マウス胎児腎臓の解剖および培養

要約

このプロトコルは、マウス胚からのmetanephric基盤を単離および培養するための方法を記載する。

要約

このプロトコールの目的は、マウスのメタネフリカの基礎の解剖、単離および培養のための方法を記述することである。

哺乳動物の腎臓発達中、2つの前駆組織、尿管芽および間葉間葉は、最終的に腎臓の収集系およびネフロンを形成するために、細胞機構を伝達し相互に誘導する。哺乳動物の胚が子宮内で増殖し、したがって観察者が接近できないので、器官培養が開発されている。この方法により、腎臓器官形成の間に上皮間葉相互作用および細胞の挙動を研究することが可能である。さらに、先天性腎臓および泌尿生殖路奇形の起源を調べることができる。慎重な解剖の後、metanephricの手先は、培地上に浮遊するフィルター上に移され、数日間細胞培養インキュベーターに保持することができます。しかし、条件が人工的であり、組織内の代謝に影響を及ぼす可能性がある。また、外植片に存在する細胞外基質および基底膜のために、試験物質の浸透が制限される可能性がある。

器官培養の1つの主な利点は、実験者が器官に直接アクセスできることである。この技術は安価で簡単であり、生物学的に活性な物質の添加、遺伝子変異の研究、高度なイメージング技術の適用など、多数の改変が可能である。

概要

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

プロトコル

マウスは、スウェーデンの規制およびEU法（2010/63 / EU）に従って維持された。すべての手続きはスウェーデン倫理委員会のガイドライン（C79 / 9、C248 / 11、C135 / 14の許可）に従って実施された。ハイデルベルク大学での動物被験者の手順は、ハイデルベルク大学のRegierungspräsidiumKarlsruheとAnimal Welfare Officersによって承認されています。

1.培養用試薬および材料の調製

注：汚染を最小限に抑えるために、層流フードを使用してください。

1. 解剖の日に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の1：5のモル比で抗ヒトFcヤギ抗体と混合することにより、ヒトFcに融合されたヒトFcのみまたはヒトFcに融合された組換えキメラエフリンタンパク質を前もってクラスター化する。 37℃で1時間インキュベートする^。5 。
2. ダルベッコ改変イーグル培地：栄養素を補充して培地を調製する1％ペニシリン/ストレプトマイシン（v / v）、1％グルタミン（v / v）、1％インシュリン - トランスフェリン - セレン（v / v）、50μg/ mlのヒトホロ - トランスフェリン、および1.5μg/ mLのアンホテリシンを含む。
   注：16胚には培地10 mLで十分です。
3. 20μg/ mLの最終濃度のクラスター化組換えエフリン溶液を培地に添加する。クラスター化されたヒトFcを対照として使用する。
4. 無菌のコーティングされていない平底のポリスチレン4ウェルプレートの各ウェルに培地500μLを加えて培養プレートを調製する。
5. 滅菌鉗子を使用して、培地の上に穴あたり5μmの孔径を有するポリカーボネート膜フィルターを注意深く1つ置きます。調製したプレートをインキュベーター（37℃/ 5％CO ₂ ）に移す。フィルターが上面に濡れていて浮いていることを確認してください。
   注：2つの腎臓の癌細胞には1つのフィルターで十分です。
6. かみそりの刃を使用して、およそ30個のピペットチップ（容量：100μL）を切断して先端から1mmの位置で、より広い開口部をもたらす。チップをピペットチップラックに戻します。

2. E11.5におけるメタネフリックルディメントの解体

1. E11.5で妊娠しているマウスを頸椎脱臼により犠牲にする（または地元の倫理委員会で承認された方法を使用する）。
2. ブラウンら ⁶ ）の記載に従って、子宮および胚を取り除く。この時点から、解剖顕微鏡下で作業する。
3. 第5時計メーカーの鉗子を使用して、前脚のすぐ下に胚を切断します。各胚のために新しいペトリ皿を使用してください。胚の脚と尾を外す。これを行うには、削除する組織を1組の5番時計メーカーの鉗子でつかみ、2番目のペアの先端を使用して切断します。
4. 腹側器官の塊を取り除くには、一対の鉗子の先端を使用して、胚の体壁を吻側 - 尾側方向に横に開く。
   1. 表面と平行、tに平行彼は背の大動脈。血液充填された、したがって目に見える背側大動脈を方向付けに使用する。閉鎖した鉗子の先端を用いて体壁の腹側部分を背側部分から注意深く分離し、胚を裏返す。体側の壁を吻側から尾側に切断し、前側と同様に背側の大動脈を使用して向きを決めます。
5. 腹側の身体の壁が背側の身体から分離されたら、1対の鉗子でそれをつかんで、それを臓器塊とともに慎重に引き抜く。
   注：metanephric anlagenは、通常、背の体の壁に付着したままになります。それらは、後肢のレベルに位置する長さ約200μmの楕円形の構造である。
6. 腹側を上にして、1対の鉗子で背側の身体の壁を保持する。他の鉗子のペアを使用して、その吻側の端で背部の大動脈をつかんで背部の体の壁から背部の大動脈を注意深く剥がす。
   注：両方のメタニュークリニック腎臓は、通常、背部大動脈に投与した。
7. 1対の鉗子を用いて、大動脈を除去するために吻側に吻側に切断する。次に、慎重に鉗子の先端を使用して2つの腎臓のanlagenを分離します。
8. 慎重に鉗子の先端を使用して腎臓のanlagenから不要な組織を剥がす。間葉系に損傷を与えないよう注意してください。破損は、さらなる分析から外植片の成長不良および排除を招く可能性があるためです。
9. 4ウェルプレートのポリカーボネートメンブランフィルターに10μLのPBSにマイクロタイターピペットとワイドオープンピペットチップを使用して、腎臓のanlagenを別々に移す。
   注：表面張力のため、外植片は薄い培地層で覆われます。 2つの腎臓のマーカーには1つのフィルターで十分です。
   1. 2つの腎臓のそれぞれをフィルターの各半分の中央に置きます。プレートを37℃/ 5％CO _2のインキュベーターに戻します。プレートはインキュベーターの中に放置してください次の胚からのイメントは、フィルター上に置く準備ができている。
10. 各胚についてステップ2.3〜2.9.1を繰り返す。
    注：いくつかの練習では、解剖の手順は、胚あたり約5分かかるでしょう。
11. 37℃/ 5％CO ₂で3日間、腎臓の蛍光物質をインキュベートする。

3.固定化および染色のための試薬の調製

1. カルシウムとマグネシウム（w / v）を含まないPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製するために、PFAを60℃でPBSに溶解し、連続的に撹拌する。室温まで冷却し、紙フィルターを使用して残りの粒子を除去する。分注し、すぐに使用する場合は4℃に保ち、長期間保存する場合は凍結してください。
   注意：PFAは有毒です。現地の安全基準に規定されている個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業してください。施設ガイドラインと指定廃棄物容器を使用して廃棄物を廃棄してください。
2. 透過液を調製するために、希釈したTriton X-1000.3％（v / v）までのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS中でインキュベートした。
3. ブロッキング溶液を調製するために、5％（v / v）ヤギ血清および0.1％Triton X-100をカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSに加える。アジ化ナトリウムを0.02％（w / v）の最終濃度まで添加する。 4℃で保存する。
   注意：アジ化ナトリウムは有毒である。現地の安全および環境保護規制に従ってナトリウムアジドを取り扱ってください。
   注：染色のために抗体を使用する場合、二次抗体が由来する種からの5％血清を用いてブロッキング溶液を作製する。
4. ビオチン化Dolichorus biflorusアグルチニンをブロッキング溶液で1：200希釈する。 Alexa488結合ストレプトアビジンをブロッキング溶液で1：200希釈する。
5. すぐに使用できる包埋培地（材料の表を参照）を調製するために、0.1M Tris-HCl（pH 8.5）中の25％（w / v）グリセロールに0.1gの水溶性ポリビニルアルコール系粘膜接着剤/ 。連続的に攪拌しながら50℃に1時間加熱し、冷却し、1を用いてpHを8.0-8.5に調整する。M NaOH。より高いNaOH濃度を避けてください。 100μg/ mLのN-プロピルガレートおよびチメロサールを0.02％（w / v）の最終濃度に加える。室温で30分間撹拌する。
   注意：チメロサールは有毒です。現地の安全および環境保護規制に従って取り扱ってください。
   1. 50 mLのチューブに包埋培地を満たし、ローターをバランスさせ、3,200 xgで室温で10分間遠心する。透明な溶液を15 mLチューブに移し、ペレットを捨てる。分注し、数週間-20℃で保存します。解凍後、溶液を4℃に保ちます。使用直前に約30℃まで暖めます。
6. 外植片を取り付けるためのフィルターをガラススライドとして準備します。このためには、インスタント接着剤を使用してスライドガラスの両側に小さなカバースリップ（18 x 18 mm）を2つ貼り付けます。間に15 mmのスペースを残してください。

4.固定および染色

1. 3の培養期間後in vitroでインキュベートし （div）、インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロピペットを用いて各ウェルから培地を注意深く吸引する。フィルターに触れないで、先端開口部を井戸の壁の方に保つようにしてください。
2. 500μLの4％PFA / PBSを各ウェルに加える。フィルターは固定液に浮かぶでしょう。マイクロピペットを使用して、注意深くPFA固定剤を滴下して、フィルターを水没させる。室温で30分間インキュベートする。
   注記：以降のすべての手順では、外植片をフィルターから洗い流さないように注意しなければなりません。井戸の壁に向かってピペットチップの開口部を保つ。
3. PFAを除去し、500μLのPBSで2回洗浄し、フィルターを浸します。 500μLの透過処理溶液を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。
4. 500μLのPBSで2回すすぎ、500μLのブロッキング溶液を各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートする。
5. ブロッキング溶液を250μLのビオチン化Dolichorus biflorus凝集素をブロッキング溶液で1：200に希釈し、4℃で24時間インキュベートする。
6. Dolichorus biflorusアグルチニン溶液を除去し、1ウェルあたり500μLのPBSで2回リンスする。
7. ブロッキング溶液で1：200に希釈したAlexa488結合ストレプトアビジン250μLを添加し、4℃で24時間インキュベートする。あるいは、室温で2時間インキュベートする。
   注：4℃でインキュベートすると、より良いシグナル対ノイズ比が得られます。
8. 1ウェルあたり500μLのPBSで2回すすぐ。鉗子を使用して、外植片を上にして、準備したガラススライドにフィルターを移す。 〜50〜100μLの包埋培地でマウントする。長さ60mmの1.5号カバースリップで覆う。包埋媒体溶液を暗所で室温で2時間固化させる。イメージングに進むか、フォイルに包まれたスライドを4°Cで画像化するまで保存します。
9. 広視野落射顕微鏡^{7 <}（励起帯域、460〜495nm;二色性鏡、505nm、および発光バンドパス、510〜550nm）および20X Plan-Apochromatレンズ、0.75数値絞り。

結果

Metanephric kidney anlagenは、E11.5で妊娠したBlack-6近交系マウスに由来し、培養した。 3日後、尿管芽は5回まで分岐し、最初はT字型の尿管芽が分岐した。各外植片を撮影し、分節世代を決定し、分枝あたりのエンドポイントの数を計算するために、セグメントおよびエンドポイントの数を定量化した（ 図1 ）。 ImageJ（ ^rd世代;第4世代は、移植外植片の?...

ディスカッション

この写本は、発達中のメタネフリカのanlagenをマウスの胚から単離し、器官を培養する方法を記述しています。この方法は、Grobstein ⁸とSaxén9,10によって開発された標準的な手法であり、多くの他者^11,12によって適応され、変更されています。この方法の成功は、主に、外植片の生存および誘導電位の低下が切開時間の延長に伴う切開の持続時間に依存する。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E