ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

要約

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。

要約

急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。

概要

急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） ^{1,2 は、}腎機能の突然の障害として広く定義されている³ 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いまま^{である 1,2} 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である^4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である⁶ 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。

傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚⁹に対して致命的であることを見出した。それは、胚の回復にはあまりにも深刻な管状の損傷を引き起こし、何らかのタイプの介入なしに再生の研究を困難にする。マウスやラットのような哺乳類のモデルも貴重だと考えられていますが、AKIの研究では多くの制限があります。おそらく、げっ歯類モデルの主な欠点は、視覚障害げっ歯類の腎臓を結紮し、上皮の死および修復に至る正確な時空間的過程を決定する。

Johnson ら胚および幼生のゼブラフィッシュにおいて急性腎障害を誘発するためのレーザーアブレーションベースの技術を報告している⁹ 。彼らは、デキストラン結合体を筋肉内注射した後、腎臓に損傷を与えるためにパルスレーザーアブレーションを使用した。デキストラン結合体からの蛍光は、細管上皮^9の損傷および再生の可視化を可能にする。このモデルは、上記の2つの制限を克服するが、傷害の段階的なレベルを許容せず、大きな、任意の細胞群で実施することは困難である。

ここに記載されているAKIの新しいレーザーアブレーションベースのゼブラフィッシュモデルは、上記のすべての制限に対応しています。幼虫ゼブラフィッシュの前腎臓腎臓は成熟した機能的器官であり、哺乳類のne糸球体、近位および遠位尿細管、および収集ダクト^10を含む 。ゼブラフィッシュの幼虫もまた光学的に透明であり、蛍光技術によって腎臓を観察することが可能になる。したがって、ゼブラフィッシュは、AKIの貴重なインビボモデルであり、幼生期腎臓（受精後5〜12日）は、腎臓傷害および修復に関与する細胞および分子プロセスを研究するために使用することができる。

この論文では、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するネフロンセグメントを、低エネルギー（パルスレーザシステムと比較して）紫色レーザ光（405nm）を用いて光結合させる方法を提示する。 GFP蛍光は、細胞のグループの標的化を可能にし、GFP光退色の観察によって可視化される変化を生じさせる。さらに、GFP（紫色光を吸収することによって）は、GFP発現腎細胞における損傷を増強するエネルギーシンクとして働く。時差マイクロコピーを使用して修復処理を調べることができます。研究により、細胞増殖、細胞移動、および細胞化生^11,12,13がすべて腎臓修復において重要な役割を果たす可能性のあるプロセスであることが判明している。しかし、これらのプロセスの相対的重要性とその相互作用の詳細は、AKIの既存モデルの限界のために明らかにすることは困難でした。この新規アプローチを用いて、急性損傷後の腎臓修復において細胞移動が中心的役割を果たすことを示すことが可能であった¹⁴ 。

プロトコル

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、NYITCOMのOsteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（NYITCOM IACUC）によって承認されました。全ての手術および生体内実験は、トリカイン麻酔下で実施され、苦痛を最小限に抑えるためにすべての努力がなされた。

1.胚の入手と維持

1. 腎臓のGFP蛍光ゼブラフィッシュを横切って胚を得る。
   注：蛍光標識ゼブラフィッシュトランスジェニック系の例を表1に示す 。
2. 受精後24時間にE3溶液に28.5℃で胚を保つ。
3. 24時間後、培地を0.003％1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含有するE3溶液と交換する。
   注：メラニン形成におけるチロシナーゼ依存性のステップをブロックするため、PTUを使用する色素沈着を防止する。ここでは、この解決策をE3-PTUと呼ぶ。
4. 受精した胚を28.5°Cで6 dpf以上になるまで上げます。その時点で腎臓は成熟しています。
   注：7-9 dpfウィンドウでは幼虫を使用することをお勧めします。
5. 40倍の倍率および緑色蛍光発光フィルターで蛍光解剖顕微鏡を使用して、明るい腎臓GFP蛍光を有する幼虫を選択する。

2.ライブイメージングのためのZebrafishのマウント

1. 3 dpfの前に胚を光化する場合、画像化のためにゼブラフィッシュをマウントする前に、孵化していないゼブラフィッシュから絨毛膜を除去する。
   1. 手動で鉗子で脱着（推奨）するか、プロテアーゼ混合物で化学的処理をしてください。
      注記：デコレーションにより、最良のイメージング結果が得られます。
2. E3-PTU溶液を用いてペトリ皿中の絨毛の破片を洗い流し、E3-PTUで皿を補充する。
3. プレパ0.2 mg / mLのトリカイン溶液を含む1-2％低融点（LMP）アガロースでゼブラフィッシュを腎臓光切除およびライブイメージングにマウントします。
   1. 予めLMPアガロースが調製されている場合は、マイクロ波で再加熱して溶解します。
4. LMPアガロースが調製されたら、解剖顕微鏡上に35mmのプラスチックシャーレを置く。麻酔した幼虫を適切に方向付けるために、引っ張ったガラスプローブを近くに置く。
   注：アガロースが約1〜3分で凝固する前に胚を配向させなければならないので、適時にこのステップを行い、すべてを整えることが重要です。
5. 胚をアガロースに移す前に、アガロースが冷えていることを確認してください（体温付近）。プラスチックまたはガラス転移ピペットを使用して、冷却した溶かしたアガロース - トリカイン溶液に胚を入れる。
   注：これは、あまりにも高温のアガロースが胚に有害であり、心停止を引き起こす可能性があるために行われますまたは死
6. トランスファーピペットを使用して、アガロース溶液中の胚を再描画し、胚/幼虫を35mmディッシュの中央に配置する。
7. 胚/幼虫を含むアガロースを迅速に広げ、35mmの皿の底を均一に覆う。使用するアガロースの最善の量は~1.1mLである。
8. ガラスプローブを使用して、胚を光切除および画像化のための最良の位置に向ける。
   注：映画1は、片側光切除のための胚/幼虫の最良の向きを示す。このステップは、最も時間に敏感であり、ゲル化開始後に魚を再指向させる試みは有害であるため、アガロースがゲル化し始める前に迅速に実施されるべきである。
   1. 関心のある腎臓セグメントが、対側の部分がレーザービームから離れている間に、ビーム経路に対して垂直になるように幼虫を向ける（ 映画1参照）。
      注：これはムービー1のように幼虫を回すことで実現できます。
9. アガロースが凝固するのに約15分を要する。ペトリ皿を覆って蒸発を最小限に抑えます。アガロースが凝固すると、胚または幼虫は光切除の準備が整う。

レーザーアブレーション

1. 共焦点イメージングシステムを操作する。
   注記：参照画像プラットフォーム（材料の表を参照）を使用する場合、40倍の倍率、0.8 NA水浸レンズ、およびサンプルの488および405 nm照明の両方を可能にする第1のダイクロイックミラーセットが推奨設定に含まれます。検出はグリーンチャネルで実行する必要があります。
2. 固定化ゼブラフィッシュを含むディッシュを共焦点ステージ上に置く。
   注：この手順は、40〜60倍の水浸レンズを使用した直立構成に最適です。しかしながら、倒立顕微鏡の手順を変更することは可能であるべきである。
3. 直立構成では、胚を含むペトリ皿を顕微鏡の上に配置するモデリングクレイ（ 例えば、プラシーネ）を使用して、その場所にスライドさせて保持してください。ペトリ皿でガラススライドを共焦点顕微鏡のステージ上に置く。
4. 0.2mg / mLのトリカインを用いて3mLのイメージング溶液E3-PTU（工程1.3参照）を加える。
   注：スライドをステージ上に置く直前にイメージングソリューションを追加することもできます。イメージング溶液の添加は、アガロースが皿の底から浮かぶのを防ぐために非常に慎重に行わなければならない。
5. 水浸レンズ（40または60X）に切り替えます。ゆっくりとステージを上げ、空気がビーム経路に閉じ込められないようにレンズがわずかに傾いていることを確認します。レンズがある角度で溶液に触れたら、それが胚の視野に入るように中心に置く。
6. 蛍光光源を使用して目的のセグメントを見つけます。光散乱を最小限に抑えるために、怪我の対象となる支店を表面的に配置します（ 映画1を参照）。
   注：サブシーケンサーtステップでは参照ソフトウェア（表の表を参照）を使用しますが、この手順は他のプラットフォームにも容易に適用できます。
7. ソフトウェアを開きます。 「表示」| "獲得コントロール" | 「C2plus Compact GUI」に設定し、「ピクセル滞留時間」を「1.9μs」、「フレームサイズ」を「512x512ピクセル」、「ピンホールサイズ」を「90μm」に設定します。 「405nm（またはいくつかのシステムでは408nm）レーザー強度」をゼロに、「488レーザー強度」を「低」（好ましくは1％未満）に設定します。良好なダイナミックレンジを得るために「ゲイン」を調整しますが、信号を飽和させないように調整してください。
   注：これらの値は重要ではなく、一貫性のために使用されます。 405 nmレーザーを使用すると、GFP蛍光が増加します。光退色（ステップ3.11）中の信号の飽和を避けるために、信号利得値は緑チャネル上で縮小されるべきである。青色チャネル利得は、saには使用されないので、ゼロのままにすることができますmpling。
8. 488 nmレーザーを使用して腎臓をスキャンするには、ソフトウェアインターフェイスで[スキャン]をクリックします。ビーム経路に垂直で、良好なGFP蛍光を伴ってよく視覚化されている関心のあるセグメントを見つけます。その領域が特定されたら、楕円形のRegion-of-Interest（ROI）を使用して関心領域を描画します。
   1. "ROI"に移動| 「楕円ROIを描く」
      注：これは、光退色が起こっている間に平均GFP強度を連続的に測定するために使用され、正確な線量のレーザー治療の投与を可能にする。
9. 「表示」| "獲得コントロール" | "C2plus Scan Area"を選択し、 "Band Scan Area"を選択します。長方形のマスクがそのインターフェイス内に表示されます。レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーするために、カーソルを使用して長方形のスキャンウィンドウを手動で定義します（ つまり 、マスクのドラッグ、サイズ変更、回転）。右クリックしてマスク領域を使用して選択を受け入れます。
   注記：選択したリージョンのみがスキャンされます。
10. 緑色チャンネルを監視しながら、488 nmレーザーを使用してGFPを起動しながら時間測定を開始します。 488レーザーの強度が比較的低い（〜1％）ことを確認します。 "Measure"を選択することにより、関心領域内のGFPの平均強度を測定する。 「時間測定」 [グラフ]タブまたは[データ]タブを使用して、ROI内の平均強度値を監視します。
    注：取得速度は、ピクセルドウェル時間とステップ3.9で設定された長方形ウィンドウのサイズによって定義されますが、一般的に、信号の高速監視（約2〜10フレーム/秒）が可能です。
11. 「レーザーパワー」コントロールを右端にずらして強度を100％に増やし、バイオレットレーザー（405nm）で腎臓細胞を損傷させます。強度が低い場合、488 nmレーザーはアクティブのままです。
    1. 線gを観察する「グラフ」タブを使用するか、「データ」タブを使用してGFP強度の数値を使用し、所望のレベル、例えばベースラインの50％（ 図1に示す ）まで低下するのを待ちます。
       注記：20mWレーザーは、参照レーザーユニットの一部として使用されています（材料表を参照 ）。最大強度はシステムによって異なることがある。より低い強度は、より長時間の暴露（ すなわち 、総暴露の尺度としてのパーセントGFP漂白を用いる）によって補うことができる。
12. 楕円ROI内のGFP強度（ステップ3.8）が所望のレベルに低下したら、「レーザー出力」スライダを左にずっと移動させることによって、紫色（405nm）レーザの強度を直ちに「0」に減少させるソフトウェアコントロールパネル。
    1. GFP蛍光の新しいベースラインを得る。 X / Yの比を求めることによってアブレーションを確認する。
       注： 図を参照してください図1Bに示す。 Y =アブレーション前の平均強度、X =アブレーション後の平均強度、ROI内の4つの連続サンプルの平均を用いる。正確な標的比率（50％、60％ など ）は、所与の実験に望まれる損傷の量に依存する。

4.ヨウ化プロピジウム染色による経時顕微鏡検査

1. 光分解後の腎細胞傷害の相関として、ヨウ化プロピジウム染色を視覚化するための一般的な時間経過の検討（前の研究^15で概説）を適用する。
2. ステップ2および3.7にそれぞれ記載されているように、埋め込みおよび光切除の前に、30μMヨウ化プロピジウム溶液（E3-PTU中の1％DMSO）中の幼虫を3時間プレインキュベートする。
   注：ヨウ化プロピジウムは、アガロースまたはイメージング溶液には必要ありません。
3. 段階3.1~3.12に記載されているように、部分腎障害を誘発する。
4. 時間経過イメージスタックを取得する488 nmレーザー（GFP）および461 nmレーザー（Propidium Iodide、PI）を使用して、前の研究^14のベッドを使用した。
   注：GFPの消失とヨウ化プロピジウム染色の出現を相関させるために、2色を共焦点スタックに重ねる。
5. 仮想スライス厚さ=4μm、z-スタック間隔=2μm、画素滞留時間=1.9μs、画像寸法= 512x512、および平均= 2のように、タイムラプス画像スタックを得るためのパラメータを設定する。
   注：これらのパラメータは、最大4匹の幼虫の連続的な10〜15分の間隔記録を可能にし、試料の光退色が最小限であることを保証する。
6. 記録ファイル形式と互換性のあるイメージングソフトウェアを使用して、データを視覚化して分析します。

結果

このプロトコルはET（krt8：EGFP）sqet11-9、ET（krt8：EGFP）sqet33-d10、およびTg（atp1a1a.4：GFP）を含む多くの腎臓GFPトランスジェニック系統でうまく使用されたことに注意してください。ここに示されている例の結果は、ET（krt8：EGFP）sqet11-9系統を用いて得られた。

図1は、光切断プロトコルの例を示す。?...

ディスカッション

全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2