Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Resumen

Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.

Resumen

La lesión aguda del riñón (LRA) es una condición médica común con una alta tasa de mortalidad. Con las habilidades de reparación del riñón, es posible restaurar la función renal adecuada después del tratamiento de apoyo. Sin embargo, se necesita una mejor comprensión de cómo la muerte y la reparación de las células nefronas ocurren a nivel celular para minimizar la muerte celular y mejorar el proceso regenerativo. El pronefros del pez cebra es un buen sistema modelo para lograr este objetivo porque contiene segmentos anatómicos que son similares al nefrón de mamíferos. Anteriormente, el modelo más común utilizado para estudiar la lesión renal en los peces era el modelo farmacológico de la gentamicina. Sin embargo, este modelo no permite un control espaciotemporal preciso de la lesión, por lo que es difícil estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la reparación renal. Para superar esta limitación, este trabajo presenta un método a través del cual, en contraste con el enfoque de gentamicina, una proteína verde fluorescente específica (GFP) -exEl prensado del segmento nefrón puede ser fotoablado usando una luz láser violeta (405 nm). Este nuevo modelo de AKI proporciona muchas ventajas que otros métodos de lesión epitelial carecen. Sus principales ventajas son la capacidad de "marcar" el nivel de lesión y el control espaciotemporal preciso en el robusto modelo animal in vivo . Este nuevo método tiene el potencial de avanzar significativamente el nivel de comprensión de la lesión renal y los mecanismos de reparación.

Introducción

La lesión aguda del riñón ^{1 , 2} , que también se puede denominar insuficiencia renal aguda, se define ampliamente como una alteración súbita de la función renal ³ . Mientras que el nivel de comprensión de esta condición se ha mejorado notablemente en los últimos años, las tasas de morbilidad y mortalidad se han mantenido altas ^{1 , 2} . El tratamiento actual para esta condición es en su mayoría de apoyo, ya que los resultados de múltiples ensayos clínicos de la terapia de drogas han sido negativos ^{4 , 5} . El riñón es único en que tiene la capacidad de repararse. Por lo tanto, la terapia de apoyo después de un diagnóstico precoz de la IRA es la mejor manera de limitar la morbilidad ⁶ . Sin embargo, es difícil detectar la LRA tempranamente, y la tasa de mortalidad es sorprendente en un 50-80% para aquellos que requieren diálisis ⁵. Con la capacidad de los riñones para repararse y la falta de opciones de tratamiento para esta condición, es importante desarrollar métodos para mejorar este proceso de regeneración de nefrón.

Ha habido muchos modelos diferentes utilizados para la investigación de AKI que incluye diferentes agentes de lesiones y modelos animales. En términos de agentes de daño renal, el aminoglucósido antibiótico gentamicina se ha utilizado como un agente nefrotóxico que conduce a AKI ^{7 , 8} . Sin embargo, varios grupos han encontrado que el tratamiento con gentamicina es letal para el embrión de pez cebra ⁹ . Provoca daños tubulares que son demasiado graves para la recuperación del embrión, haciendo difícil el estudio de la regeneración sin algún tipo de intervención. Los modelos de mamíferos, como el ratón y la rata, también se consideran valiosos, pero se enfrentan a muchas limitaciones durante el estudio de la LRA. Tal vez la principal desventaja de los modelos de roedores es la dificultad en visuaDeterminando así los procesos espaciotemporales precisos que conducen a la muerte y reparación epiteliales.

Johnson et al. Han informado de una técnica basada en la ablación con láser para inducir una lesión renal aguda en el pez cebra embrionario y larval ⁹ . Utilizaron la ablación láser pulsada para dañar el riñón después de una inyección intramuscular con conjugados de dextrano. La fluorescencia de los conjugados dextrano permite la visualización del daño y la regeneración en el epitelio de los túbulos [ ^9] . Este modelo supera las dos limitaciones mencionadas anteriormente, pero no permite niveles graduados de lesión y es difícil de llevar a cabo en grandes grupos de células arbitrarias.

El nuevo modelo basado en la ablación láser de pez cebra de AKI descrito aquí se ocupa de todas las limitaciones anteriores. El riñón proneférico en el pez cebra larvario es un órgano maduro y funcional que contiene segmentos similares a los mamíferos nePhron, incluyendo un glomérulo, túbulos proximal y distal, y un conducto colector ¹⁰ . Las larvas de pez cebra también son ópticamente transparentes, lo que hace factible observar el riñón a través de técnicas de fluorescencia. Por lo tanto, el pez cebra es un valioso modelo in vivo de IRA, y el riñón pronefrico larvario (5-12 días después de la fecundación (dpf)) puede ser usado para estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la lesión renal y la reparación.

Este artículo presenta un método a través del cual los segmentos de nefrona que expresan la Proteína Fluorescente Verde (GFP) específica pueden ser fotoablados usando una luz láser violeta de baja energía (en comparación con un sistema de láser pulsado) (405 nm). La fluorescencia GFP permite la orientación de un grupo de células, haciendo que los cambios que se hacen visibles a través de la observación de GFP photobleaching. Además, la GFP (mediante la absorción de luz violeta) sirve como un sumidero de energía para potenciar la lesión en células renales que expresan GFP. Micros de lapso de tiempoCopia se puede utilizar para estudiar el proceso de reparación. Los estudios han encontrado que la proliferación celular, la migración celular y la metaplasia celular ^{11 , 12 , 13} son procesos potenciales que pueden desempeñar un papel importante en la reparación renal. Sin embargo, la importancia relativa de estos procesos y los detalles de su interacción han sido difíciles de descubrir debido a las limitaciones de los modelos existentes de AKI. Utilizando este nuevo enfoque, fue posible demostrar que la migración celular desempeña un papel central en la reparación renal después de una lesión aguda [ ^14] .

Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Colegio de Medicina de Osteopatía de NYIT Instituto de Cuidado de Animales y Comité de Uso (NYITCOM IACUC). Toda la cirugía y la experimentación in vivo se realizó bajo anestesia con tricaína, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

1. Obtención y mantenimiento de embriones

1. Obtener embriones cruzando el riñón GFP fluorescente pez cebra.
   NOTA: Los ejemplos de líneas transgénicas de pez cebra marcadas fluorescentemente se enumeran en la Tabla 1 .
2. Mantener los embriones a 28,5 ° C en solución de E3 durante las 24 h posteriores a la fecundación.
3. Después de 24 h, sustituir el medio con una solución de E3 que contiene 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU).
   NOTA: La PTU se utiliza porque bloquea los pasos dependientes de la tirosinasa en la melanogénesisY por lo tanto previene la pigmentación. Aquí, esta solución se conoce como E3-PTU.
4. Elevar los embriones fertilizados a 28,5 ° C hasta que son> 6 dpf, momento en el que los riñones han madurado.
   NOTA: Lo mejor es utilizar larvas en la ventana 7-9 dpf.
5. Utilizando un microscopio de disección fluorescente con un aumento de 40X y filtros de emisión de fluorescencia verde, seleccione las larvas con fluorescencia brillante de GFP en el riñón.

2. Montaje del Zebrafish para Live-imaging

1. Si fotoablating los embriones antes de 3 dpf, quitar el chorion de cualquier pez cebra sin sombrear antes de montar el pez cebra para la formación de imágenes.
   1. Manualmente dechorinate con fórceps (preferido) o utilizar un tratamiento químico con una mezcla de proteasa.
      NOTA: Dechorination permite obtener los mejores resultados de imagen.
2. Enjuague los restos de corión en la placa de petri usando la solución E3-PTU y rellene el plato con E3-PTU.
3. PrepaL 1-2% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) con solución de tricaína 0,2 mg / ml para montar el pez cebra para la fotoablación renal y la imagen en vivo.
   1. Si la agarosa LMP ya estaba preparada de antemano, recaliéntela en el microondas para derretirla.
4. Una vez que se prepara la agarosa LMP, coloque una placa de Petri de plástico de 35 mm en un microscopio de disección. Coloque una sonda de vidrio tirado cerca para orientar adecuadamente las larvas anestesiadas.
   NOTA: Es importante hacer este paso de manera oportuna y tener todo en su lugar, porque los embriones deben orientarse antes de que la agarosa se solidifique en aproximadamente 1-3 minutos.
5. Antes de transferir el embrión a la agarosa, asegúrese de que la agarosa esté fría ( es decir , aproximadamente a la temperatura corporal). Utilice una pipeta de transferencia de plástico o vidrio para colocar el embrión en la solución de agarosa-tricaína fundida enfriada.
   NOTA: Esto se hace porque la agarosa que es demasiado caliente puede ser perjudicial para el embrión, lo que lleva a un paro cardiacoO muerte
6. Usando una pipeta de transferencia, vuelva a dibujar el embrión en la solución de agarosa y coloque el embrión / larva en medio de un plato de 35 mm.
7. Esparcir rápidamente la agarosa que contiene el embrión / larva para cubrir uniformemente el fondo del plato de 35 mm; El mejor volumen de agarosa para usar es de ~ 1-1,1 mL.
8. Utilice la sonda de vidrio para orientar el embrión en la mejor posición posible para la fotoablación y la obtención de imágenes.
   NOTA: La película 1 muestra la mejor orientación del embrión / larva para la fotoablación unilateral. Este paso es el más sensible al tiempo y debe realizarse rápidamente antes de que la agarosa comience a gelificarse, ya que cualquier intento de reorientar el pescado después de que comience la gelificación es perjudicial.
   1. Oriente la larva para que el segmento de riñón de interés sea perpendicular a la trayectoria del haz, mientras que el segmento contralateral está alejado del rayo láser (ver Película 1 ).
      NOTA: Esto se puede lograr girando la larva como se muestra en la Película 1 .
9. Deje unos 15 minutos para que la agarosa se solidifique. Cubrir la placa de Petri para minimizar la evaporación. Una vez que la agarosa se ha solidificado, el embrión o larva está listo para la fotoablación.

3. Ablación láser

1. Operar el sistema de imágenes confocal.
   NOTA: Cuando se utiliza la plataforma de imágenes referenciada (ver tabla de materiales), los ajustes recomendados incluyen una ampliación de 40X, una lente de inmersión de 0,8 NA y el primer conjunto de espejo dicroico para permitir la iluminación de 488 y 405 nm de la muestra. La detección debe realizarse en el canal verde.
2. Coloque el plato que contiene el pez cebra inmovilizado en una etapa confocal.
   NOTA: Este procedimiento se optimiza para la configuración vertical usando una lente de inmersión de agua 40-60X. Sin embargo, debería ser posible modificar el procedimiento para un microscopio invertido.
3. En la configuración vertical, coloque la placa de Petri que contiene el embrión en la parte superior de un microscOpe la diapositiva y manténgala en su lugar utilizando arcilla de modelado ( por ejemplo, plastilina). Coloque el portaobjetos de vidrio con la placa de Petri sobre el escenario del microscopio confocal.
4. Añadir 3 ml de la solución de formación de imágenes E3-PTU (ver paso 1.3) con 0,2 mg / ml de tricaína.
   NOTA: La solución de imagen también se puede añadir inmediatamente antes de colocar la diapositiva en el escenario. La adición de la solución de la proyección de imagen se debe hacer muy cuidadosamente para evitar que la agarosa flote de la parte inferior del plato.
5. Cambie a la lente de inmersión de agua (40 o 60X). Levante lentamente la platina, asegurándose de que la lente esté ligeramente inclinada para evitar que el aire quede atrapado en la trayectoria del haz. Una vez que el objetivo toca la solución en un ángulo, el centro de manera que se encuentra en el campo de visión de los embriones.
6. Encuentre el segmento de interés usando la fuente de luz de fluorescencia. Posicione superficialmente la rama dirigida a la lesión para minimizar la dispersión de la luz (vea Película 1 ).
   NOTA: El subsequenT pasos hacen uso de software referenciado (ver la Tabla de Materiales), pero el procedimiento puede ser fácilmente adaptado a otras plataformas.
7. Abra el software. Navegue hasta "Ver" | "Control de Adquisición" | "C2plus Compact GUI" y establecer "tiempo de permanencia de píxeles" a "1,9 μs", "tamaño de marco" a "512 x 512 píxeles" y "tamaño de pinhole" a "90 μm". Ajuste "intensidad láser de 405 nm (o 408 nm en algunos sistemas)" a cero y "intensidad láser 488" a "baja" (preferiblemente <1%). Ajuste la "ganancia" para obtener un buen rango dinámico pero no para saturar la señal.
   NOTA: Estos valores no son críticos y se utilizan para la coherencia. Cuando se utiliza un láser de 405 nm, resultará en aumentos en la fluorescencia GFP. Para evitar la saturación de la señal durante el fotoblanqueo (paso 3.11), el valor de ganancia de la señal debe reducirse en el canal verde. La ganancia de canal azul se puede dejar en cero, ya que no se utiliza para saMpling
8. Haga clic en "Escanear" en la interfaz de software para escanear el riñón usando un láser de 488 nm. Encuentre el segmento de interés que es perpendicular a la trayectoria del haz y que está bien visualizado, con buena fluorescencia GFP. Una vez que esa región ha sido identificada, dibuje una región de interés usando una región de interés (ROI) elíptica.
   1. Navegar hasta "ROI" | "Dibuja ROI elíptico."
      NOTA: Esto se usará para medir continuamente la intensidad promedio de GFP mientras se lleva a cabo el fotoblanqueo, permitiendo la administración de una dosis precisa de tratamiento con láser.
9. Navegue hasta "Ver" | "Controles de adquisición" | "Área de escaneo C2plus" y seleccione "Área de exploración de banda". La máscara rectangular aparecerá dentro de esa interfaz. Defina manualmente una ventana de exploración rectangular con el cursor ( es decir , arrastrar, cambiar el tamaño y girar la máscara) para cubrir el segmento dirigido para la ablación con láser. Haga clic con el botón derecho en elZona de máscara para aceptar la selección.
   NOTA: Sólo se escaneará la región seleccionada.
10. Comience la medición del tiempo mientras monitoriza el canal verde utilizando sólo el láser de 488 nm para activar GFP. Asegúrese de que la intensidad del láser 488 es relativamente baja (~ 1%). Medir la intensidad media de la GFP en la región de interés seleccionando "Measure" | "Medición del tiempo". Utilice las fichas "Gráfico" o "Datos" para supervisar los valores de intensidad media dentro del ROI.
    NOTA: La velocidad de adquisición se define por el tiempo de permanencia de los píxeles y el tamaño de la ventana rectangular establecida en el paso 3.9, pero en general, permite la supervisión rápida de la señal (~ 2-10 cuadros / s).
11. Inducir daño a las células del riñón con el láser violeta (405 nm) aumentando la intensidad al 100% deslizando el control de la "potencia del láser" completamente a la derecha. El láser de 488 nm puede permanecer activo si la intensidad es baja.
    1. Observe una línea gUsando la pestaña "Gráfico" o los valores numéricos de la intensidad GFP usando la pestaña "Datos" y esperar hasta que caiga a un nivel deseado, por ejemplo 50% de la línea base (como se muestra en la Figura 1 ).
       NOTA: Se ha utilizado un láser de 20 mW como parte de la unidad láser referenciada (ver la Tabla de Materiales ); La intensidad máxima puede variar entre los sistemas. Una intensidad más baja puede ser compensada por una exposición más prolongada ( es decir, usando el porcentaje de blanqueo GFP como una medida de la exposición total).
12. Una vez que la intensidad GFP dentro del ROI elíptico (paso 3.8) ha bajado a un nivel deseado, disminuya inmediatamente la intensidad del láser violeta (405 nm) a "0" moviendo el control deslizante de "potencia láser" completamente a la izquierda en El panel de control del software.
    1. Obtener una nueva línea base de fluorescencia GFP. Confirme la ablación obteniendo una relación de X / Y.
       NOTA: Vea la Figura1B; Y = intensidad media antes de la ablación y X = intensidad media después de la ablación, utilizando un promedio de 4 muestras consecutivas dentro del ROI. La proporción objetivo exacta (50%, 60%, etc. ) depende de la cantidad de lesión que se desea para un experimento dado.

4. Microscopía de lapso de tiempo con tinción con yoduro de propidio

1. Aplique consideraciones generales de lapso de tiempo (resumidas en un estudio previo ¹⁵ ) para visualizar la tinción con yoduro de propidio como un correlato de la lesión de células renales después de la fotoablación.
2. Pre-incubar las larvas en 30 μ M solución de yoduro de propidio (1% DMSO en E3-PTU) durante 3 h antes de la incorporación y fotoablación, como se describe en los pasos 2 y 3.7, respectivamente.
   NOTA: No se requiere más yoduro de propidio en la agarosa o en la solución de formación de imágenes.
3. Inducir lesión renal segmentaria, como se describe en los pasos 3.1-3.12.
4. Obtener pilas de imágenes de lapso de tiempo, según descriEn un estudio previo ¹⁴ , utilizando un láser de 488 nm (GFP) y un láser de 461 nm (Propidium Iodide, PI).
   NOTA: Los dos colores se superponen en pilas confocales para correlacionar la desaparición de GFP y la aparición de tinción con yoduro de propidio.
5. Establezca los parámetros para obtener las pilas de imágenes de lapso de tiempo de la siguiente manera: espesor de rebanada virtual = 4 μm, intervalo de pila z = 2 μm, tiempo de permanencia de pixel = 1,9 μs, dimensiones de imagen = 512 x 512 y promediado = 2.
   NOTA: Estos parámetros permiten el registro continuo de intervalos de hasta 10 a 15 minutos de hasta 4 larvas y aseguran que haya un fotoblanqueo mínimo de la muestra.
6. Utilice software de imagen compatible con el formato de archivo de grabación para visualizar y analizar los datos.

Resultados

Tenga en cuenta que este protocolo se utilizó con éxito con un número de líneas transgénicas GFP renal, incluyendo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 y Tg (atp1a1a.4: GFP). Los resultados de ejemplo mostrados aquí se obtuvieron usando la línea sqet11-9 de ET (krt8: EGFP).

La Figura 1 muestra el ejemplo del protocolo de fotoabla- ción. La intensidad media de GFP se monitor...

Discusión

Cabe señalar que la potencia total del láser varía entre sistemas. Sin embargo, el porcentaje de fotoblanqueo GFP permite una lectura de la energía total entregada al riñón fluorescente, independientemente de la variación en la potencia láser y compensada por la duración de la exposición. Tenga en cuenta, sin embargo, que la respuesta de los diferentes tejidos a este método de fotoablación varía. Incluso durante la maduración del riñón, es significativamente más difícil obtener una reducción del 50% e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2