Диссекция и культура мышей эмбриональной почки

Резюме

Этот протокол описывает метод выделения и культивирования метанефрических зачатков из эмбрионов мыши.

Аннотация

Цель этого протокола - описать метод вскрытия, выделения и культивирования метанефрических рудиментов мыши.

Во время развития почки млекопитающих две ткани-предшественники, уретеровая почка и метанефрическая мезенхима, общаются и взаимно индуцируют клеточные механизмы, чтобы в конечном итоге сформировать систему сбора и нефроны почки. Поскольку эмбрионы млекопитающих растут внутриутробно и поэтому недоступны для наблюдателя, была разработана культура органов. С помощью этого метода можно изучать эпителиально-мезенхимальные взаимодействия и клеточное поведение во время органогенеза почек. Кроме того, можно исследовать происхождение врожденных пороков развития почек и урогенитального тракта. После тщательного вскрытия метанефрические рудименты переносятся на фильтр, который плавает на питательной среде и может храниться в инкубаторе для культивирования клеток в течение нескольких дней. Однако необходимо знать, что условияИскусственно и может влиять на обмен веществ в ткани. Кроме того, проникновение испытываемых веществ может быть ограничено из-за внеклеточного матрикса и базальной мембраны, присутствующих в эксплантате.

Одним из главных преимуществ органной культуры является то, что экспериментатор может получить прямой доступ к органу. Эта технология дешевая, простая и допускает большое количество модификаций, таких как добавление биологически активных веществ, изучение генетических вариантов и применение передовых методов визуализации.

Введение

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis.

In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate¹. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Saxén, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish¹. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Saxén's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.

Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior².

In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct³. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer⁴. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips³.

протокол

Мышей поддерживали в соответствии с законодательством Швеции и законодательством Европейского Союза (2010/63 / ЕС). Все процедуры были выполнены в соответствии с указаниями Шведского комитета по этике (разрешения C79 / 9, C248 / 11 и C135 / 14). Процедуры в Гейдельбергском университете по животным предметам были одобрены Regierungspräsidium Karlsruhe и сотрудниками отдела охраны животных в Гейдельбергском университете.

1. Подготовка реагентов и материалов для культуры

ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте ламинарный вытяжной колпак, чтобы свести к минимуму загрязнение.

1. В день диссекции один только Fc-кластер докомплекса или рекомбинантный химерный белок эфрина сливают с Fc человека путем его смешивания с антителами против козьего антитела Fc человека при молярном соотношении 1: 5 в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS). Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С. ⁵ .
2. Подготовить культуральную среду путем добавления модифицированной Дульбекко среды Игла: питательныйСмесь F-12 (DMEM / F12) с 1% пенициллина / стрептомицина (об. / Об.), 1% глутамина (об. / Об.), 1% инсулинтрансрин-селена (об. / Об.), Трансферрин и 1,5 мкг / мл амфотерицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мл среды достаточно для 16 эмбрионов.
3. Добавить кластерный рекомбинантный раствор эфрина в конечной концентрации 20 мкг / мл в культуральную среду. Используйте кластерный человеческий Fc в качестве контроля.
4. Приготовьте культуральные планшеты, добавив 500 мкл культуральной среды в каждую лунку стерильной 4-луночной планшеты с бесстолбным плоским дном из полистирола.
5. Используя стерильные щипцы, аккуратно поместите один поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 5 мкм на лунку сверху среды. Перенесите подготовленную пластину в инкубатор (37 ° C / 5% CO ₂ ). Убедитесь, что фильтр остается сухим на верхней поверхности и плавает.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Один фильтр достаточно для двух почек анлагена.
6. Используя лезвие бритвы, разрежьте приблизительно 30 наконечников пипетки (объем: 100 мкл) приблизительноY 1 мм от наконечника, чтобы получить более широкое отверстие. Поместите наконечники обратно в стойку для пипеток.

2. Пресечение метанефрических рудиментов на E11.5

1. Пожертвуйте беременную мышей с задержкой в ​​E11.5 путем вывиха шейки матки (или используя метод, одобренный местным комитетом по этике).
2. Удалите матку и эмбрионы, как описано Брауном и соавторами ⁶ . С этого момента вперед, работа под микроскопом рассечения.
3. Используя щипцы для часовщика № 5, разрежьте эмбрион прямо под передними ногами. Используйте свежие чашки Петри для каждого эмбриона. Удалите ноги и хвост эмбриона. Для этого возьмите ткань, которую нужно удалить, с помощью одной пары пинцет-часовщиков № 5 и используйте концы второй пары для разрезания.
4. Чтобы удалить массу вентрального органа, используйте кончики пары пинцет для бокового открытия стенки тела эмбриона в рострально-каудальном направлении.
   1. Вырезать поверхностно, параллельно tОн спинной аорты. Для ориентации используйте заполненную кровью и, следовательно, видимую дорсальную аорту. Тщательно отделите брюшную часть стенки тела от дорсальной части, используя кончики закрытых щипцов и переверните эмбрион. Вырезать стенку тела латерально в направлении от рострального к каудальному и использовать спинную аорту для ориентации, как и для предыдущей стороны.
5. Как только брюшная стенка тела была отделена от спинного тела, возьмите ее одной парой щипцов и осторожно потяните, чтобы удалить ее, вместе с массой органа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: метанефрический анлаген обычно остается прикрепленным к дорсальной стенке тела. Это овальные, ~ 200 мкм длинные структуры, расположенные на уровне задних конечностей.
6. Держите спинной корпус тела с одной парой щипцов, с вентральной стороной вверх. Используя другую пару щипцов, захватите дорсальную аорту у ее рострального конца и осторожно отделите дорсальную аорту от дорсальной стенки тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Обе метанефрические почки обычно остаются прикрепленнымиНа спинной аорте.
7. Используя одну пару щипцов, отрежьте рострально к почковому анлагену, чтобы удалить аорту. Затем аккуратно отделите два почек анлагена, используя кончики щипцов.
8. Тщательно очистите ненужную ткань от почек, используя кончики щипцов. Будьте осторожны, чтобы не повредить мезенхиму, так как повреждение может привести к неудовлетворительному росту и исключению эксплантата из дальнейшего анализа.
9. Перенесите почечный анлаген отдельно с помощью пипетки микролитра и широко открытого наконечника пипетки в 10 мкл PBS к фильтру из поликарбонатной мембраны в 4-луночном планшете.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за поверхностного натяжения эксплантат будет покрыт тонким слоем среды. Одного фильтра достаточно для двух почек-анлагена.
   1. Поместите каждый из двух почек anlagen в центре каждой соответствующей половины фильтра. Перенесите пластину обратно в инкубатор при 37 ° C / 5% CO ₂ . Оставить планшет в инкубаторе до метанефрического рудникаИмплантаты со следующего эмбриона готовы для размещения на фильтре.
10. Повторите шаги 2.3-2.9.1 для каждого эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При некоторой практике процедура вскрытия займет примерно 5 минут на эмбрион.
11. Инкубируйте почечный анлаген в течение 3 дней при 37 ° C / 5% CO ₂ .

3. Приготовление реагентов для фиксации и окрашивания

1. Для приготовления 4% параформальдегида (PFA) в PBS без кальция и магния (мас. / Об.) Растворяют PFA при 60 ° C в PBS, непрерывно помешивая. Остудите до комнатной температуры и используйте бумажный фильтр для удаления оставшихся частиц. Алиготе и держать при 4 ° C для немедленного использования или замораживания для длительного хранения.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Надевайте средства индивидуальной защиты, указанные в местных нормах безопасности, и работайте в вытяжном шкафу. Откажитесь от отходов в соответствии с установленными правилами и использованием специально предназначенных контейнеров для отходов.
2. Для приготовления раствора для проницаемости разбавляют Triton X-100В PBS без кальция и магния до 0,3% (об. / Об.).
3. Для приготовления блокирующего раствора добавьте 5% (об. / Об.) Козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100 в PBS без кальция и магния. Добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,02% (мас. / Об.). Хранить при температуре 4 ° C.
   Осторожно: азид натрия токсичен. Обрабатывать азид натрия в соответствии с местными правилами безопасности и охраны окружающей среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании антител для окрашивания используйте 5% сыворотки от вида, из которого было получено вторичное антитело, чтобы получить блокирующий раствор.
4. Разбавьте биотинилированный Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 в блокирующем растворе. Разбавляют Alexa488-конъюгированный стрептавидин 1: 200 в блокирующем растворе.
5. Для приготовления готовой к употреблению среды для вливания (см. Таблицу материалов) добавьте 0,1 г водорастворимого мукоадгезивного материала на основе поливинилового спирта к 25% (вес / объем) глицерина в 0,1 М Трис-HCl (pH 8,5) , Нагревают до 50 ° С при непрерывном перемешивании в течение 1 часа, охлаждают и доводят рН до 8,0-8,5, используя 1M NaOH. Избегайте более высоких концентраций NaOH. Добавить 100 мкг / мл N-пропилгаллата и тимеросал до конечной концентрации 0,02% (мас. / Об.). Перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре.
   ОСТОРОЖНО: Тимеросал токсичен. Обращайтесь с ним в соответствии с местными правилами техники безопасности и охраны окружающей среды.
   1. Заполните среду для заливки в пробирки по 50 мл, установите баланс ротора и центрифугируйте при 3200 xg и комнатную температуру на 10 мин. Декантируйте прозрачный раствор в 15 мл пробирки и выбросьте гранулу. Аликвоту и хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких недель. После оттаивания держите раствор при 4 ° C. Теплый до ~ 30 ° C непосредственно перед использованием.
6. Подготовьте столько же стеклянных горок, сколько будут установлены фильтры с эксплантами. Для этого приклейте два небольших покровных стекла размером 18 x 18 мм с обеих сторон стеклянного слайда, используя мгновенный клей. Оставьте пространство на 15 мм для фильтра между ними.

4. Фиксация и окрашивание

1. После периода культивирования 3Дней в пробирке (div), удалите пластины из инкубатора и тщательно аспирируйте культуральную среду из каждой лунки с помощью микропипетки. Не прикасайтесь к фильтру и держите его в направлении стенки колодца.
2. Добавить 500 мкл 4% PFA / PBS в каждую лунку. Фильтры будут плавать на фиксаторе. С помощью микропипетки осторожно добавьте фиксатор PFA по каплям, чтобы погрузить фильтры. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ. На всех последующих этапах следует соблюдать осторожность, чтобы не смыть эксплантаты с фильтра. Держите отверстие наконечника пипетки к стене колодца.
3. Удалить PFA и промыть дважды с 500 мкл PBS, погружая фильтр. Добавить 500 мкл раствора для пермеабилизации в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
4. Промойте дважды 500 мкл PBS и добавьте 500 мкл блокирующего раствора в каждую лунку. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
5. Замените блокирующий раствор на250 мкл биотинилированного Dolichorus biflorus agglutinin, разведенного 1: 200 в блокирующем растворе, и инкубируют при 4 ° C в течение 24 часов.
6. Удалить раствор Dolchorus biflorus agglutinin и дважды промыть 500 мкл PBS на лунку.
7. Добавьте 250 мкл конъюгированного с Alexa488 стрептавидина, разбавленного 1: 200, в блокирующий раствор и инкубируйте при 4 ° C в течение 24 часов. Альтернативно, инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Лучшее соотношение сигнал / шум достигается при инкубации при 4 ° C.
8. Промойте дважды с 500 мкл PBS на лунку. Используя щипцы, перенесите фильтры на подготовленные стеклянные слайды, с эксплантатами вверх. Смонтируйте с ~ 50-100 мкл среды для заливки. Покрытие с покровными стеклами № 1,5 длиной 1,5 мм. Разрешить раствору внедряющей среды затвердеть в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Приступайте к созданию изображений или хранению слайдов, завернутых в фольгу, при температуре 4 ° C до готовности к печати.
9. Изображение с широкофокусным эпифлуоресцентным микроскопом ^{7 <}/ Sup>, соединенной с Hg-лампой, и используют зеркальный блок для синего возбуждения (полоса возбуждения, 460-4 495 нм, зеркальное зеркало 505 нм и полоса пропускания излучения 510-550 нм) и 20X объективы Plan-Apochromat, 0,75 числовые апертура.

Результаты

Метанефринный почковый анлаген получали из беременных черных-6 инбредных мышей в E11.5 и культивировали. Через 3 дня зачаток мочеточника разветвлялся до 5 раз, что приводило к разрастанию первоначально Т-образного уретрового зачатка. Каждый эксплантов фотографировали, ?...

Обсуждение

В этой рукописи описывается метод выделения развивающегося метанефрического анлагена из эмбриона мыши и культивирования зачатки органа. Этот метод является стандартной методикой, разработанной Grobstein ⁸ и Saxén ^{9 , 10} , и был адаптирован и модифи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21331020
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140148
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040117	use for dissection
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T0665
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)	Thermo Fisher Scientific	41400045
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Thimerosal	Sigma-Aldrich	T5125
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin	Vector Laboratories	B-1035
Alexa488 conjugated Streptavidin	Jackson Immuno Research	016-540-084
Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF	R&D Systems	496-EB
Recombinant Human IgG1 Fc, CF	R&D Systems	110-HG-100
Goat Anti-Human IgG Fc Antibody	R&D Systems	G-102-C
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417	use for fixation and immunostaining
Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm	agnthos.se	0208-5-PS	2 pairs of forceps are needed
Iris scissors, straight, 12 cm	agnthos.se	03-320-120
Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm	agnthos.se	08-032-130
Petri dishes Nunclo Delta treated	Thermo Fisher Scientific	150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain	MerckMillipore	TMTP01300
Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom	Sigma-Aldrich	D6789-1CS
Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm	nordicbiolabs	107222
Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm	nordicbiolabs	102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain	nordicbiolabs	1030418
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
50 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828
15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped	Sigma-Aldrich	WHA1213125
Fixed stage research mircoscope	Olympus	BX61WI
Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac	Taconic	B6-M
Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac	Taconic	B6-F
Greenough Stereo Microscope	Leica	Leica S6 E