Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

요약

이 작품은 신장 GFP 유전자 변형 제브라 피쉬를 사용하여 부분적인 신장 손상의 새로운 생체 내 모델을 제시합니다. 이 모델은 신장 상피 세포의 표적 절제를 유도하여 네프론 손상 및 수리의 세포 기작을 보여줍니다.

초록

급성 신부전 (AKI)은 사망률이 높은 일반적인 의학적 증상입니다. 신장의 수선 능력을 통해지지 치료 후 적절한 신장 기능을 회복시키는 것이 가능합니다. 그러나 세포 죽음을 최소화하고 재생 과정을 향상시키기 위해서는 세포 수준에서 네프론 세포의 죽음과 복구가 어떻게 발생하는지 더 잘 이해해야합니다. zebrafish pronephros는 포유류 네프론과 유사한 해부학 적 세그먼트를 포함하기 때문에이 목표를 달성하는 데 적합한 모델 시스템입니다. 이전에 물고기에서 신장 손상을 연구하는 데 사용 된 가장 일반적인 모델은 약리학 적 겐타 마이신 (gentamicin) 모델이었습니다. 그러나이 모델은 손상의 정확한 시공간 조절을 허용하지 않으므로 신장 수리와 관련된 세포 및 분자 과정을 연구하기가 어렵습니다. 이 한계를 극복하기 위해이 연구는 겐타 마이신 접근법과 달리 특정 녹색 형광 단백질 (Green Fuorescent Protein, GFP) -ex네오 프론 세그먼트를 누르는 것은 보라색 레이저 빛 (405 nm)을 사용하여 광 비화 될 수 있습니다. 이 AKI의 새로운 모델은 다른 상피 손상 방법이없는 많은 이점을 제공합니다. 주요 이점은 강력한 생체 내 동물 모델 에서 부상 수준과 정확한 시공간 조절을 "다이얼"할 수있는 능력입니다. 이 새로운 방법은 신장 손상 및 복구 메커니즘에 대한 이해 수준을 크게 높일 수있는 가능성이 있습니다.

서문

급성 신부전으로도 불릴 수있는 급성 신부전 (AKI) ^{1 , 2} 는 신장 기능의 급격한 손상으로 정의됩니다 ³ . 이 상태에 대한 이해 수준은 수년에 걸쳐 현저하게 향상되었지만, 이환율과 사망률은 여전히 ^{1 , 2로} 높습니다. 약물 치료의 여러 임상 시험의 결과가 음성 인 ^{4,5 인 경우,} 이 상태에 대한 현재 치료법은 대부분지지 적입니다. 신장은 스스로 회복 할 수있는 능력이 있다는 점에서 독특합니다. 따라서 AKI의 조기 진단 후지지 치료가 이환율을 제한하는 최선의 방법입니다 ⁶ . 그러나 AKI를 조기에 발견하기는 어렵고 투석을 필요로하는 환자의 경우 사망률이 50 ~ 80 %. 신장이 스스로 회복 할 수있는 능력과이 상태에 대한 치료 옵션이 없기 때문에이 nephron 재생 과정을 향상시키는 방법을 개발하는 것이 중요합니다.

부상과 동물 모델의 다른 에이전트를 포함 AKI 연구에 사용되는 많은 다른 모델이있었습니다. 신장 손상 제제 측면에서 aminoglycoside 항생제 겐타 마이신 (gentamicin)은 신 독성 제제로 사용되어 AKI ^7,8 로 이어진다. 그러나 몇몇 연구팀은 겐타 마이신 치료가 제브라 피쉬 배아에게 치명적이라는 사실을 발견했다. 그것은 배아 회복을 위해 너무 심각한 관상 손상을 일으키므로 어떤 유형의 개입없이 재생 연구를 어렵게 만듭니다. 포유류 모델은 마우스 나 쥐와 마찬가지로 귀중한 것으로 여겨지지만 AKI 연구 중에는 많은 한계가 있습니다. 아마도 설치류 모델의 주된 단점은 visua에서의 어려움이다설치류 신장을 lizing하고 따라서 상피 사망 및 수리로 이어지는 정확한 spatiotemporal 과정을 결정합니다.

Johnson et al. 배아 및 애벌레 제브라 피쉬 ⁹ 에서 급성 신장 손상을 유도하는 레이저 절제 기법을 발표했다. 그들은 펄스 레이저 절제를 사용하여 덱스 트란 접합체를 근육 주사 한 후 신장을 손상시켰다. dextran conjugates의 형광은 세뇨관 상피의 손상과 재생을 시각화합니다. 이 모델은 위에서 언급 한 두 가지 한계를 극복하지만, 등급이 매겨진 부상을 허용하지 않으며 대규모의 임의 세포 그룹에서 수행하기가 어렵습니다.

여기에 설명 된 AKI의 새로운 레이저 절제 기반 zebrafish 모델은 위의 모든 제한 사항을 해결합니다. 애벌레 제브라 피쉬 (zebrafish)의 전신성 신장은 성숙한 기능성 기관으로 포유류의 nephomer는 사구체, 근위 및 원위 tubules, 그리고 수집 덕트 ¹⁰ . Zebrafish 유충도 광학적으로 투명하여 형광 기술을 통해 신장을 관찰 할 수 있습니다. 따라서, 제브라 피쉬는 AKI의 귀중한 생체 내 모델이고, 유생 숙주 신장 (5-12 일 - 수정 후 (dpf))은 신장 손상 및 수리에 관련된 세포 및 분자 과정을 연구하는데 사용될 수있다.

이 백서에서는 특정 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현 네프론 세그먼트를 저에너지 (펄스 레이저 시스템과 비교)의 보라색 레이저 빛 (405 nm)을 사용하여 광 접합 할 수있는 방법을 제시합니다. GFP 형광은 세포 그룹의 표적화를 허용하여 GFP 광 표백 (photobleaching) 관찰을 통해 가시적 인 변화를 일으킨다. 또한, GFP (보라 빛을 흡수함으로써)는 GFP- 발현 신장 세포에서 상해를 강화시키는 에너지 싱크 (sink)로서 작용한다. 저속 마이크로복사본을 사용하여 복구 프로세스를 연구 할 수 있습니다. 연구에 따르면 세포 증식, 세포 이동 및 세포 상피화가 모두 11,12,13에서 신장 복구에 중요한 역할을하는 잠재적 인 과정임을 발견했습니다. 그러나 이러한 프로세스의 상대적 중요성과 상호 작용의 세부 사항은 기존 AKI 모델의 한계로 인해 밝혀 내기가 어려웠습니다. 이 새로운 접근법을 사용하여 급성 손상 후 신장 이식에서 세포 이식이 중심 역할을한다는 것을 입증 할 수 있었다.

프로토콜

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험실 동물의 관리와 사용에 관한 가이드의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 정형 외과 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (NYITCOM IACUC)의 NYIT 대학에서 승인되었습니다. 모든 수술과 생체 내 실험은 트리 케인 마취하에 수행되었으며 고통을 최소화하기위한 모든 노력이 이루어졌습니다.

1. 배아 확보 및 유지

1. 신장 GFP 형광 zebrafish를 교차하여 배아를 얻을 수 있습니다.
   참고 : 형광으로 표지 된 제브라 피쉬 트랜스 제닉 라인의 예가 표 1 에 나와 있습니다.
2. 수정 후 24 시간 동안 E3 솔루션에 28.5 ° C에서 배아를 유지.
3. 24 시간 후, 배지를 0.003 % 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)를 함유하는 E3 용액으로 대체한다.
   참고 : 멜라닌 생성에서 티로시나제 의존성 단계를 차단하기 때문에 PTU가 사용됩니다.따라서 색소 침착을 방지합니다. 여기서,이 솔루션은 E3-PTU라고합니다.
4. 수정 된 배아를 28.5 ° C에서 6> dpf가 될 때까지 높이십시오. 그 시점에서 신장이 성숙합니다.
   참고 : 7-9 dpf 창에서 유충을 사용하는 것이 가장 좋습니다.
5. 40X 배율 및 녹색 형광 방출 필터에서 형광 해부 현미경을 사용하여 밝은 신장 GFP 형광과 유충을 선택합니다.

2. 라이브 이미징을위한 Zebrafish 장착

1. 3 dpf 전에 배아를 photoablating 경우 이미징을 위해 zebrafish를 장착하기 전에 unhatch zebrafish에서 chorion을 제거하십시오.
   1. 포 셉 (수동)으로 수동으로 dechorinate하거나 프로 테아 제 혼합물과 화학 처리를 사용하십시오.
      참고 : Dechorination을 사용하면 최상의 이미징 결과를 얻을 수 있습니다.
2. E3 - PTU 솔루션을 사용하여 페트리 접시에 chorion 파편을 씻어 내고 E3 - PTU와 접시를 다시 채 웁니다.
3. 준비신장 광 조사 및 라이브 영상을 위해 제브라 피쉬를 장착하기 위해 0.2 mg / mL 트리 센 (tricaine) 용액으로 1 ~ 2 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스를 첨가하십시오.
   1. LMP 아가로 오스가 미리 준비된 경우 전자 레인지에서 다시 가열하여 녹여야합니다.
4. 일단 LMP 아가로 오스가 준비되면, 해부 현미경에 35mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. 마취 된 유충을 적절하게 방향을 잡아 당기기 위해 유리 프로브를 가까이에 두십시오.
   참고 : 적시에이 단계를 수행하고 아가로 오스가 약 1-3 분 안에 응고되기 전에 배아가 지향되어야하기 때문에 모든 것을 제자리에 두는 것이 중요합니다.
5. 배아를 아가로 오스로 옮기기 전에 아가로 오스가 차갑다는 것을 확인하십시오 ( 즉 체온 근처). 플라스틱 또는 유리 전송 피펫을 사용하여 냉각 된 용융 된 아가로 오스 - 트리 카인 용액에 배아를 놓습니다.
   참고 : 이것은 너무 고온 인 아가로 오스가 배아에 유해하여 심장 마비를 일으킬 수 있기 때문에 이루어집니다또는 죽음
6. 전송 피펫을 사용하여, 아가로 오스 솔루션에 배아를 다시 그리다 및 35mm 접시의 중간에 배아 / 유충을 위치.
7. 배아 / 유충이 들어있는 아가로 오스를 빠르게 펼쳐 35mm 접시 바닥을 고르게 덮으십시오. 사용하기에 가장 적합한 아가로 오스의 양은 ~ 1-1.1 mL입니다.
8. 유리 프로브를 사용하여 광 배양 및 이미징을위한 최상의 위치에 배아를 배향하십시오.
   참고 : 영화 1은 일방적 인 광 절제술을위한 배아 / 유충의 최상의 방향을 보여줍니다. 이 단계는 가장 시간에 민감하며 겔화가 시작된 후에 물고기의 방향을 바꾸려는 모든 시도가 해롭기 때문에 아가로 오스가 젤을 만들기 전에 신속하게 수행되어야합니다.
   1. 반대쪽 부분이 레이저 광선에서 멀리 떨어져있는 동안 관심있는 신장 부분이 광선 경로에 수직이되도록 애벌레를 배향하십시오 ( 영화 1 참조).
      참고 : 이것은 영화 1 과 같이 애벌레를 돌리면 얻을 수 있습니다.
9. 아가로 오스가 응고 될 때까지 약 15 분을 허용하십시오. 증발을 최소화하기 위해 페트리 접시를 덮으십시오. 아가로 오스가 고형화되면, 배아 또는 유충은 광 절제를 위해 준비됩니다.

3. 레이저 절제

1. 공 촛점 이미징 시스템을 작동하십시오.
   참고 : 참조 된 이미징 플랫폼 (재료 표 참조)을 사용할 때 권장 설정에는 40X 배율, 0.8 NA 물 디핑 렌즈 및 샘플의 488 및 405 nm 조명을 허용하는 첫 번째 이색 성 거울이 포함됩니다. 감지는 녹색 채널에서 수행되어야합니다.
2. 공 촛점 무대에 고정 zebrafish를 포함하는 접시를 놓습니다.
   참고 :이 절차는 40-60X 물 디핑 렌즈를 사용하는 직립형 구성에 최적화되어 있습니다. 그러나, 그것은 거꾸로 현미경에 대한 절차를 수정할 수 있어야합니다.
3. 똑바로 구성, 배아를 포함하는 페트리 접시를 현미경 상단에 위치ope 슬라이드하고 모델링 점토 ( 예 : plasticine)를 사용하여 제 위치에 유지하십시오. 유리 슬라이드를 페트리 접시와 함께 공 촛점 현미경의 무대에 놓습니다.
4. 0.2 MG / ML tricaine와 이미징 솔루션 E3-PTU (1.3 단계 참조) 3 ML을 추가합니다.
   참고 : 슬라이드를 스테이지에 올려 놓기 직전에 이미징 솔루션을 추가 할 수도 있습니다. 이미징 솔루션의 추가는 아가로 오스가 접시의 바닥에서 떠 다니는 것을 방지하기 위해 매우 조심스럽게 수행되어야합니다.
5. 물 담금 렌즈 (40 또는 60X)로 전환합니다. 천천히 스테이지를 들어 올려 공기가 빔 경로에 갇히지 않도록 렌즈가 약간 각이 지도록하십시오. 렌즈가 일정 각도로 용액에 닿으면 배아의 시야에 있도록 중심에 놓습니다.
6. 형광 광원을 사용하여 관심 세그먼트를 찾습니다. 부상을 입을 지점을 피상적으로 배치하여 광산란을 최소화하십시오 ( 영화 1 참조).
   참고 : 하위 시퀀스t 단계는 참조 된 소프트웨어를 사용하지만 (Table of Materials 참조) 절차는 다른 플랫폼에 쉽게 적용될 수 있습니다.
7. 소프트웨어를 엽니 다. "보기"| "수집 제어"| "C2plus Compact GUI"로 설정하고 "픽셀 드웰 시간"을 "1.9 μs", "프레임 크기"를 "512 x 512 픽셀", "핀홀 크기"를 "90 μm"로 설정합니다. "405 nm (또는 일부 시스템에서는 408 nm)의 레이저 강도"를 0으로 설정하고 "488 레이저 강도"를 "낮음"(바람직하게는 <1 %)으로 설정하십시오. 좋은 다이나믹 레인지를 얻기 위해 "게인"을 조절 하나 신호를 포화시키지 마십시오.
   참고 :이 값은 중요하지 않으며 일관성을 위해 사용됩니다. 405 nm 레이저를 사용하면 GFP 형광이 증가합니다. Photobleaching (단계 3.11) 중에 신호의 채도를 피하려면 신호 이득 값을 녹색 채널에서 축소해야합니다. 블루 채널 게인은 sa에 사용되지 않으므로 0으로 남겨 둘 수 있습니다.mpling.
8. 488 nm 레이저를 사용하여 신장을 검사하려면 소프트웨어 인터페이스에서 "스캔"을 클릭하십시오. 빔 경로에 수직이며 좋은 GFP 형광과 잘 시각화 세그먼트의 관심을 찾으십시오. 해당 영역이 식별되면 타원형 ROI (Region of Interest)를 사용하여 관심 영역을 그립니다.
   1. "ROI"로 이동 | "타원형 ROI 그리기."
      참고 : 이것은 photobleaching이 발생하는 동안 평균 GFP 강도를 지속적으로 측정하는 데 사용되어 정확한 레이저 치료를 허용합니다.
9. "보기"| "수집 제어"| "C2plus 스캔 영역"을 선택하고 "밴드 스캔 영역"을 선택하십시오. 직사각형 마스크가 해당 인터페이스 내에 나타납니다. 커서를 사용하여 직사각형 스캔 창을 수동으로 정의 ( 즉 , 마스크 드래그, 크기 조정 및 회전)하여 레이저 절삭 대상 세그먼트를 덮습니다. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭마스크 영역을 선택합니다.
   참고 : 선택한 영역 만 스캔됩니다.
10. G8을 활성화하기 위해 488 nm 레이저만을 사용하여 녹색 채널을 모니터링하면서 시간 측정을 시작하십시오. 488 레이저의 강도가 상대적으로 낮아야합니다 (~ 1 %). "Measure"를 선택하여 관심 영역의 GFP 평균 강도를 측정하십시오. "시간 측정." "그래프"또는 "데이터"탭을 사용하여 ROI 내의 평균 강도 값을 모니터링하십시오.
    참고 : 획득 속도는 픽셀 드웰 시간과 단계 3.9에서 설정된 직사각형 창의 크기로 정의되지만 일반적으로 신호를 빠르게 모니터링 할 수 있습니다 (~ 2-10 프레임 / 초).
11. 오른쪽으로 "레이저 파워"컨트롤을 밀어서 100 %로 강도를 증가시켜 바이올렛 레이저 (405nm)로 신장 세포 손상을 유도하십시오. 강도가 낮 으면 488 nm 레이저는 활성 상태를 유지할 수 있습니다.
    1. 선 g 관찰"그래프"탭 또는 "데이터"탭을 사용하여 GFP 강도의 수치를 사용하여 원하는 수준 (예 : 기준선의 50 %)으로 떨어질 때까지 기다리십시오 ( 그림 1 참조).
       참고 : 20mW 레이저는 참조 레이저 장치의 일부로 사용되었습니다 ( 재료 표 참조). 최대 강도는 시스템마다 다를 수 있습니다. 더 낮은 강도는 더 긴 노출 ( 즉, GFP 블리 칭 백분율을 총 노출의 척도로 사용)에 의해 보상 될 수 있습니다.
12. 타원형 ROI (3.8 단계) 내의 GFP 강도가 원하는 수준으로 떨어지면 "레이저 파워"슬라이더를 왼쪽으로 끝까지 이동하여 보라색 (405nm) 레이저의 강도를 즉시 "0"으로 낮 춥니 다. 소프트웨어 제어판
    1. GFP 형광의 새로운 기준선을 얻습니다. X / Y의 비율을 구함으로써 절제를 확인하십시오.
       참고 : 그림 참조1B; Y = 절제 전의 평균 강도 및 X = 절개 후의 평균 강도로 ROI 내에서 평균 4 개의 샘플을 사용합니다. 정확한 목표 비율 (50 %, 60 % 등 )은 주어진 실험에 대해 원하는 상해의 양에 따라 다릅니다.

4. Propidium Iodide Staining을 이용한 저속 현미경

1. photoablation 후 신장 세포 손상의 상관 관계로 propidium iodide 염색을 시각화하기 위해 일반적인 시간 경과 고려 사항 (이전 연구 ¹⁵ 에서 간략히 설명)을 적용합니다.
2. 단계 2와 3.7에 각각 설명 된대로, 삽입 및 광 절제 전에 각각 3 시간 동안 30 μM 요오드화 프로피 딤 용액 (E3-PTU 중의 1 % DMSO)에서 상기 유충을 사전 배양한다.
   참고 : 아가로 오스 나 이미징 용액에는 추가로 propidium iodide가 필요하지 않습니다.
3. 단계 3.1-3.12에서 설명한대로 분절 신장 손상을 유도하십시오.
4. 시간 경과 이미지 스택 얻기, 설명488 nm 레이저 (GFP)와 461 nm 레이저 (Propidium Iodide, PI)를 사용하여 이전의 연구 ¹⁴ 에서 연구되었다.
   참고 : 두 색상은 GFP의 소멸과 propidium 요오드화물 얼룩의 모양을 연관시키기 위해 공 촛점 스택에 겹쳐 있습니다.
5. 가상 슬라이스 두께 = 4 μm, z- 스택 간격 = 2 μm, 픽셀 드웰 시간 = 1.9 μs, 이미지 크기 = 512 x 512 및 평균 = 2와 같이 시간 경과 이미지 스택을 얻기위한 매개 변수를 설정하십시오.
   참고 :이 매개 변수는 최대 4 개의 유충을 연속적으로 10 분에서 15 분 간격으로 기록하고 시료의 광 변색을 최소화합니다.
6. 기록 파일 형식과 호환되는 이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각화하고 분석하십시오.

결과

이 프로토콜은 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9, ET (krt8 : EGFP) sqet33-d10 및 Tg (atp1a1a.4 : GFP)를 비롯한 많은 신장 GFP 트랜스 제닉 라인에서 성공적으로 사용되었음을 유의하십시오. 여기에 표시된 결과는 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9 행을 사용하여 얻은 결과입니다.

그림 1 은 광 절제 프로토콜의 예를 보여줍니다. 평균 GFP 강도는...

토론

전체 레이저 출력은 시스템마다 다릅니다. 그러나 % GFP 광 표백을 사용하면 레이저 출력의 변화와 관계없이 형광 신장에 전달 된 총 에너지를 판독 할 수 있고 노출 시간으로 보정 할 수 있습니다. 그러나이 방법에 대한 다른 조직의 반응은 다양합니다. 신장이 성숙하는 동안에도 성숙한 유충보다 젊은 배아에서 GFP 형광을 50 % 감소시키는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 이 프로토콜을 수정하고 다른 응...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2