Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Riepilogo

Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.

Abstract

L'infortunio acuto del rene (AKI) è una condizione medica comune con un elevato tasso di mortalità. Con le abilità di riparazione del rene, è possibile ripristinare adeguata funzione renale dopo un trattamento di supporto. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione del modo in cui la morte e la riparazione della nefronica si verificano a livello cellulare per ridurre al minimo la morte cellulare e per migliorare il processo rigenerativo. Il pronephros di zebrafish è un buon modello di sistema per realizzare questo obiettivo perché contiene segmenti anatomici simili al nefrone mammifero. In precedenza, il modello più comune per studiare le lesioni renali nei pesci era il modello farmacologico di gentamicina. Tuttavia, questo modello non consente un preciso controllo spatiotemporale delle lesioni e quindi è difficile studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del rene. Per ovviare a questa limitazione, questo lavoro presenta un metodo attraverso il quale, in contrasto con l'approccio gentamicinico, una specifica Proteina Fuorescente Verde (GFP) -exIl segmento del nefrone premendo può essere fotografato mediante una luce laser violetta (405 nm). Questo nuovo modello di AKI offre molti vantaggi rispetto agli altri metodi di lesioni epiteliali. I suoi principali vantaggi sono la capacità di "comporre" il livello di lesioni e il preciso controllo spatiotemporale nel robusto modello animale in vivo . Questo nuovo metodo ha il potenziale per aumentare in modo significativo il livello di comprensione dei meccanismi di lesioni renali e di riparazione.

Introduzione

La lesione acuta del rene (AKI) ^{1 , 2} , che può essere chiamata anche insufficienza renale acuta, è ampiamente definita come improvvisa compromissione della funzione renale ³ . Mentre il livello di comprensione di questa condizione è stato notevolmente migliorato nel corso degli anni, i tassi di morbilità e mortalità sono rimasti alti ^{1 , 2} . Il trattamento attuale per questa condizione è per lo più sostenuto, dato che i risultati di più studi clinici della terapia farmacologica sono stati negativi ^{4 , 5} . Il rene è unico in quanto ha la capacità di ripararsi. Pertanto, la terapia di supporto dopo una diagnosi precoce dell'AKI è il modo migliore per limitare la morbilità ⁶ . Tuttavia, è difficile rilevare AKI presto, e il tasso di mortalità è un 50-80% incredibile per coloro che necessitano di dialisi ⁵. Con la capacità dei reni di ripararsi e la mancanza di opzioni di trattamento per questa condizione, è importante sviluppare metodi per migliorare questo processo di rigenerazione dei nefroni.

Sono stati utilizzati molti modelli diversi per la ricerca AKI che include diversi agenti di lesioni e modelli animali. In termini di agenti di danno renale, la gentamicina antibiotica aminoglicosidica è stata utilizzata come agente nefrotossico che porta all'AKI ^{7 , 8} . Tuttavia, diversi gruppi hanno riscontrato che il trattamento con gentamicina è letale per l'embrione zebrafish ⁹ . Provoca danni tubolari troppo gravi per il recupero degli embrioni, rendendo difficile lo studio della rigenerazione senza alcun tipo di intervento. I modelli mammiferi, come il topo e il topo, sono considerati anche preziosi, ma devono affrontare molte limitazioni durante lo studio dell'AK. Forse il principale svantaggio dei modelli di roditori è la difficoltà di visuaDimagrendo il rene del roditore e determinando così i precisi processi spatiotemporali che portano alla morte epiteliale e alla riparazione.

Johnson et al. Hanno riportato una tecnica basata sull'ablazione laser per indurre lesioni acute del rene negli zebrafish embrionali e larvali ⁹ . Usavano l'ablazione laser pulsata per danneggiare il rene dopo un'iniezione intramuscolare con coniugati di dextran. La fluorescenza dei coniugati di dextran consente la visualizzazione dei danni e la rigenerazione nell'epitelio tubulare ⁹ . Questo modello supera le due limitazioni di cui sopra, ma non consente livelli di lesioni graduati e è difficile da svolgere su grandi gruppi arbitrari di cellule.

Il nuovo modello di zebrafish basato sull'ablazione laser di AKI qui descritto affronta tutte le limitazioni di cui sopra. Il rene pronebrofico in zebrafish larvale è un organo maturo e funzionante che contiene segmenti analoghi ai mammiferiPhron, inclusi un tubo glomerulus, prossimale e distale e un condotto di raccolta ¹⁰ . Le larve di zebrafish sono anche otticamente trasparenti, rendendo possibile osservare il rene attraverso tecniche di fluorescenza. Così, i pesci zebra sono un prezioso modello in vivo di AKI e il rene pronoferico larvale (5-12 giorni dopo la fecondazione (dpf)) può essere utilizzato per studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti in lesioni renali e riparazioni.

Questo documento presenta un metodo attraverso il quale possono essere fotoablati specifici segmenti nefronici che esprimono GFP (Green Fluorescent Protein), utilizzando una luce laser violetta (405 nm) a basso consumo energetico (rispetto ad un impulso laser). La fluorescenza GFP consente di targetizzare un gruppo di cellule, rendendo visibili le modifiche attraverso l'osservazione della fotopolimerizzazione di GFP. Inoltre, GFP (assorbendo la luce viola) serve come un dispersore energetico per potenziare il danno nelle cellule renali che esprimono GFP. Time-lapse microsLa copia può quindi essere utilizzata per studiare il processo di riparazione. Gli studi hanno trovato la proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e la metaplasia delle cellule ^{11 , 12 , 13} a tutti i processi potenziali che possono svolgere un ruolo importante nella riparazione del rene. Tuttavia, l'importanza relativa di questi processi e i dettagli della loro interazione è stata difficile da scoprire a causa delle limitazioni dei modelli esistenti di AKI. Utilizzando questo nuovo approccio, è stato possibile dimostrare che la migrazione delle cellule gioca un ruolo centrale nella riparazione del rene dopo lesioni acute ¹⁴ .

Protocollo

Questo studio è stato condotto secondo le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali di osteopatia (NYITCOM IACUC). Tutte le operazioni di chirurgia e sperimentazione in vivo sono state eseguite in anestesia tricaina e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza.

1. Ottenere e mantenere embrioni

1. Ottenere gli embrioni attraversando il gheppio di zebrafish fluorescente GFP.
   NOTA: Alcuni esempi di linee transgeniche con zebrati etichettate con fluorescenza sono elencate nella tabella 1 .
2. Tenere gli embrioni a 28,5 ° C in soluzione E3 durante la fecondazione post-24 h.
3. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con una soluzione E3 contenente 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU).
   NOTA: PTU viene utilizzato perché blocca i passi dipendenti dalla tirosinasi in melanogenesiE quindi impedisce la pigmentazione. Qui, questa soluzione è denominata E3-PTU.
4. Sollevare gli embrioni fecondati a 28,5 ° C finché non sono> 6 dpf, in questo momento i reni sono maturati.
   NOTA: è meglio utilizzare le larve nella finestra 7-9 dpf.
5. Utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente a ingrandimento 40X e filtri di emissione di fluorescenza verde, selezionare le larve con fluorescenza GFP luminosa del rene.

2. Montaggio del Zebrafish per immagini in tempo reale

1. Se fotofabbrando gli embrioni prima di 3 dpf, rimuova il coro da qualsiasi pesce zebra non inciso prima di montare il pesce zebra per l'imaging.
   1. Decoltare manualmente con pinze (preferite) o utilizzare un trattamento chimico con una miscela di proteasi.
      NOTA: Dechorination consente di ottenere i migliori risultati dell'immagine.
2. Risciacquare i residui di chorion nel piatto di Petri utilizzando la soluzione E3-PTU e ricaricare il piatto con E3-PTU.
3. PrepaRi 1-2% agarosio a basso punto di fusione (LMP) con 0,2 mg / mL soluzione tricina per montare il pesce zebra per fotoablazione del rene e immagini in vivo.
   1. Se l'agarosio LMP era già stato preparato in precedenza, riscaldarlo nel forno a microonde per sciogliere.
4. Una volta preparato l'agarosio LMP, posizionare un piatto di petri di plastica da 35 mm su un microscopio di dissezione. Posizionare una sonda di vetro tirata vicino per orientare correttamente le larve anestetizzate.
   NOTA: è importante fare questo passo in modo tempestivo e avere tutto in posto, poiché gli embrioni devono essere orientati prima che l'agarosio si solidifichi in circa 1-3 min.
5. Prima di trasferire l'embrione all'agarose, assicurarsi che l'agarosio sia fresco ( cioè a circa la temperatura corporea). Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica o vetro per posizionare l'embrione nella soluzione di agarosio-tricina fuso in raffreddamento.
   NOTA: questo è fatto perché l'agarosio troppo caldo può essere dannoso per l'embrione, portando all'arresto cardiacoO la morte
6. Usando una pipetta di trasferimento, ridisegnare l'embrione nella soluzione agarosa e posizionare l'embrione / larva al centro di un piatto da 35 mm.
7. Spargere rapidamente l'agarosio contenente l'embrione / larva per coprire uniformemente il fondo del piatto da 35 mm; Il miglior volume di agarosio da usare è ~ 1-1.1 mL.
8. Utilizzare la sonda di vetro per orientare l'embrione nella migliore posizione possibile per fotoablazione e imaging.
   NOTA: Il filmato 1 mostra l'orientamento migliore dell'embrione / larva per la fotoablazione unilaterale. Questo passo è il più sensibile al tempo e dovrebbe essere eseguito rapidamente prima che l'agarosio inizia a gelare, in quanto qualsiasi tentativo di reorientare il pesce dopo l'inizio della gelificazione è dannoso.
   1. Orientare la larva in modo che il segmento di interesse renale sia perpendicolare al percorso del fascio mentre il segmento contralaterale è lontano dal fascio laser (vedi film 1 ).
      NOTA: Ciò può essere ottenuto girando la larva come mostrato in Movie 1 .
9. Lasciare circa 15 minuti per l'agarosio per solidificare. Coprire il piatto di Petri per minimizzare l'evaporazione. Una volta che l'agarosio si è solidificato, l'embrione o la larva sono pronti per la fotoablazione.

3. Ablazione laser

1. Azionare il sistema di imaging confocale.
   NOTA: Quando si utilizza la piattaforma di imaging a cui si fa riferimento (vedere la tabella dei materiali), le impostazioni consigliate includono l'ingrandimento 40X, una lente d'immersione a 0,8 NA e il primo specchio dicroico impostato per consentire l'illuminazione di 488 e 405 nm. Il rilevamento deve essere eseguito sul canale verde.
2. Posizionare il piatto contenente i pesci zebra immobilizzati su uno stadio confocale.
   NOTA: Questa procedura è ottimizzata per la configurazione verticale usando una lente d'immersione 40-60X. Tuttavia, dovrebbe essere possibile modificare la procedura per un microscopio invertito.
3. Nella configurazione verticale, posizionare il piatto di Petri contenente l'embrione in cima a un microscopioScivolare e tenerlo in posizione utilizzando l'argilla modellante ( ad es. Plastilina). Posizionare lo scivolo in vetro con il piatto di Petri sullo stadio del microscopio confocale.
4. Aggiungere 3 ml della soluzione di imaging E3-PTU (vedere punto 1.3) con 0,2 mg / mL tricina.
   NOTA: la soluzione di imaging può anche essere aggiunta immediatamente prima di posizionare la diapositiva sul palco. L'aggiunta di soluzione di imaging deve essere effettuata con molta attenzione per evitare che l'agarosio galleggi fuori dal fondo del piatto.
5. Passare alla lente di immersione dell'acqua (40 o 60X). Sollevare lentamente lo stadio, assicurandosi che l'obiettivo sia leggermente angolato per impedire che l'aria venga intrappolata nel percorso del fascio. Una volta che la lente tocca la soluzione ad un angolo, centratela in modo che sia nel campo visivo degli embrioni.
6. Trova il segmento di interesse utilizzando la sorgente luminosa a fluorescenza. Posizionare superficialmente il ramo mirato per lesioni per minimizzare la dispersione della luce (vedere il filmato 1 ).
   NOTA: il successivoT fare uso di software di riferimento (vedere la tabella dei materiali), ma la procedura può essere facilmente adattata ad altre piattaforme.
7. Aprire il software. Passare a "Visualizza" | "Acquisition Control" | "C2plus Compact GUI" e impostare "tempo di spostamento dei pixel" a "1.9 μs", "dimensione del fotogramma" a "512 x 512 pixel" e "dimensioni del pinhole" a "90 μm". Impostare "405 nm (o 408 nm in alcuni sistemi) l'intensità laser" a zero e "488 intensità laser" a "bassa" (preferibilmente <1%). Regolare il "guadagno" per ottenere una buona gamma dinamica, ma non per saturare il segnale.
   NOTA: Questi valori non sono critici e vengono utilizzati per la coerenza. Quando viene utilizzato un laser da 405 nm, si verificherà un aumento della fluorescenza GFP. Per evitare la saturazione del segnale durante la fotopolimerizzazione (passo 3.11), il valore del guadagno del segnale dovrebbe essere ridotto sul canale verde. Il guadagno del canale blu può essere lasciato a zero, in quanto non viene utilizzato per sampling.
8. Fare clic su "Scan" nell'interfaccia software per eseguire la scansione del rene utilizzando un laser a 488 nm. Trova il segmento di interesse che è perpendicolare al percorso del fascio e che è ben visibile, con buona fluorescenza GFP. Una volta individuata la regione, disegnare una regione di interesse utilizzando una Regione di interesse (ROI) ellittica.
   1. Passare a "ROI" | "Disegna il ROI Elliptico".
      NOTA: Questo verrà utilizzato per misurare continuamente l'intensità media di GFP durante la fase di foto-bleaching, consentendo la somministrazione di una dose precisa di trattamento laser.
9. Passare a "Visualizza" | "Comandi di acquisizione" | "Area di scansione di C2plus" e scegliere "Area di scansione di banda". La maschera rettangolare apparirà all'interno di tale interfaccia. Definire manualmente una finestra di scansione rettangolare utilizzando il cursore ( cioè trascinare, ridimensionare e ruotare la maschera) per coprire il segmento mirato all'ablazione laser. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'oggettoArea maschera per accettare la selezione.
   NOTA: verrà scansionata solo la regione selezionata.
10. Iniziare la misurazione del tempo durante il monitoraggio del canale verde usando solo il laser da 488 nm per attivare GFP. Assicurarsi che l'intensità del laser 488 sia relativamente bassa (~ 1%). Misurare l'intensità media del GFP nella regione di interesse selezionando "Misura" | "Misurazione del tempo". Utilizza le schede "Grafico" o "Dati" per monitorare i valori di intensità media all'interno del ROI.
    NOTA: La velocità di acquisizione è definita dal tempo di dimensione del pixel e dalla dimensione della finestra rettangolare impostata al punto 3.9, ma in generale consente il monitoraggio veloce del segnale (~ 2-10 fotogrammi / s).
11. Indurre danni alle cellule renali con il laser violetto (405 nm) aumentando l'intensità al 100% facendo scorrere il controllo "potenza laser" fino a destra. Il laser a 488 nm può rimanere attivo se l'intensità è bassa.
    1. Osservare una linea gUtilizzando la scheda "Grafico" oppure i valori numerici dell'intensità GFP utilizzando la scheda "Dati" e attendere che scenda a un livello desiderato, ad esempio il 50% della linea di base (come mostrato in Figura 1 ).
       NOTA: Un laser da 20 mW è stato utilizzato come parte dell'unità laser di riferimento (vedere la tabella dei materiali ); L'intensità massima può variare tra i sistemi. L'intensità inferiore può essere compensata da un'esposizione più lunga ( cioè usando la percentuale di sbiancamento GFP in percentuale come misura dell'esposizione totale).
12. Una volta che l'intensità del GFP all'interno del ROI ellittico (passo 3.8) è scesa a un livello desiderato, diminuire immediatamente l'intensità del laser violetto (405 nm) a "0" spostando il dispositivo di scorrimento "laser power" fino a sinistra in Il pannello di controllo del software.
    1. Ottieni una nuova linea di base della fluorescenza GFP. Confermare l'ablazione ottenendo un rapporto di X / Y.
       NOTA: vedere la Figura1B; Y = intensità media prima dell'ablazione e X = intensità media dopo l'ablazione, utilizzando una media di 4 campioni consecutivi all'interno del ROI. L'esatto rapporto target (50%, 60%, ecc .) Dipende dalla quantità di lesioni che si desidera per un determinato esperimento.

4. Microscopia a tempo trascorso con la colorazione dei propidium ioduro

1. Applicare le considerazioni di intervallo di tempo generali (descritte in uno studio precedente ¹⁵ ) per visualizzare la colorazione del propidio ioduro come correlato del pregiudizio delle cellule renali dopo la fotoablazione.
2. Pre-incubare le larve in 30 μM soluzione di ioduro di propidium (1% DMSO in E3-PTU) per 3 ore prima dell'incollaggio e fotoablazione, come descritto nei passaggi 2 e 3.7, rispettivamente.
   NOTA: Nell'agarosio o nella soluzione di imaging non è richiesto alcun ioduro propidio aggiuntivo.
3. Indurre lesioni renali segmentali, come descritto nei passaggi 3.1-3.12.
4. Ottieni i tempi di scadenza dell'immagine, come descriLetto in uno studio precedente 14, utilizzando un laser da 488 nm (GFP) e un laser da 461 nm (Propidium Iodide, PI).
   NOTA: I due colori sono sovrapposti in pile confocali per correlare la scomparsa di GFP e l'aspetto della colorazione di propidium ioduro.
5. Impostare i parametri per ottenere gli stack di immagini a tempo trascorso come segue: spessore della fetta virtuale = 4 μm, intervallo z-stack = 2 μm, tempo di dimensione dei pixel = 1,9 μs, dimensioni dell'immagine = 512 x 512 e media = 2.
   NOTA: Questi parametri permettono di registrare continuamente fino a 4 larve da 10 a 15 minuti e assicurare che esista una minima fotopolimerizzazione del campione.
6. Utilizzare il software di imaging compatibile con il formato di file di registrazione per visualizzare e analizzare i dati.

Risultati

Si prega di notare che questo protocollo è stato utilizzato con una serie di linee transgeniche GFP renali, tra cui ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). I risultati di esempio mostrati qui sono stati ottenuti utilizzando la linea ET (krt8: EGFP) sqet11-9.

La figura 1 mostra il protocollo di fotoablation di esempio. L'intensità media GFP viene monitorata...

Discussione

Va notato che la potenza laser totale varia tra i sistemi. Tuttavia, l'utilizzo di percentuale di fotopolimerizzazione GFP consente una lettura dell'energia totale erogata al rene fluorescente, indipendente dalla variazione della potenza laser e compensata dalla lunghezza dell'esposizione. Tenga presente, tuttavia, che la risposta di diversi tessuti a questo metodo di fotoablazione varia. Anche durante la maturazione del rene, è significativamente più difficile ottenere una riduzione del 50% della fluoresc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2