Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

Resumen

Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón.

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección, aislamiento y cultivo de rutinas metanefricas de ratón.

Durante el desarrollo del riñón de los mamíferos, los dos tejidos progenitores, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, se comunican y inducen recíprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente el sistema colector y los nefrones del riñón. A medida que los embriones de mamíferos crecen intrauterinos y por lo tanto son inaccesibles para el observador, se ha desarrollado un cultivo de órganos. Con este método, es posible estudiar las interacciones epiteliales-mesenquimales y el comportamiento celular durante la organogénesis renal. Además, se puede investigar el origen de las malformaciones congénitas del riñón y del tracto urogenital. Después de una disección cuidadosa, los rudimentos metanefricos se transfieren a un filtro que flota sobre el medio de cultivo y puede mantenerse en una incubadora de cultivo celular durante varios días. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condiciones sonArtificial y podría influir en el metabolismo en el tejido. Además, la penetración de sustancias de ensayo podría estar limitada debido a la matriz extracelular y la membrana basal presentes en el explante.

Una ventaja principal de la cultura de órganos es que el experimentador puede obtener acceso directo al órgano. Esta tecnología es barata, sencilla y permite un gran número de modificaciones, como la adición de sustancias biológicamente activas, el estudio de variantes genéticas y la aplicación de técnicas de imagen avanzada.

Introducción

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

Protocolo

Los ratones se mantuvieron de acuerdo con la normativa sueca y la legislación de la Unión Europea (2010/63 / UE). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Comité Sueco de Ética (permisos C79 / 9, C248 / 11, y C135 / 14). El Regierungspräsidium Karlsruhe y los Oficiales de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg han aprobado procedimientos en la Universidad de Heidelberg sobre animales.

1. Preparación de reactivos y materiales para la cultura

NOTA: Use una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación.

1. En el día de la disección, la Fc humana previa a la agrupación o la proteína de efrina quimérica recombinante se fusionaron a Fc humano mezclándola con anticuerpos de cabra Fc antihumanos en una proporción molar de 1: 5 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C ⁵ .
2. Preparar el medio de cultivo suplementando Dulbecco's Modified Eagle Medium: NutrientMezcla F-12 (DMEM / F12) con 1% de penicilina / estreptomicina (v / v), 1% de glutamina (v / v), 1% de insulina-transferrina-selenio (v / v) Transferrina y 1,5 μg / ml de anfotericina.
   NOTA: 10 ml de medio son suficientes para 16 embriones.
3. Añada una solución concentrada de efrina recombinante a una concentración final de 20 μg / ml al medio de cultivo. Utilice Fc humano agrupado como control.
4. Preparar las placas de cultivo añadiendo 500 μl de medio de cultivo a cada pocillo de una placa estéril de 4 pocillos de poliestireno de fondo plano sin recubrimiento.
5. Usando fórceps estériles, coloque cuidadosamente un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 5 μm por pocillo en la parte superior del medio. Transferir la placa preparada a la incubadora (37 ° C / 5% CO ₂ ). Asegúrese de que el filtro permanezca seco en la superficie superior y flote.
   NOTA: Un filtro es suficiente para dos anlagen de riñón.
6. Utilizando una cuchilla de afeitar, corte aproximadamente 30 puntas de pipeta (volumen: 100 μl) aprox.Y 1 mm de la punta para dar lugar a una abertura más amplia. Coloque las puntas de nuevo en un rack pipette-tip.

2. Disección de Rudimentos Metanefricos en E11.5

1. Sacrifique a un ratón embarazado cronometrado en E11.5 por dislocación cervical (o usando un método aprobado por el comité de ética local).
2. Retirar el útero y los embriones, según lo descrito por Brown et al ⁶ . A partir de este punto, trabajar bajo un microscopio de disección.
3. Usando la pinza de relojería No. 5, corte el embrión directamente debajo de las patas delanteras. Utilice un plato de petri fresco para cada embrión. Quitar las piernas y la cola del embrión. Para ello, agarra el tejido que se va a quitar con un par de fórceps relojero nº 5 y usa las puntas de un segundo par para cortar.
4. Para retirar la masa del órgano ventral, use las puntas de un par de pinzas para abrir lateralmente la pared del cuerpo del embrión en una dirección rostral a caudal.
   1. Corte superficialmente, paralelo a tLa aorta dorsal. Utilice la aorta dorsal llena de sangre y por lo tanto visible para la orientación. Separar cuidadosamente la parte ventral de la pared del cuerpo de la parte dorsal usando las puntas de la pinza cerrada y voltear el embrión. Corte la pared del cuerpo lateralmente en una dirección rostral a caudal y usando la aorta dorsal para la orientación, como para el lado anterior.
5. Una vez que la pared del cuerpo ventral se ha separado del cuerpo dorsal, agárralo con un par de fórceps y tire con cuidado para quitarlo, junto con la masa del órgano.
   NOTA: El metanéfrico anlagen suele permanecer unido a la pared del cuerpo dorsal. Son estructuras ovales de ~ 200 μm de largo situadas al nivel de las extremidades posteriores.
6. Sujete la pared del cuerpo dorsal con un par de fórceps, con el lado ventral hacia arriba. Utilizando el otro par de pinzas, agarrar la aorta dorsal en su extremo rostral y cuidadosamente pelar la aorta dorsal de la pared del cuerpo dorsal.
   NOTA: Ambos riñones metanefricos generalmente se mantienen unidosA la aorta dorsal.
7. Usando un par de fórceps, corte rostralmente al riñón anlagen para eliminar la aorta. Luego, cuidadosamente separar los dos anlagen renal utilizando las puntas de la pinza.
8. Cuidadosamente quitar el tejido no deseado del riñón anlagen con las puntas de la pinza. Tenga cuidado de no dañar el mesénquima, ya que el daño puede resultar en un pobre crecimiento y la exclusión del explante de un análisis posterior.
9. Transferir el anlagen renal por separado con una pipeta de microlitros y una punta de pipeta abierta en 10 μL de PBS al filtro de membrana de policarbonato en una placa de 4 pocillos.
   NOTA: Debido a la tensión superficial, el explante se cubrirá con una fina capa de medio. Un filtro es suficiente para dos anlagen renal.
   1. Coloque cada uno de los dos anlagen renal en el centro de cada mitad respectiva del filtro. Transferir la placa de nuevo a la incubadora a 37 ° C / 5% de CO ₂ . Dejar la placa en la incubadora hasta que el ron metanefricImentes del siguiente embrión están listos para ser colocados en el filtro.
10. Repita los pasos 2.3-2.9.1 para cada embrión.
    NOTA: Con cierta práctica, el procedimiento de disección tomará aproximadamente 5 min por embrión.
11. Incubar el riñón anlagen durante 3 días a 37 ° C / 5% de CO ₂ .

3. Preparación de reactivos para fijación y tinción

1. Para preparar paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS sin calcio y magnesio (p / v), disolver el PFA a 60 ° C en PBS, agitando continuamente. Enfriar a temperatura ambiente y utilizar un filtro de papel para eliminar las partículas restantes. Alícuota y mantener a 4 ° C para su uso inmediato o congelar para el almacenamiento a largo plazo.
   PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica. Use el equipo de protección personal especificado en las normas de seguridad locales y trabaje en una campana extractora de humos. Deseche los desechos siguiendo las pautas institucionales y usando contenedores de desecho designados.
2. Para preparar la solución de permeabilización, diluir Triton X-100En PBS sin calcio y magnesio hasta 0,3% (v / v).
3. Para preparar la solución de bloqueo, añadir 5% (v / v) de suero de cabra y 0,1% Triton X-100 a PBS sin calcio y magnesio. Añadir azida sódica hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Almacenar a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica. Manipular la azida sódica de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.
   NOTA: Cuando se usan anticuerpos para la tinción, use suero al 5% de la especie de la que se derivó el anticuerpo secundario para hacer la solución de bloqueo.
4. Diluir la aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 en solución de bloqueo. Diluir Alexa488-streptavidin conjugado 1: 200 en solución de bloqueo.
5. Para preparar un medio de incrustación listo para usar (véase la tabla de materiales), añadir 0,1 g de mucoadhesivo / ml a base de alcohol polivinílico soluble en agua a glicerol al 25% (p / v) en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Calentar a 50 ° C bajo agitación continua durante 1 h, enfriar y ajustar el pH a 8,0-8,5 usando 1M de NaOH. Evitar mayores concentraciones de NaOH. Añadir 100 μg / ml de N-propilgalato y timerosal hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El timerosal es tóxico. Manipularlo de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.
   1. Llenar el medio de inclusión en tubos de 50 ml, equilibrar el rotor y centrifugar a 3.200 xg ya temperatura ambiente durante 10 min. Decantar la solución transparente en tubos de 15 mL y desechar el gránulo. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varias semanas. Una vez descongelado, mantener la solución a 4 ° C. Caliente a ~ 30 ° C inmediatamente antes de usar.
6. Prepare tantos portaobjetos de vidrio como los filtros con explantes deben montarse. Para ello, pegue dos pequeños cubreobjetos, 18 x 18 mm, a cada lado de la diapositiva de vidrio con adhesivo instantáneo, Deje un espacio de ~ 15 mm para el filtro entre.

4. Fijación y tinción

1. Después de un período de cultivo de 3Días in vitro (div), retirar las placas de la incubadora y aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pocillo usando una micropipeta. Asegúrese de no tocar el filtro y mantenga la punta abierta hacia la pared del pozo.
2. Añadir 500 μl de PFA al 4% / PBS a cada pocillo. Los filtros flotarán sobre el fijador. Usando una micropipeta, agregue cuidadosamente el fijador PFA gota a gota para sumergir los filtros. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   NOTA: Para todos los pasos siguientes, se debe tener cuidado de no lavar los explantes del filtro. Mantenga la abertura de la punta de la pipeta hacia la pared del pozo.
3. Retire el PFA y enjuague dos veces con 500 μl de PBS, sumergiendo el filtro. Añadir 500 μl de solución de permeabilización a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Enjuagar dos veces con 500 μL de PBS y añadir 500 μL de solución de bloqueo a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Reemplace la solución de bloqueo por250 μl de aglutinina biotinilada Dolichorus biflorus diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h.
6. Retire la solución de aglutinina de Dolichorus biflorus y enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo.
7. Añadir 250 μL de estreptavidina conjugada con Alexa488 diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
   NOTA: Se consigue una mejor relación señal / ruido cuando se incuba a 4 ° C.
8. Enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo. Usando fórceps, transfiera los filtros a las diapositivas de vidrio preparadas, con los explantes hacia arriba. Montar con ~ 50-100 μl de medio de incrustación. Cubrir con cubreobjetos No. 1.5 de 60 mm de largo. Dejar que la solución del medio de incrustación se solidifique durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Proceda a la formación de imágenes o almacene las diapositivas, envueltas en papel de aluminio, a 4 ° C hasta que esté listo para la imagen.
9. Imagen con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho ^{7 <}/ Sup> acoplado a una lámpara de Hg y utilizar una unidad de espejo para la excitación azul (paso de banda de excitación, 460 - 495 nm, espejo dicromático, 505 nm y paso de banda de emisión, 510 - 550 nm) y 20X Plan - Apochromat, 0,75 numérico abertura.

Resultados

El anlagen renal metanéfrico se obtuvo a partir de ratones endocrinos Black-6 preñados a E11.5 y se cultivaron. Después de 3 días, la yema ureterica se había ramificado hasta 5 veces, dando como resultado una ramificación de la yema ureterica inicialmente en forma de T. Se fotografió cada explante y se cuantificaron los números de segmentos y puntos finales para determinar las generaciones de ramificación y para calcular el número de puntos finales por rama ( Figura 1

Discusión

Este manuscrito describe un método para aislar el desarrollo de metanfric anlagen del embrión de ratón y para cultivar los órganos rudiments. Este método es una técnica estándar, desarrollada por Grobstein ⁸ y Saxén ^{9 , 10} , y fue adaptada y modificada por muchos otros ^{11 , 12} . El éxito del método depende principalmente de la duración de la disección, ya que la superv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E