'endoderme. En appliquant ce protocole, neurosphères contenant des rosettes de neurones peuvent être récoltées au jour 5 pour EHS enrobage de matrice et une culture en suspension stationnaire. Le milieu organoïde utilisé pour la troisième étape de notre protocole est complété par dorsomorphin et SB431542. Dorsomorphin est un inhibiteur de petite molécule de protéine morphogénique osseuse (BMP), et SB431542 inhibe la TGFß / activine / voie de signalisation nodal. La combinaison de ces facteurs pourrait favoriser la différenciation neuronale plus efficace que l' acide rétinoïque seul ^{11, 12, 13, 14.}

Au total, ces modifications permettent la génération reproductible de organites du cerveau, avec des variations minimes à travers organites. Fait important, cette méthode a été appliquée pour générer des organites robuste du cerveau microcéphales de iPSCs patients qui portent des mutations dans des gènes qui affectent centrosomes et de la dynamique du cycle cellulaire.

La seconde partie de ce protocole donne des instructions pour préparer brain organites pour l'analyse et l'interprétation des défauts cellulaires dans microcéphalie. Cela comprend la fixation, cryosectioning, immunofluorescence et analyse microscopique confocale. Ce protocole fournira au lecteur une description détaillée des résultats attendus et des conseils d'interprétation.

Protocole

1. Génération du cerveau organites (23 jours)

1. Initiation de neuroectoderme (5 jours)
   REMARQUE: Les points suivants doivent être pris en considération avant le début de la différenciation. La méthode de reprogrammation (lentiviral-, sendai-virus-, épisomiques ou etc. , selon microARN) pour obtenir CSPi humaines devrait idéalement être la même pour tous les patients et le contrôle des lignes iPSC. Divers kits de reprogrammation et instructions basées sur des protocoles publiés sont disponibles ^{15, 16, 17, 18.} La qualité des lignes iPSC humaines est la clé pour une différenciation optimale accomplir. Surveiller la colonie et la morphologie des cellules au microscope et valider la pluripotence en testant l'expression de marqueurs tels que Oct3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60.
   1. CSPi humaines de la culture dans des conditions sans alimentation dans le milieu A sur un plat recouvert de Engelbreth-Holm-Swarmmatrice (EHS).
      REMARQUE: cultiver des liaisons de connexion iPSCs humains et exempt de sérum pour maintenir une condition de culture défini et d'éviter une étape supplémentaire pour l'élimination des cellules nourricières embryonnaires de souris (MEF) avant le début de la différenciation. Le nombre de passage optimal pour l'homme iPSCs pour démarrer les plages de différenciation de passage 15 lors de la reprogrammation de passage 70 au total. Lorsque repiquage, détacher colonies hiPSC en tant que cellules globale à l'aide d'une solution de détachement cellulaire appropriée avec une faible contrainte mécanique et d'une pipette sérologique de 2 mL pour transférer les agrégats dans une nouvelle boîte. Évitez la dissociation des cellules individuelles, car cela pourrait induire la différenciation et l'apoptose dans la plupart des lignes iPSC. Il a été rapporté que le long terme, une seule cellule repiquage pourrait augmenter les altérations génomiques dans CSPi humaine ^{19, 20.} Évitez les procédures de détachement de cellules, qui nécessitent une étape de centrifugation pour éliminer la solution de détachement, car cela réduit la viabilité globale de CSPi. Testertoutes les cultures pour microbiennes, en particulier les contaminations mycoplasmes, sur une base régulière, car cela pourrait altérer la qualité des CSPi et leur capacité de différenciation.
      1. Enduire un plat de culture de tissu de 60 mm avec la matrice EHS selon les instructions du fabricant.
      2. Décongeler une aliquote de 1 x 10 ⁶ iPSCs humains. Ensemencer les iPSCs dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm revêtues dans une matrice EHS et contenant 5 ml de milieu A (voir le tableau des matériaux). Changer le support quotidien et passage après 5 à 7 jours lorsque les cellules atteignent ~ 80% de confluence.
         REMARQUE: Passage de la iPSCs à 80% de confluence décongelées en utilisant des méthodes standard, telles que le détachement sans enzyme de colonies ^21, au moins une fois avant de commencer la différenciation. En bref, éliminer le milieu COPS, laver les cellules une fois avec préchauffé à 37 ° C modifié par Dulbecco milieu Eagle: mélange nutritif F12 (DMEM / F12), et laisser incuber les CSPi suivant le fabricantdes instructions en utilisant le réactif A (voir le tableau de matériaux). Ne pas dépasser le temps d'incubation recommandé afin d'éviter la dissociation des cellules individuelles. CSPi humaines doivent être détachés et flottants sous forme d'agrégats, non pas comme des cellules individuelles. Ils peuvent ensuite être transférés vers de nouveaux plats enrobés de matrice EHS; par exemple, COPSi agrégats d'un plat de 60 mm peut être distribué à 4 nouveaux plats de 60 mm.
      3. Vérifier les mycoplasmes avec un kit de détection de mycoplasmes selon les instructions du fabricant. Utilisez uniquement CSPi sans mycoplasmes, comme mycoplasmes peut modifier la capacité de différenciation des CSPi.
   2. Dissociable iPSCs (80% de confluence) et préparer une suspension de cellules isolées à l'aide de réactif B.
      1. Laver les iPSCs une fois avec préchauffé (37 ° C) DMEM / F12.
      2. Ajouter le réactif préchauffé B (par exemple, 1 mL dans une boîte de 60 mm) et incuber les iPSCs pendant 5 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
      3. Flick 20 fois avec un doigt sur le côté et le bas dele plat à détacher les CSPi. Vérifiez que le détachement des cellules au microscope.
      4. Pipeter la suspension cellulaire et dans le plat 5 fois avec une micropipette 1 ml.
      5. Ajouter 3 ml de milieu A pour diluer 1 ml de réactif B et récupérer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 ml.
      6. tourner doucement les iPSCs (500 xg) pendant 4 min à température ambiante.
      7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu B et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
         REMARQUE: Sachez que l'utilisation moyenne B pour la remise en suspension. Éviter d'utiliser le milieu A, car il contient une concentration trop élevée de bFGF, ce qui pourrait inhiber la différenciation.
   3. Diluer la suspension de cellules à 4,5 x 10 ⁵ cellules par ml dans du milieu B supplémenté avec 10 pM de protéine kinase associée à rho-inhibiteur (Y-27632).
   4. Ajouter 100 ul par puits dans un non-adhérent, v-fond, la plaque à 96 puits.
      REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont également distribuées dans le SUSpension en secouant le tube à chaque fois avant de retirer des portions de 100 ul. Il est important que chaque puits contienne un nombre équivalent de cellules afin d'obtenir des neurosphères homogènes en taille et en forme (ronde, des surfaces définies).
   5. Tourner doucement la plaque avec les cellules à 500 xg et à température ambiante pendant 3 minutes et incuber à 37 ° C et 5% de CO _2.
   6. Changer le support quotidien en enlevant 50 pi et en ajoutant 50 pi de milieu frais B dans chaque puits pour les 5 prochains jours.

2. Embedding Neurosphères dans Matrix EHS (4 jours)

1. Préparer milieu neurosphères en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 sans (p / o) la vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM d'acides aminés non essentiels (MEM), 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d'insuline et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol.
2. Recueillir l'esprit neurosphèresha 200 ul micropipette utilisant un ~ 2 mm pointe préalablement coupé avec des ciseaux stériles.
3. Placer les neurosphères environ 5 mm de distance les uns des autres sur un film de paraffine (3 x 3 cm ²⁾ dans un récipient vide de 100 mm et enlever soigneusement autant du milieu restant possible.
4. Ajouter une goutte (7 pi) de la matrice EHS sur chaque neurosphères unique.
5. Incuber la matrice EHS gouttes avec les neurosphères pendant 15 min dans un incubateur.
6. Laver les neurosphères soigneusement du film de paraffine par les bouffées de chaleur avec le milieu Neurosphère. Pour rincer, utiliser une micropipette de 1 ml et une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de milieu neurosphères.
7. Incuber les neurosphères pour les 4 prochains jours et ajouter 2 ml de milieu frais Neurosphère le jour 2.
   REMARQUE: Assurez-vous que les étagères dans l'incubateur sont à plat afin que les neurosphères de matrice intégrée EHS ne s'agglutiner d'un côté du plat.

3. organites dans une suspension RotaryCulture (14 Jours)

1. Préparer cerveau moyen organoïde en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 w / o La vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM de MEM, 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d'insuline, 0,5 pM dorsomorphin, 5 uM SB431542, et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol.
2. Ajouter 100 ml de cerveau organoide moyenne à chaque flacon à rotation par ses bras latéraux et les placer dans un incubateur pour préchauffage pendant au moins 20 min.
3. Mettre en place un programme d'agitation à 25 tours par minute, selon les instructions du fabricant.
   NOTE: Avant de transférer les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons spinner, assurez-vous qu'ils sont tous séparés. Si deux ou plus sont connectés à travers la matrice EHS, les séparer par découpage de la matrice de liaison avec un scalpel.
4. Transférer délicatement les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons contenant spinner 100 ml de milieu organoide nousune pipette sérologique ing 2 ml. Utiliser les bras latéraux de la fiole centrifuge pour transférer les neurosphères dans le ballon.
5. Placer les flacons rotatifs sur une plate - forme d'agitation magnétique dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2; c'est le jour 0 de la culture organoide.
6. Changer le support une fois par semaine (ou plus souvent quand il y a un changement de couleur) en supprimant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais.
   REMARQUE: Lorsque vous prenez les flacons spinner de l'incubateur, attendez 3-5 minutes pour laisser les organites couler au fond du flacon. Éliminer le milieu en plaçant la pointe de pipette en verre (relié à une pompe) sur la surface du liquide; aspirer le milieu avec précaution à travers une ouverture latérale / bras du ballon. Ces manipulations doivent être effectuées sous la hotte laminaire.

4. Analyse du cerveau organites

1. Fixation des organites
   1. Recueillir les organites au jour 14 de la culture de flacon spinner with une réduction de 1 ml micropipette (cut ~ 5 mm). Mettez tous dans un plat de 60 mm et les laver une fois avec 5 ml de DMEM / F12 chaud pendant 3 min.
   2. Préparer un tube de 1,5 ml avec 500 ul de chaleur paraformaldehyde à 4% (PFA).
      Attention: Porter une protection peau et les yeux et le travail sous une hotte de sécurité lors de la manipulation PFA fixatif.
   3. Placez chaque organoide séparément dans chaque tube et les fixer pendant au moins 30 min à température ambiante. Ne pas fixer les organites pendant plus de 60 min. Pour déplacer les organites, utilisez une boucle d'inoculation ou tout autre legs qui est pratique.
   4. Retirer le PFA et laver les organites fixes deux fois pendant 10 min chacune avec 1 ml de PBS.
   5. Stocker les organites dans 1 ml de PBS à 4 ° C pendant jusqu'à 7 jours, jusqu'à utilisation ultérieure.
2. Intégrer les organites pour cryosectioning
   1. Retirez le PBS et ajouter 1 ml de saccharose à 30% dans une solution d'eau distillée par tube pour déshydrater les organites avant de les cryofreezing; après avoir ajouté sucrosolution soi, les organites doit être flottant à la surface. Stocker les organites pendant une nuit dans une solution de saccharose à 4 ° C; le lendemain, les organites auraient dû sombré au fond du tube.
      REMARQUE: Les organites peuvent être conservés jusqu'à 3-5 jours à 4 ° C en solution de saccharose, le cas échéant.
   2. Remplir un moule de spécimen de vinyle avec 400 pi de composé de température de coupe optimale (OCT) et en utilisant une boucle d'inoculation pour placer une organoïde au centre du moule. Étiqueter le bord du moule avec le nom de l'échantillon.
   3. Congeler le moule organoïde contenant à -80 ° C jusqu'à ce que cryosectioning.
   4. Manteau cryoslides de verre avec 0,1% de poly-L-lysine solution (PLL) dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et laisser les lames sécher pendant 3 h. Conserver les lames à 4 ° C et les réchauffer au tempérée ambiante avant utilisation.
      REMARQUE: PLL revêtement est une étape importante, car elle empêche les tranches organoïdes de flotter loin. Collecter et stocker une solution PLL à 4 ° C pendant jusqu'à 3mois. Avant de réutiliser, filtrer avec une seringue de 0,22 um et laisser réchauffer à la température ambiante.
   5. Section cryofrozen organites dans des tranches 20-50 pm d'épaisseur sur verre revêtu PLL-cryoslides ^22. Laissez les lames avec les sections sécher pendant 1 h à température ambiante. Stocker les sections à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur.

5. immunofluorescente des sections organoide Staining

NOTE: Pour la caractérisation générale des organites, coloration avec nestine, un marqueur progénitrices neurales et TUJ1, un marqueur pan-neuronale, il est recommandé. A titre d'exemples supplémentaires, une coloration immunofluorescente avec phospho-vimentine (p-VIM), qui marque mitotiques apicales des cellules gliales radiales, et Arl13b, pour cil, sont décrits. Pour tester l'apoptose, utilisez le test terminal désoxynucléotidyle transférase (TdT) dUTP Nick-End étiquetage (TUNEL). Placer les lames dans une boîte en plastique pendant les incubations pour les protéger de la poussière, la lumière,et sécher.

1. Décongeler les diapositives pendant 30 min à température ambiante.
2. Laver les lames deux fois avec 200 pl de PBS-glycine (0,225 g de glycine dans du PBS) pendant 3 min pour étancher l'autofluorescence induite par PFA.
3. Perméabiliser les sections avec 200 ul de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween dans une solution de PBS pendant 10 min à température ambiante.
4. Laver les deux fois avec 200 ul de solution PBS-glycine pendant 3 min.
5. les incuber avec 200 ul de 0,5% de gélatine de poisson / 0,1% de Triton X100 dans du PBS pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C pour bloquer la liaison non spécifique d'antigène.
   NOTE: Si un test TUNEL est nécessaire, effectuer l'essai selon le protocole du fabricant. Commencez par le dosage TUNEL avant d'effectuer la immunomarquage, car elle pourrait interférer avec des anticorps secondaires et étancher fluorophores quand il est utilisé par la suite.
6. Diluer les anticorps dans une solution de blocage aux concentrations suivantes: nestine, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01h20; et des anticorps secondaires, 1: 1.000.
7. Incuber avec 200 ul du premier anticorps primaire (par exemple, la nestine) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
8. Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
9. Diluer le premier anticorps secondaire (anti-souris 488) 1: 1000 dans une solution de blocage et incuber la lame dans 200 ul pendant 1-2 h à température ambiante. Désormais, protéger toujours les diapositives de la lumière.
10. Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
11. Incuber avec 200 ul de la prochaine anticorps primaire (par exemple, TUJ1) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
12. Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
13. Ajouter 200 ul de l'anticorps secondaire suivant (anti-lapin 647) pendant 1-2 h à la température ambiante.
14. Laver 3 x 3 min. avec 200 pi de solution de blocage.
15. Ajouter 200 ul de 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une 30 nM Concntration dans du PBS pendant 15 min à température ambiante pour la coloration nucléaire.
16. Laver 2 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage.
17. Laver 1 x 1 min avec 200 pi d'eau distillée et laisser les sections sécher pendant 10-20 min, jusqu'à ce qu'aucune goutte d'eau évidente est plus visible.
18. Monter les sections avec un milieu d'inclusion. les conserver à l'abri de la lumière à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
19. Procéder à une analyse microscopique de l'image d'une vue d'ensemble de la zone organoïde, ventriculaire, la plaque corticale primitive, et d'autres zones d'intérêt.
20. Utiliser un microscope confocal avec les filtres objectifs et fluorescents huile 63X, choisi en fonction des anticorps secondaires marqués par un colorant fluorescents utilisés ^{1, 10.}

Résultats

La génération des organites du cerveau nécessite au moins trois semaines de culture en continu (Figure 1A). Pour obtenir des résultats reproductibles, nous recommandons que le chercheur documente toutes les étapes et, surtout, évite toute modification concernant les composants du milieu, des points de temps, et la manipulation des cellules. Nous donnons ici un résumé de la façon d'évaluer si les étapes critiques sont atteints afin d'obtenir organites d...

Discussion

MCPH est un trouble neurodéveloppemental complexe humain qui ne peut être récapitulé dans des modèles animaux in vivo ou dans un langage simple culture de cellules humaines approche in vitro. La manifestation clinique de MCPH commence à apparaître au cours du premier trimestre, lorsque la neurogenèse précoce commence. Ainsi, organites du cerveau 3D représentent un système expérimental fiable pour modéliser le développement MCPH. De plus, 3D organites du cerveau humain sont une approche id...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers