Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e coltivare rudimenti metanufricani da embrioni di topo.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per la dissezione, l'isolamento e la cultura dei rudimenti metanofili del mouse.

Durante lo sviluppo del rene dei mammiferi, i due tessuti progenitrici, il germoglio ureterico e il mesenchim metanufrico, comunicano e reciprocamente inducono meccanismi cellulari per formare eventualmente il sistema di raccolta e i nefroni del rene. Poiché gli embrioni di mammiferi crescono intrauterini e pertanto sono inaccessibili all'osservatore, è stata sviluppata una cultura dell'organo. Con questo metodo è possibile studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali e il comportamento cellulare durante l'organogenesi renale. Inoltre, l'origine di malformazioni del rene congenito e delle vie urogenitali può essere studiata. Dopo un'attenta dissezione, i rudimenti metanufricani vengono trasferiti su un filtro che galleggia sul mezzo di coltura e può essere mantenuto in un incubatore di colture di cellule per diversi giorni. Tuttavia, bisogna essere consapevoli che le condizioni sonoArtificiale e potrebbe influenzare il metabolismo nel tessuto. Inoltre, la penetrazione delle sostanze di prova potrebbe essere limitata a causa della matrice extracellulare e della membrana basale presente nell'esplosivo.

Un vantaggio principale della cultura dell'organo è che lo sperimentatore può ottenere l'accesso diretto all'organo. Questa tecnologia è economica, semplice e consente un gran numero di modifiche, come l'aggiunta di sostanze biologicamente attive, lo studio delle varianti genetiche e l'applicazione di tecniche di imaging avanzate.

Introduzione

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

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Protocollo

I topi sono stati mantenuti secondo la normativa svedese e la legislazione dell'Unione europea (2010/63 / UE). Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida del comitato etico svedese (autorizza C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Le procedure presso l'Università di Heidelberg che coinvolgono soggetti di origine animale sono stati approvati dal Regierungspräsidium Karlsruhe e dagli Ufficiali di Benessere degli animali presso l'Università di Heidelberg.

1. Preparazione di reagenti e materiali per la cultura

NOTA: utilizzare una cappa a flusso laminare per ridurre al minimo la contaminazione.

1. Nel giorno della dissezione, pre-cluster Fc umano solo o ricombinante proteina chimerica efrina fusa con Fc umana mescolandola con anticorpi caprini anti-umani Fc a un rapporto molare di 1: 5 in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Incubare per 1 ora a 37 ° C ⁵ .
2. Preparare il mezzo di coltura integrando il Modified Eagle Medium di Dulbecco: NutrienteLa miscela F-12 (DMEM / F12) con 1% di penicillina / streptomicina (v / v), 1% di glutammina (v / v), 1% di insulina transferrin-selenio (v / v), 50μg / Transferrin e 1,5 μg / mL di amfotericina.
   NOTA: 10 ml di terreno è sufficiente per 16 embrioni.
3. Aggiungere una soluzione efrina ricombinata raggruppata a una concentrazione finale di 20 μg / mL al terreno di coltura. Usa Fc umano cluster come controllo.
4. Preparare le piastre di coltura aggiungendo 500 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti in polistirolo sterile e non rivestita.
5. Utilizzando pinze sterili, posizionare con cura un filtro a membrana in policarbonato con una dimensione di pori di 5 μm per pozzetto in cima al mezzo. Trasferire la piastra preparata all'incubatore (37 ° C / 5% CO ₂ ). Assicurarsi che il filtro rimanga asciutto sulla superficie superiore e fluttua.
   NOTA: Un filtro è sufficiente per due anlagen renali.
6. Usando una lama di rasoio, tagliare circa 30 punte pipetta (volume: 100 μL) approssimativamenteY 1 mm dalla punta per provocare un'ampia apertura. Riposizionare le punte in un rack di pipetta.

2. Dissezione dei Rudiments di Metanephric a E11.5

1. Sacrificare un mouse in gravidanza a E11.5 con dislocazione cervicale (o utilizzando un metodo approvato dal comitato etico locale).
2. Rimuovere l'utero e gli embrioni, come descritto da Brown e altri ⁶ . Da questo punto in avanti, lavorare sotto un microscopio di dissezione.
3. Usando la pinza da orologeria n. 5, tagliate l'embrione direttamente sotto i piedini anteriori. Usa un piatto di Petri fresco per ogni embrione. Rimuovere le gambe e la coda dell'embrione. Per fare questo, afferrare il tessuto da rimuovere con una coppia di pinze da orologeria n. 5 e utilizzare le punte di una seconda coppia da tagliare.
4. Per rimuovere la massa degli organi ventrali, utilizzare le punte di una coppia di pinze per aprire lateralmente la parete del corpo dell'embrione in una direzione rostrale-caudale.
   1. Tagliare superficialmente, parallelo a tL'aorta dorsale. Utilizzare l'aorta dorsale piena di sangue e quindi visibile per orientarsi. Separare con cautela la parte ventrale della parete del corpo dalla parte dorsale utilizzando le punte delle pinze chiuse e far girare l'embrione. Tagliare lateralmente la parete del corpo in una direzione rostrale-caudale e utilizzare l'aorta dorsale per l'orientamento, come per il lato precedente.
5. Una volta che la parete ventrale del corpo è stata separata dal corpo dorsale, afferrarlo con una coppia di pinze e tirare attentamente per rimuoverla insieme alla massa dell'organo.
   NOTA: L'anlagen di metanufricoltura di solito rimane attaccato alla parete del corpo dorsale. Sono strutture ovali, ~ 200 μm situate a livello degli arti posteriori.
6. Tenere la parete del corpo dorsale con una coppia di pinze, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Utilizzando l'altra coppia di pinze, afferrare l'aorta dorsale alla sua estremità rostrale e sbucchiare attentamente l'aorta dorsale dalla parete del corpo dorsale.
   NOTA: entrambi i reni metanfricari di solito rimangono attaccatiL'aorta dorsale.
7. Usando una coppia di pinze, tagliare rostrally al rene anlagen per rimuovere l'aorta. Quindi, separare con attenzione i due anlagen renali utilizzando le punte delle pinze.
8. Scorri con cautela il tessuto indesiderato dal rene anlagen usando le punte delle pinze. Fare attenzione a non danneggiare il mesenchima, in quanto i danni possono provocare una scarsa crescita ed escludere l'esplante dall'ulteriore analisi.
9. Trasferire separatamente il rene anlagen usando una pipetta di microlitro e una punta di pipetta ampiamente aperta in 10 μL di PBS al filtro a membrana in policarbonato in una piastra a 4 pozzetti.
   NOTA: a causa della tensione superficiale, l'esplante sarà coperto con uno strato sottile di media. Un filtro è sufficiente per due anlagen renale.
   1. Posizionare ciascuno dei due anlagen al centro di ciascuna rispettiva metà del filtro. Trasferire la piastra all'incubatore a 37 ° C / 5% CO ₂ . Lasciare la piastra nell'incubatrice finché non si avvicina il metanufricoLe imitazioni dell'embrione successivo sono pronte per essere poste sul filtro.
10. Ripetere i passaggi 2.3-2.9.1 per ogni embrione.
    NOTA: con una certa pratica, la procedura di dissezione richiederà circa 5 minuti per embrione.
11. Incubare il rene anlagen per 3 giorni a 37 ° C / 5% CO ₂ .

3. Preparazione dei reagenti per la fissazione e la colorazione

1. Per preparare 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS senza calcio e magnesio (p / v), sciogliere il PFA a 60 ° C in PBS, continuando a mescolare. Riscaldare a temperatura ambiente e utilizzare un filtro di carta per rimuovere le particelle rimanenti. Aliquota e conservare a 4 ° C per uso immediato o congelare per l'immagazzinamento a lungo termine.
   ATTENZIONE: PFA è tossico. Indossare l'attrezzatura di protezione individuale specificata negli standard locali di sicurezza e lavorare in una cappa di fumo. Scartare i rifiuti seguendo le linee guida istituzionali e utilizzare contenitori di rifiuti designati.
2. Per preparare la soluzione di permeabilizzazione, diluire Triton X-100In PBS senza calcio e magnesio allo 0,3% (v / v).
3. Per preparare la soluzione di blocco, aggiungere il siero di capra del 5% (v / v) e lo 0,1% di Triton X-100 a PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere azidi di sodio ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v). Conservare a 4 ° C.
   ATTENZIONE: l'azido di sodio è tossico. Maneggiare l'azide di sodio in conformità alle normative locali in materia di sicurezza e ambiente.
   NOTA: quando si utilizzano anticorpi per la colorazione, utilizzare il siero del 5% della specie che è stato derivato dall'anticorpo secondario per realizzare una soluzione di blocco.
4. Diluire l'agglutinina Dolichorus biflorus biotinilata 1: 200 in soluzione di blocco. Diluire streptavidina coniugata Alexa488 1: 200 in soluzione di blocco.
5. Per ottenere il mezzo di incisione pronto per l'uso (vedere la tabella dei materiali), aggiungere 0,1 g di glicerolo al 25% (w / v) in 0,1 m di Tris-HCl (pH 8,5) . Riscaldare a 50 ° C sotto agitazione continua per 1 h, raffreddare e regolare il pH a 8.0-8.5 usando 1M NaOH. Evitare concentrazioni più elevate di NaOH. Aggiungere 100 μg / mL N-propilgallato e timerosale ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v). Mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Thimerosal è tossico. Maneggiarlo conformemente alle normative locali in materia di sicurezza e ambiente.
   1. Riempire il supporto di incorporazione in tubi da 50 ml, bilanciare il rotore e centrifugare a 3.200 xg e la temperatura ambiente per 10 min. Decantare la soluzione chiara in 15 mL tubi e scartare il pellet. Aliquota e conservare a -20 ° C per diverse settimane. Una volta scongelata, mantenere la soluzione a 4 ° C. Riscaldare a ~ 30 ° C immediatamente prima dell'uso.
6. Preparare il maggior numero di diapositive in vetro come filtri con esplanti. Per questo, incollare due piccole copertine, 18 x 18 mm, su entrambi i lati del vetrino con l'adesivo istantaneo, lasciare uno spazio di circa 15 mm per il filtro.

4. Fissazione e colorazione

1. Dopo un periodo di coltura di 3Giorni in vitro (div), togliere le piastre dall'incubatore e aspirare attentamente il mezzo di coltura da ciascun pozzetto utilizzando una micropipetta. Assicurarsi di non toccare il filtro e mantenerla aperta verso la parete del pozzetto.
2. Aggiungere 500 μl di 4% di PFA / PBS a ciascun pozzetto. I filtri galleggiano sul fissativo. Utilizzando una micropipetta, aggiungete con cautela il fissativo PFA per sottomettere i filtri. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   NOTA: Per tutte le fasi successive, occorre prestare attenzione a non lavare le esplosioni dal filtro. Tenere l'apertura della punta della pipetta verso la parete del pozzetto.
3. Rimuovere il PFA e risciacquare due volte con 500 μl di PBS, sommersando il filtro. Aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di permeabilizzazione e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
4. Sciacquare due volte con 500 μl di PBS e aggiungere a ciascun pozzetto 500 μL di soluzione di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
5. Sostituire la soluzione di blocco con250 μl di agglutinina biflorus biotinilata Dolichorus diluita 1: 200 in soluzione di blocco e incubare a 4 ° C per 24 ore.
6. Rimuovere la soluzione di agglutinina Doliforum biflorus e risciacquare due volte con 500 μL di PBS per pozzetto.
7. Aggiungere 250 μL di streptavidina coniugata con Alexa488, diluita 1: 200 in soluzione di blocco e incubare a 4 ° C per 24 ore. In alternativa, incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
   NOTA: si ottiene un migliore rapporto segnale-rumore quando incubato a 4 ° C.
8. Sciacquare due volte con 500 μl di PBS per pozzetto. Utilizzando la pinza, trasferire i filtri sulle vetrate preparate, con gli esplanti rivolti verso l'alto. Montare con ~ 50-100 μL di supporto incorporante. Copertura con coperchio da 1,5 mm di lunghezza da 60 mm. Lasciare che la soluzione di media incorporante si solidifichi per 2 ore a temperatura ambiente al buio. Procedere all'immagine o conservare le diapositive, avvolte in fogli, a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'immagine.
9. Immagine con un ampio campo di epifluorescenza microscopio ^{7 <}/ Sup> accoppiato ad una lampada Hg e utilizzare una unità a specchio per eccitazione blu (banda di eccitazione, 460 - 495 nm, specchio bicromato, 505 nm e banda di emissione, 510 - 550 nm) e 20x Plan-Apochromat lenti, 0,75 numeri apertura.

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Risultati

L'anlagen renale metanico è stato derivati ​​da topi in gravidanza Black-6 in E11.5 e sono stati coltivati. Dopo 3 giorni, il germoglio ureterico era ramificato fino a 5 volte, con conseguente ramificazione del germoglio uretrico inizialmente a forma di T. Ogni esplante è stato fotografato e il numero di segmenti e endpoint è stato quantificato per determinare le generazioni di ramificazione e per calcolare il numero di endpoint per ramo ( Figura 1 ). ImageJ (...

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Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo per isolare l'anlagen metanofrico in sviluppo dall'embrione del topo e per coltivare i rudimenti degli organi. Questo metodo è una tecnica standard, come sviluppato da Grobstein ⁸ e Saxén ^{9 , 10} ed è stato adattato e modificato da molti altri ^{11 , 12} . Il successo del metodo dipende principalmente dalla durata della dissezione, in q...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E