דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ו culturing raniments metanephric מעוברים העכבר.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה הוא לתאר שיטה לנתיחה, בידוד, ותרבות של עכברים metanephric עכבר.

במהלך התפתחות הכליות של היונקים, שני רקמות האב, הניצן השופכן והמטנפיך המזנכי, מתקשרים ומפעילים מנגנונים סלולריים כדי ליצור בסופו של דבר את מערכת האיסוף ואת הנפרונים של הכליה. כמו עוברי יונקים לגדול תוך הרחם ולכן הם בלתי נגישים הצופה, תרבות איבר פותחה. בשיטה זו, ניתן ללמוד אינטראקציות אפיתל- mesenchymal והתנהגות הסלולר במהלך כליה אורגנוזה. יתר על כן, מקורם של כליות מולדות ומומים פגומים בדרכי השתן. לאחר דיסקציה זהיר, את metanphric rudiments מועברים על מסנן כי צף על המדיום תרבות והוא יכול להישמר בתרבות החממה לתא במשך מספר ימים. עם זאת, צריך להיות מודע לכך התנאיםמלאכותי יכול להשפיע על חילוף החומרים ברקמות. כמו כן, החדירה של חומרי הבדיקה יכול להיות מוגבל בשל המטריצה ​​תאיים וממברנה קרום הנוכחי אקספלנט.

אחד היתרונות העיקריים של תרבות האיברים הוא שהניסויים יכולים לקבל גישה ישירה לאורגן. טכנולוגיה זו היא זולה, פשוטה, ומאפשרת מספר רב של שינויים, כגון הוספת חומרים פעילים ביולוגית, מחקר של גרסאות גנטיות, ויישום טכניקות הדמיה מתקדמות.

Introduction

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

Protocol

עכברים נשמרו על פי תקנות שוודית החקיקה של האיחוד האירופי (2010/63 / האיחוד האירופי). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה השבדית (מתירים C79 / 9, C248 / 11 ו- C135 / 14). ההליכים באוניברסיטת היידלברג בהשתתפות נושאי בעלי חיים אושרו על ידי קארלסרוהה Regierungspräsidium וקציני רווחת בעלי חיים באוניברסיטת היידלברג.

1. הכנת חומרים כימיים וחומרים לתרבות

הערה: השתמש ברדס זרימה למינרית כדי למזער זיהום.

1. ביום של דיסקציה, מראש אשכול האדם Fc לבד או רקומביננטי chimeric חלבון אפרין התמזגו כדי Fc האדם על ידי ערבוב זה עם נוגדנים Fc אנטי אנושי נגד יחס טוחנת של 1: 5 ב פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS). לדגור על 1 שעה ב 37 ° C ⁵ .
2. הכינו את המדיום התרבות על ידי השלמת Dulbecco השתנה של הנשר בינוני: מזיןתערובת F-12 (DMEM / F12) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין (v / v), 1% גלוטמין (v / v), 1% אינסולין טרנספרין סלניום (v / v), 50 מיקרוגרם / Transrin, ו 1.5 מיקרוגרם / mL amphotericin.
   הערה: 10 מ"ל של המדיום מספיק עבור 16 עוברי.
3. הוסף אשכולות רקומביננטי פתרון אפרין בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​למדיום התרבות. השתמש Fc אנושי אשכולות כמו שליטה.
4. הכינו צלחות תרבות על ידי הוספת 500 μL של המדיום תרבות היטב כל של צלחת סטרילי, ללא ציפוי, צלחת שטוחה 4-היטב קלקר סטרילי.
5. בעזרת מלקחיים סטרילית, בזהירות במקום אחד מסנן קרום פוליקרבונט עם גודל הנקבוביות של 5 מיקרומטר לכל היטב על גבי המדיום. מעבירים את הצלחת מוכנה האינקובטור (37 ° C / 5% CO ₂ ). ודא כי המסנן נשאר יבש על פני השטח העליון צף.
   הערה: מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות.
6. באמצעות סכין גילוח, לחתוך כ -30 טיפים פיפטה (נפח: 100 μL) approximatelY 1 מ"מ מהקצה כדי לגרום לפתיחה רחבה יותר. מניחים את הטיפים בחזרה לתוך מתלה פיפטה קצה.

2. ניסוי של יסודות Metanephric ב E11.5

1. להקריב עכבר מתוזמן בהריון E11.5 על ידי נקע צוואר הרחם (או באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית).
2. הסר את הרחם ואת העוברים, כפי שתואר על ידי Brown et al ⁶ . מנקודה זו קדימה, לעבוד תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
3. באמצעות מס '5 מלקחיים שען, לחתוך את העובר ישירות מתחת הקדמי. השתמש בצלחת פטרי טרי כל העובר. הסר את הרגליים ואת זנב העובר. כדי לעשות זאת, לתפוס את הרקמה כדי להסיר עם זוג אחד של מלקחיים מס '5 שען להשתמש בעצות של זוג השני לחתוך.
4. כדי להסיר את מסת האיבר הגחון, השתמש בעצות של מלקחיים כדי לפתוח את דופן הגוף של העובר בכיוון מקורי אל הזנב.
   1. גזור באופן שטחי, במקביל tהוא אבי העורקים הגבי. השתמש אבי העורקים הגבי, ולכן גלוי לעין עבור כיוון. בזהירות להפריד את החלק הגחון של קיר הגוף מהחלק הגבי באמצעות קצות מלקחיים סגורים להעיף את העובר מעל. חותכים את דופן הגוף לרוחב בכיוון מקורי אל הזנב באמצעות אבי העורקים הגבי עבור אוריינטציה, כמו בצד הקודם.
5. לאחר קיר הגוף הגחון הופרד מהגוף הגבי, לתפוס אותו עם זוג אחד של מלקחיים בזהירות למשוך כדי להסיר אותו, יחד עם מסת האיבר.
   הערה: metanphric anlagen בדרך כלל להישאר מחובר לקיר הגוף הגבי. הם אליפסה, ~ 200 מיקרומטר מבנים ארוכים הממוקמים ברמה של הגפיים האחוריות.
6. החזק את דופן הגוף הגב עם זוג אחד של מלקחיים, עם הצד הגחון פונה כלפי מעלה. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, לתפוס את אבי העורקים הגבי על קצה מקורי שלה בזהירות לקלף את אבי העורקים הגבי מן הקיר הגוף הגבי.
   הערה: שתי הכליות metanphric בדרך כלל להישאר מצורףאד לאבי העורקים הגבי.
7. באמצעות זוג אחד של מלקחיים, לחתוך rostrally כדי anlagen הכליות כדי להסיר את אבי העורקים. לאחר מכן, בזהירות להפריד את שתי הכליות anlagen באמצעות קצות המלקחיים.
8. בזהירות לקלף את רקמות לא רצויות מן anlagen הכליות באמצעות קצות המלקחיים. הקפד לא לפגוע מזנכימה, כמו נזק יכול לגרום לצמיחה גרועה והדרה של explant מניתוח נוסף.
9. מעבירים את הכליה anlagen בנפרד באמצעות פיפטה microliter ואת קצה פתוח פיפטה פתוח μL 10 של PBS כדי מסנן קרום פוליקרבונט בצלחת 4-היטב.
   הערה: בשל מתח הפנים, האקספלנט יכוסה בשכבה דקה של מדיום. מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות.
   1. מניחים כל אחד משני anlagen הכליות במרכז של כל מחצית בהתאמה של המסנן. מעבירים את הצלחת בחזרה לחממה ב 37 ° C / 5% CO ₂ . להשאיר את הצלחת בחממה עד רוד metanphricIments מן העובר הבא מוכנים להיות ממוקם על המסנן.
10. חזור על שלבים 2.3-2.9.1 עבור כל עוברי.
    הערה: עם קצת תרגול, הליך לנתיחה ייקח בערך 5 דקות לכל עובר.
11. דגירה anlagen הכליות במשך 3 ימים ב 37 ° C / 5% CO ₂ .

3. הכנה של ריאגנטים עבור קיבוע מכתים

1. כדי להכין paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS ללא סידן ומגנזיום (w / V), להמיס את PFA ב 60 מעלות צלזיוס ב PBS, ערבוב מתמיד. מגניב לטמפרטורת החדר ולהשתמש במסנן נייר כדי להסיר את החלקיקים הנותרים. Aliquot ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מיידי או להקפיא אחסון לטווח ארוך.
   זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש את הציוד מגן אישי המפורטים בתקני הבטיחות המקומי ולעבוד במנדף קטר. בטל פסולת בעקבות הנחיות מוסדיות ושימוש במיכלי פסולת ייעודיים.
2. כדי להכין פתרון permeabilization, לדלל טריטון X-100ב- PBS ללא סידן ומגנזיום ל- 0.3% (v / v).
3. כדי להכין פתרון חסימה, הוסף 5% (v / v) בסרום עז ו 0.1% Triton X-100 ל- PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף אזיד נתרן לריכוז סופי של 0.02% (w / v). חנות ב 4 ° C.
   זהירות: סודיום אזיד הוא רעיל. טיפול בנזיד נתרן בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה.
   הערה: בעת שימוש נוגדנים עבור מכתים, להשתמש בסרום 5% מן המין מי נוגדנים משני נגזר כדי להפוך פתרון חסימה.
4. לדלל biichinylated Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 ב חסימת פתרון. מדולל Alexa488-streptavidin מצומדות 1: 200 פתרון חסימה.
5. מוסיפים 0.1 גרם של פוליפוניל מסיסים במים, המבוססים על אלכוהול, על בסיס Mucoadhesive / mL ל- 25% (w / v) גליצרול ב 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) . מחממים ל 50 מעלות צלזיוס תחת תסיסה רציפה במשך שעה 1, להתקרר, ולהתאים את ה- pH 8.0-8.5 באמצעות 1M NaOH. הימנע ריכוז גבוה NaOH. הוסף 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​N- propylgallate ו thimerosal לריכוז סופי של 0.02% (w / v). מערבבים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   זהירות: Thimerosal הוא רעיל. טפל בה בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה.
   1. ממלאים את המדידה הטבעה צינורות 50 מ"ל, לאזן את הרוטור, צנטריפוגה ב 3,200 xg וטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוציאים את הפתרון הברור לתוך צינורות 15 מ"ל וזורקים את גלולה. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. פעם מופשר, לשמור על הפתרון ב 4 ° C. חם עד 30 ° C מיד לפני השימוש.
6. הכינו כמו שקופיות זכוכית רבים כמו מסננים עם explants הם להיות מותקן. בשביל זה, דבק שני coverslips קטן, 18 x 18 מ"מ, משני צדי השקופית זכוכית באמצעות דבק מיידיות, השאירו שטח ~ 15 מ"מ עבור המסנן בין.

4. קיבוע ו מכתים

1. לאחר תקופת תרבויות של 3ימים במבחנה (div), להסיר את הצלחות מן האינקובטור בזהירות לשאוב את המדיום תרבות מכל היטב באמצעות micropipette. הקפד לא לגעת במסנן ולשמור את קצה הפתיחה לעבר הקיר של הבאר.
2. הוסף 500 μL של PFA 4% / PBS לכל טוב. מסננים יהיה לצוף על מקבע. באמצעות micropipette, בזהירות להוסיף את dropwise מקבע PFA להטביע את המסננים. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   הערה: עבור כל השלבים הבאים, יש להקפיד לא לשטוף את explants מהמסנן. שמור על פתיחת קצה פיפטה לכיוון הקיר של הבאר.
3. הסר את PFA ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS, שקוע המסנן. הוסף 500 μL של פתרון permeabilization היטב כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
4. לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS ולהוסיף 500 μL של פתרון חסימה היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
5. החלף את פתרון החסימה באמצעות250 μL של biichinated Dolichorus ביפלורוס agglutinin מדולל 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
6. הסר את הפתרון dichichorus biflorus agglutinin ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב.
7. הוסף 250 μL של streptavidin Alexa488 מצומדות בדילול 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לחלופין, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
   הערה: יחס אות טוב יותר לרעש מושגת כאשר מודגרת ב 4 ° C.
8. לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב. באמצעות מלקחיים, להעביר את המסננים על שקופיות זכוכית מוכן, עם explants פונה כלפי מעלה. הר עם ~ 50-100 μL של המדידה הטבעה. מכסים עם 60 מ"מ אורך מס '1.5 coverslips. אפשר פתרון בינוני הטבעה כדי לחזק במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. המשך לדמיה או לאחסן את השקופיות, עטוף בנייר כסף, ב 4 ° C עד מוכן התמונה.
9. תמונה עם מיקרוסקופ epifluorescence widefield ^{7 <}/ Sup> מצמידים למנורת Hg ולהשתמש ביחידת מראה עבור עירור כחול (bandpass עירור, 460 - 495 ננומטר, מראה dichromatic, 505 ננומטר, ו bandpass פליטה, 510 - 550 ננומטר) ו 20x עדשות תוכנית אפוכרומט, 0.75 נומרית צוֹהַר.

תוצאות

כליות metanphric כליות נגזרו עכברים בהריון שחור -6 inbred ב E11.5 ו היו מתורבתים. לאחר 3 ימים, הניצן השופכן הסתעף עד 5 פעמים, וכתוצאה מכך ההשלכה של ניצן טנטורי בצורת T בתחילה. כל אקספלנט צולם, ומספרי המקטעים ונקודות הקצה נמדדו כדי לקבוע את הדורות המסתעפים ולחשב את ...

Discussion

כתב יד זה מתאר שיטה לבודד את metanphric anlagen המתפתח מעובר העכבר ולתרבות את יסודות האורגן. שיטה זו היא טכניקה סטנדרטית, כפי שפותחה על ידי Grobstein ⁸ ו Saxén ^{9 , 10} , ו הותאם ו שונה על ידי רבים אחרים ^{11 , 12} . ההצל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E