Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Özet

Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.

Özet

Akut Böbrek Hasarı (AKI), mortalite oranının yüksek olduğu ortak bir tıbbi durumdur. Böbreğin onarım yetenekleri ile, destekleyici tedaviden sonra yeterli böbrek fonksiyonunun sağlanması mümkündür. Bununla birlikte, nefron hücresi ölümünün ve onarımının hücre düzeyinde nasıl gerçekleştiğinin daha iyi anlaşılması, hücre ölümünü en aza indirgemek ve rejeneratif işlemi arttırmak için gereklidir. Zebrafish pronephros, memeli nefronuna benzer anatomik bölümler içerdiğinden, bu amaca ulaşmak için iyi bir model sistemdir. Daha önce, balıkta böbrek hasarını incelemek için kullanılan en yaygın model, farmakolojik gentamisin modeli idi. Bununla birlikte, bu model yaralanmanın spesifik zamansal olmayan kontrolüne izin vermemektedir ve böylelikle böbrek onarımı ile ilgili hücresel ve moleküler işlemleri incelemek zordur. Bu kısıtlılığın üstesinden gelmek için, bu çalışma, gentamisin yaklaşımının tersine, belirli bir Yeşil Fuoresent Protein (GFP) -ex'inNefron kesimi, mor bir lazer ışığı (405 nm) ile fotoablat edilebilir. AKI'nın bu yeni modeli, diğer epitelyal yaralanma yöntemlerinin eksik olduğu birçok avantaj sağlar. Başlıca avantajları, in vivo canlı hayvan modelinde, yaralanma seviyesini "aramak" ve spatio-temporal kontrolün doğru olmasıdır. Bu yeni yöntem, böbrek hasarının ve onarım mekanizmalarının anlaşılma düzeyini önemli ölçüde ilerletme potansiyeline sahiptir.

Giriş

Akut Böbrek Hasarı (AKI) ^{1 , 2} , aynı zamanda akut böbrek yetmezliği olarak da adlandırılabilir, böbrek fonksiyonunda ani bir bozukluk olarak tanımlanır ³ . Bu durumun anlaşılma düzeyi yıllar içinde kayda değer ölçüde gelişme gösterirken, morbidite ve mortalite oranları ^{1 , 2 gibi} yüksek kalmıştır. İlaç tedavisinin çoklu klinik çalışmalarından elde edilen sonuçlar negatif ^{4 , 5} olduğu için, bu durum için mevcut tedavi çoğunlukla destekleyici niteliktedir. Böbrek kendine tamir etme kabiliyeti açısından eşsizdir. Bu nedenle, AKI'nın erken tanısından sonra destekleyici tedavi morbiditeyi sınırlamanın en iyi yoludur ⁶ . Bununla birlikte, AKI'nın erken tespit edilmesi zordur ve mortalite oranı diyaliz gerektirenler için% 50-80 arasında inanılmaz derecede yüksektir ⁵. Böbreklerin kendini onarma becerisi ve bu durum için tedavi seçenekleri bulunmaması nedeniyle, bu nefron rejenerasyon sürecini zenginleştirmek için yöntemler geliştirmek önemlidir.

Farklı yaralanma ve hayvan modelleri içeren AKI araştırması için kullanılan birçok farklı model olmuştur. Böbrek hasarı ajanları açısından, aminoglikozid antibiyotik gentamisin nefrotoksik bir madde olarak kullanılır ve bu da AKI 7,8'e yol açar. Bununla birlikte, birkaç grup gentamisin tedavisinin zebra balığı embriyo ⁹ için ölümcül olduğunu buldu. Embriyo iyileşmesi için çok ciddi boru hasarına neden olur, böylece bir yenilenme türü olmaksızın yenileme çalışmasını zorlaştırır. Fare ve fare gibi memeli modelleri de değerli sayılır, ancak AKI çalışması sırasında birçok sınırlama ile karşı karşıya kalırlar. Belki de kemirgen modellerin en büyük dezavantajı visua'daki zorlukturKemirgen böbreğini hafifletir ve böylece epitel ölümüne ve onarımına yol açan spatio-temporal süreçleri belirler.

Johnson ve ark. Embriyonik ve larval zebrafish ⁹ akut böbrek hasarını indüklemek için bir lazer ablasman tabanlı teknik bildirdiniz. Dekstran konjügatları ile intramusküler bir enjeksiyon sonrasında böbrek hasarına pulsed lazer ablasyon uyguluyorlardı. Dekstran konjügatlarından gelen flüoresans, tübül epitelinde hasarın ve rejenerasyonun görselleştirilmesine izin verir ⁹ . Bu model, yukarıda bahsedilen iki sınırlamanın üstesinden gelmekle birlikte, dereceli yaralanmalara izin vermez ve büyük, keyfi hücre gruplarında gerçekleştirmek zordur.

Burada açıklanan yeni lazer ablasyon tabanlı zebrafish modeli, yukarıdaki tüm sınırlamaları ele almaktadır. Larval zebra biflinde pronefrik böbrek, memeli hayvanlara benzer kesimler içeren olgun, işleyen bir organtır.Bir glomerulus, proksimal ve distal tübüller ve bir toplama kanalı ^{10 dahil olmak} üzere phron. Zebra balığı larva da optik olarak şeffaftır, böylelikle flüoresan teknikleri ile böbrek gözlemlenebilir. Dolayısıyla, zebra balığı, AKI'nın in vivo bir değerli modelidir ve böbrek hasarına ve onarımına katılan hücresel ve moleküler işlemleri incelemek için larval pronefrik böbrek (5-12 gün-dölleme sonrası (dpf)) kullanılabilir.

Bu makale, belirli Green Floresan Protein (GFP) ifade eden nefron bölümlerinin, düşük enerjili (darbeli bir lazer sistemi ile karşılaştırıldığında) mor renkli lazer ışığını (405 nm) kullanarak fotoablat edebildiği bir yöntem sunmaktadır. GFP floresansı, bir grup hücrenin hedeflenmesini sağlar; bu da, GFP photobleaching gözlemiyle görünür olan değişiklikleri yapar. Ek olarak, GFP (mor ışığı absorbe ederek), GFP ifade eden böbrek hücrelerindeki yaralanmayı güçlendiren bir enerji havuzu olarak görev yapmaktadır. Zaman atlamalı mikrolerOnarım işlemini incelemek için kopya kullanılabilir. Çalışmalar, hücre çoğalması, hücre göçü ve hücre metaplazisinin ^{11 , 12 , 13'ün} hepsinin böbrek tamirinde önemli bir rol oynayabilecek potansiyel süreç olduğunu bulmuştur. Bununla birlikte, mevcut AKI modellerinin sınırlamaları nedeniyle, bu süreçlerin nispi önemi ve etkileşimlerinin ayrıntılarının ortaya çıkması zor olmuştur. Bu yeni yaklaşımı kullanarak akut hasardan sonra böbrek tamirinde hücre göçünün merkezi bir rol oynadığını göstermek mümkün oldu ¹⁴ .

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, NYIT Osteopatik Tıp Kurumu Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (NYITCOM IACUC) tarafından onaylandı. Tüm cerrahi ve in vivo deneyler tricaine anestezi altında yapıldı ve acı en aza indirmek için tüm çaba gösterildi.

1. Embriyoların Elde Edilmesi ve Bakımı

1. Böbrek GFP floresan zebrabalığı geçerek embriyolar elde edin.
   Not: Floresan etiketli zebra balığı transgenik hatlarının örnekleri Tablo 1'de listelenmiştir.
2. Döllenmeden 24 saat sonra embriyoları E3 çözeltisinde 28.5 ° C'de tutun.
3. 24 saat sonra ortamı% 0.003 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren bir E3 çözeltisi ile değiştirin.
   NOT: PTU kullanılır, çünkü melanogenezdeki tirozinaza bağlı adımları bloke ederVe dolayısıyla pigmentlemeyi önler. Burada, bu çözüm E3-PTU olarak anılır.
4. Döllenmiş embriyoları,> 6 dpf olana kadar 28.5 ° C'de kaldırın, bu noktada böbrekler olgunlaştı.
   NOT: 7-9 dpf penceresinde larva kullanmak en iyisidir.
5. 40X büyütme ve yeşil floresan emisyon filtrelerinde floresan bir diseksiyon mikroskopu kullanarak, parlak böbrek GFP floresanslı larvaları seçin.

2. Canlı görüntüleme için Zebra bağı montajı

1. Embriyoları 3 dpf'den önce fotoablat ediyorsanız, görüntü için zebrafish'i takmadan önce porsiyonu herhangi bir hamurlanmamış zebrafish'ten çıkarın.
   1. Forseps ile elle dechorinate (tercih edilir) veya bir proteaz karışımı ile kimyasal bir işlem kullanın.
      NOT: Dechorination en iyi görüntüleme sonuçlarını sağlar.
2. E3-PTU solüsyonunu kullanarak petri kabındaki porsiyon pisliğini durulayın ve çanağı E3-PTU ile tekrar doldurun.
3. PrepaYeniden% 1-2 Düşük Erime Noktası (LMP) agarozu, 0.2 mg / mL tricaine solüsyonu ile zebrafish'i böbrek fotoablaksiyonu ve canlı görüntüleme için monte edin.
   1. LMP agaroz önceden hazırlanmışsa, eritmek için mikrodalga fırında yeniden ısıtın.
4. LMP agaroz hazırlandıktan sonra, bir diseksiyon mikroskop 35 mm plastik petri kabı yerleştirin. Anestezi uygulanmış larvaları düzgün şekilde yönlendirmek için çekilmiş bir cam probu yerleştirin.
   NOT: Bu adımı zamanında yapmak ve her şeyi yerine getirmek önemlidir çünkü agaroz yaklaşık 1-3 dakika içinde katılaşmadan önce yönlendirilmelidir.
5. Embriyonun agaroza aktarılmasından önce, agarozun serin olduğundan ( örn . Vücut sıcaklığının yaklaşık olduğu) emin olun. Embriyo soğutulmuş eritilmiş agaroz-tricaine çözeltisine yerleştirmek için bir plastik veya cam transfer pipeti kullanın.
   NOT: Bu, çok sıcak olan agarozun embriyoya zararlı olabileceği, çünkü kardiyak arreste yol açtığı için yapılır.Veya ölüm
6. Bir transfer pipet kullanarak, agaroz çözüm embriyo yeniden çizin ve embriyo / larva 35 mm çanağın ortasında konumlandırın.
7. 35 mm çanağın tabanını eşit olarak örtmek için embriyo / larva içeren agarozu hızla yaymak; Agarozun en iyi hacmi ~ 1-1.1 mL'dir.
8. Embriyonun foto-ablaj ve görüntüleme için mümkün olan en iyi konuma yönlendirilmesi için cam probu kullanın.
   NOT: Film 1, tek taraflı fotoablasyon için embriyo / larva'nın en iyi yönlendirmesini gösterir. Bu adım en çok zamana duyarlıdır ve agaroz jöle başlamadan önce çabucak yapılmalıdır, çünkü jöleleme başladıktan sonra balıkların yönünü değiştirmek için herhangi bir girişim zararlıdır.
   1. Karşı taraf segment lazer ışınından uzakta iken, ilgi çeken böbrek segmenti ışın yoluna dik olacak şekilde larvaları yönlendirin (bkz. Film 1 ).
      NOT: Bu, larvaları Film 1'de gösterildiği gibi çevirerek elde edilebilir.
9. Agarozun katılaşması için yaklaşık 15 dakika bekleyin. Buharlaşmayı en aza indirgemek için petri kabını örtün. Agaroz katılaştıktan sonra embriyo veya larva fotoablasyona hazırdır.

3. Lazer Ablasyon

1. Konfokal görüntüleme sistemini çalıştırın.
   NOT: Referans görüntüleme platformunu kullanırken (materyal tablosuna bakın), 40X büyütme, 0.8 NA su daldırma lensi ve ilk dikroik ayna hem numunenin hem 488 hem de 405 nm aydınlatmasına izin vermek için ayarlanır. Algılama yeşil kanal üzerinde gerçekleştirilmelidir.
2. Hareketsizleştirilmiş zebra balığı içeren çanağı konfokal bir aşamaya yerleştirin.
   NOT: Bu prosedür, 40-60X su daldırma lensi kullanarak dikey konfigürasyon için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, ters çevrilmiş mikroskop için prosedürü değiştirmek mümkün olmalıdır.
3. Dik konfigürasyonda, embriyo içeren petri kabını bir mikroskobunun üzerine yerleştirinKaymayı önleyin ve modelleme kili ( ör. Plastik bez) kullanarak yerine tutun. Koniokal mikroskop sahnesine petri ile cam slayt konumlandırın.
4. 0.2 mg / mL tricaine ile 3 mL görüntüleme çözeltisi E3-PTU (bkz. Adım 1.3) ekleyin.
   NOT: Görüntü çözümü, sahneye slayt yerleştirmeden hemen önce eklenebilir. Görüntüleme çözeltisinin eklenmesi, agarozun tabağın tabanından yüzmesini önlemek için çok dikkatli yapılmalıdır.
5. Su daldırma lensine (40 veya 60X) geçin. Havanın kiriş yolunda sıkışıp kalmasını önlemek için merceğin hafifçe açılı olduğundan emin olun ve sahneyi yavaşça kaldırın. Objektif çözeltiye bir açıyla dokunduktan sonra onu embriyonların görüş alanına yerleştirin.
6. Floresan ışık kaynağını kullanarak ilgi segmentini bulun. Işık saçılmasını en aza indirgemek için yaralanmaya neden olan dalın yüzeysel olarak konumlandırılması (bkz. Film 1 ).
   NOT: SubsequenT basamakları, başvurulan yazılımı kullanmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu), ancak prosedür diğer platformlara kolayca adapte edilebilir.
7. Yazılımı açın. "Görünüm" e gidin | "Satın Alma Kontrolü" | "C2plus Compact GUI" ve "piksel bekleme süresi" 'ye "1.9 μs", "çerçeve boyutu" "512 x 512 piksel" ve "iğne deliği boyutu" "90 μm" olarak ayarlayın. "405 nm (veya bazı sistemlerde 408 nm) lazer yoğunluğunu" sıfır ve "488 lazer yoğunluğunu" "düşük" (tercihen <% 1) olarak ayarlayın. İyi bir dinamik aralık elde etmek için "kazancı" ayarlayın, ancak sinyali doyurmayın.
   NOT: Bu değerler kritik değildir ve tutarlılık için kullanılırlar. 405 nm lazer kullanıldığında, GFP floresansında artışa neden olur. Fotobloklama (adım 3.11) sırasında sinyalin doygunluğunu önlemek için, sinyal kazancı değeri yeşil kanal üzerinde ölçeklendirilmelidir. Mavi kanal kazancı sıfırda kalabilir, çünkü sa için kullanılmaz.mpling.
8. 488 nm lazer kullanarak böbrek taraması için yazılım arabirimindeki "Tarama" yı tıklayın. Kiriş yoluna dik olan ve iyi GFP flüoresansı ile iyi görüntülenen ilgi segmentini bulun. Bu bölge belirlendikten sonra eliptik bir Bölge (ROI) kullanarak bir ilgi bölgesi çizin.
   1. "ROI" 'ya gidin | "Eliptik ROI çizin."
      NOT: Bu, photobleaching gerçekleşirken, ortalama bir GFP yoğunluğunu sürekli olarak ölçmek için kullanılacak ve hassas bir lazer uygulaması dozuna izin verecektir.
9. "Görünüm" e gidin | "Satınalma denetimleri" | "C2plus Tarama Alanı" nı seçin ve "Bant Tarama Alanı" nı seçin. Dikdörtgen maskesi bu arayüzde görünecektir. İmleci kullanarak lazer ablasyon için hedeflenen segmenti kapsayacak şekilde dikdörtgen bir tarama penceresi manuel olarak tanımlayın ( örn . Sürükleyin, yeniden boyutlandırın ve maskeyi döndürün). Içindeki sağ tıklayınSeçimi kabul etmek için maske alanı.
   NOT: Yalnızca seçilen bölge taranacaktır.
10. GFP'yi etkinleştirmek için sadece 488 nm lazer kullanarak yeşil kanalı izlerken zaman ölçümünü başlatın. 488 lazerin yoğunluğunun nispeten düşük (~% 1) olduğundan emin olun. "Ölçü" yi seçerek ilgi bölgesinde GFP'nin ortalama yoğunluğunu ölçün | "Zaman Ölçümü" ROI içindeki ortalama yoğunluk değerlerini izlemek için "Grafik" veya "Veri" sekmelerini kullanın.
    NOT: Toplama oranı piksel durma zamanı ve adım 3.9'da ayarlanan dikdörtgen pencerenin boyutu tarafından tanımlanır, ancak genel olarak sinyalin hızlı izlenmesine (~ 2-10 kare / sn) izin verir.
11. "Lazer gücü" kontrolünü sağa kaydırarak yoğunluğu% 100 arttırarak mor lazerle (405 nm) böbrek hücrelerine hasar verin. 488 nm lazer, yoğunluk düşükse aktif kalabilir.
    1. Bir çizgiye dikkat et"Grafikler" sekmesini veya "Veri" sekmesini kullanarak GFP yoğunluğunun sayısal değerlerini kullanarak işaretleyin ve başlangıç ​​seviyesinin% 50'si gibi istenen bir seviyeye düşene kadar bekleyin ( Şekil 1'de gösterildiği gibi).
       NOT: Referans lazer ünitesinin bir parçası olarak 20 mW lazer kullanılmıştır (Malzeme Tablosuna bakınız ); Sistemler arasında maksimum yoğunluk farklılık gösterebilir. Daha düşük yoğunluk, daha uzun maruz kalma ile telafi edilebilir ( diğer bir deyişle , toplam maruz kalmanın bir ölçüsü olarak yüzde GFP ağartma kullanılarak).
12. Eliptik ROI (adım 3.8) içindeki GFP yoğunluğu istenen seviyeye düştükten sonra "lazer gücü" kaydırıcıyı sola doğru kaydırarak hemen mor (405 nm) lazer yoğunluğunu "0" a düşürün Yazılım kontrol paneli.
    1. Yeni bir GFP floresan tabanını elde edin. Ablasyonun, X / Y oranını elde ederek onaylayın.
       NOT: Bkz. Şekil1B; Y = ROI içindeki ortalama 4 ardışık örneği kullanarak ablasyon öncesi ortalama yoğunluk ve ablasyon sonrası ortalama yoğunluk X =. Tam hedef oranı (% 50,% 60, vb .) Belirli bir deney için istenen yaralanma miktarına bağlıdır.

4. Propidyum İyodür Boyamalı Zaman Aşımlı Mikroskopi

1. Fotovlasyon sonrası böbrek hücre hasarının bir korelasyonu olarak propidyum iyodür boyasını görselleştirmek için genel zaman kaybı konuları (önceki bir çalışmada 15'te özetlenmiştir) uygulayın.
2. Sırasıyla adım 2 ve 3.7'de açıklandığı üzere, embriple ve fotoablatasyondan önce 3 saat boyunca larvaları 30 uM propidyum iyodür solüsyonunda (E3-PTU'da% 1 DMSO) önceden inkübe edin.
   NOT: Agaroz veya görüntüleme çözeltisinde ilave propidyum iyodür gerekli değildir.
3. Adımlar 3.1-3.12'de açıklandığı gibi segmental böbrek yaralanmasına neden olun.
4. Zaman atlamalı resim yığınlarını, açıklandığı gibi elde edin488 nm lazer (GFP) ve 461 nm lazer (Propidium Iodide, PI) kullanılarak önceki bir çalışmada yatağa yatırıldı.
   NOT: İki renk, GFP'nin kaybolması ve propidyum iyodür boyamanın görünüşüyle ​​bağlantılı olarak konfokal yığınlara bindirilir.
5. Zaman atlamalı resim yığınlarını elde etmek için parametreleri şu şekilde ayarlayın: sanal dilim kalınlığı = 4 μm, z-yığın aralığı = 2 μm, piksel bekleme süresi = 1.9 μs, görüntü boyutları = 512 x 512 ve ortalama = 2.
   NOT: Bu parametreler, 4 larvaya kadar 10 ila 15 dakikalık aralıklarla kayıt yapmayı ve numunenin minimum fotoblokajının yapılmasını sağlar.
6. Verileri görselleştirmek ve analiz etmek için kayıt dosyası formatı ile uyumlu görüntüleme yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Bu protokolün ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 ve Tg'yi (atp1a1a.4: GFP) içeren bir dizi böbrek GFP transgen hattı ile başarıyla kullanıldığını unutmayın. Burada gösterilen örnek sonuçlar ET (krt8: EGFP) sqet11-9 hattı kullanılarak elde edilmiştir.

Şekil 1 , örnek fotoablasyon protokolünü göstermektedir. Ortalama GFP yoğunluğu ilgi bölgesi içinde ...

Tartışmalar

Toplam lazer gücünün, sistemlere göre değiştiği unutulmamalıdır. Bununla birlikte, yüzde GFP fotobloklama kullanıldığında, floresan böbrekine gönderilen toplam enerjinin, lazer gücündeki değişimden bağımsız olarak okunması ve maruz kalma süresi boyunca telafi edilmesine izin verilmektedir. Bununla birlikte, farklı dokuların bu fotoablasyon yöntemine tepkisinin değiştiğini unutmayın. Böbrek olgunlaşması sırasında bile, genç embriyolarda olgun larvalara göre GFP floresansında% 50...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2