Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Resumen

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Resumen

Las células pueden comunicarse a través de exosomas, ~ 100-nm vesículas extracelulares (VE) que contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Las vesículas extracelulares derivadas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales (NAMEC) pueden aislarse a partir del medio NAMEC mediante ultracentrifugación diferencial. Basándose en su densidad, los VE pueden purificarse mediante ultracentrifugación a 110.000 x g. La preparación EV de la ultracentrifugación puede separarse adicionalmente usando un gradiente de densidad continuo para evitar la contaminación con proteínas solubles. Los EV purificados pueden entonces ser evaluados adicionalmente usando un análisis de seguimiento de nanopartículas, que mide el tamaño y el número de vesículas en la preparación. Las vesículas extracelulares con un tamaño comprendido entre 50 y 150 nm son exosomas. Los EVs / exosomas derivados de NAMEC pueden ser ingeridos por células epiteliales mamarias, que pueden medirse mediante citometría de flujo y microscopía confocal. Algunas propiedades de las células madre mamarias ( por ejemplo, la capacidad de formación de glándulas mamarias) puedenSe transfiere desde el tallo-como NAMECs a las células epiteliales mamarias a través de la NAMEC derivados EVs / exosomes. Las células epiteliales mamarias primarias aisladas EpCAM ^hi / CD49f no pueden formar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa de ratón, mientras que las células epiteliales mamarias basales EpCAM ^lo / CD49f ^hi forman glándulas mamarias después del trasplante. La captación de EVs / exosomas derivados de NAMEC por EpCAM ^hi / CD49f para células epiteliales mamarias luminales les permite generar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa. Los EVs / exosomas derivados de las células epiteliales mamarias de tipo madre transmiten la capacidad de formación de glándulas mamarias a EpCAM ^hi / CD49f para las células epiteliales mamarias luminales.

Introducción

Los exosomas pueden mediar en la comunicación celular mediante la transferencia de membrana y proteínas citosólicas, lípidos y ARN entre las células ¹ . Se ha demostrado que la comunicación mediada por exosomas está implicada en muchos procesos fisiológicos y patológicos ( es decir, presentación de antígenos, desarrollo de tolerancia ² y progresión tumoral ³ ). Los exosomas a menudo tienen contenidos similares a los de las células de origen que los liberan. Por lo tanto, los exosomas pueden llevar a las propiedades celulares específicas de las células de origen y la transferencia de estas propiedades a las células de ingerirlos [ ^4] .

Los exosomas son vesículas de membrana de doble capa de 50 a 150 nm y presentan marcadores específicos ( por ejemplo, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix y TSG101). Por lo tanto, los exosomas deben caracterizarse por diversos métodos para diferentes aspectos. La microscopía electrónica de transmisión puede usarse para visualizar vesículas de membranaTales como los exosomas ^{4 , 5} . El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y el análisis dinámico de dispersión de luz (DLS) se utilizan para medir el tamaño y el número de exosomas purificados ⁴ . El contenido de membrana lipídica de los exosomas puede ser verificado por gradiente de densidad. Los marcadores exosomales, tales como CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix y TSG101 ^{6 , 7} , pueden medirse mediante transferencia Western.

Las células basales mamarias tienen la capacidad de generar glándulas mamarias cuando se implantan en almohadillas de grasa, mientras que las células luminales no pueden ^{8 , 9 , 10} . Por lo tanto, las células basales mamarias también se denominan unidades de repoblación mamaria. Mediante el uso del modelo de células basales y lumínicas mamarias, se puede examinar la capacidad de EVs / exosomas para transferir características de células entre diferentes poblaciones celulares. Este trabajoDemuestra el método de transferencia de la capacidad de formación de glándulas de las células epiteliales basales mamarias a las células epiteliales lumínicas mamarias utilizando EVs / exosomas derivados de células epiteliales basales mamarias. Luminal células epiteliales mamarias adquirieron las propiedades basales de las células después de la ingestión de EVs / exosomas secretados a partir de células basales y, a continuación, pueden formar glándulas mamarias [ ^4] .

Protocolo

Todas las investigaciones relacionadas con animales cumplieron con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales.

1. Aislamiento y validación de vesículas / exosomas extracelulares

1. Cultivo de células basales epiteliales mamarias, NAMECs ⁴ , con medio libre de suero libre de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 con bicarbonato sódico (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hidrocoritisona (0,5 mu g / ml); Insulina (5 mu g / ml); Extracto de pituitaria bovina (BPE; 35 μg / ml); Y GW627368X (1 μg / ml) en platos de 15 cm.
2. Después de contar las células con un hemocitómetro, sembrar 1,2 x 106 células en 12 ml de medio por plato de 15 cm al día 0 durante 4 días ⁴ .
3. Después de 4 días en cultivo, centrifugar el medio de cultivo a 300 xg durante 5 min utilizando una centrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico ( Figura 1 ).
4. Centrifugar el sobrenadanteA 2.000 xg durante 20 min en una centrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y dejar las células muertas y los residuos celulares ( Figura 1 ].
5. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de ultracentrífuga ( Figura 1 ).
6. Centrifugar el sobrenadante a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento EV / exosoma en PBS ( Figura 1 ).
7. Centrifugar el sobrenadante a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Retirar el sobrenadante. Resuspender el EV / exosoma pellet en PBS ( Figura 1 ]. Resuspender el gránulo aislado de 240-480 mL de medio acondicionado con NAMEC en 100 μl.
8. Medir la concentración de proteína de la suspensión EV con el ensayo de proteínas BCA. Asegúrese de que la concentración es de alrededor de 20-40 μg / 100 μl. Almacenar a -20 ° C paraanálisis mas extenso.
9. Medir la concentración y el tamaño de los EVs / exosomes por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), como se describe anteriormente por Gardiner et al. ¹¹ . Diluir los EVs / exosomas (20 μg / 100 μl) con PBS hasta 10.000 veces para el análisis de NTA.
   NOTA: El resultado del análisis de NTA refleja el número y tamaño de las vesículas analizadas.
10. Imagen EVs / exosomes con transmisión microscopía electrónica (TEM), como se describe anteriormente por Lin et al [ ^4] .

2. Purificación de los exosomas utilizando un gradiente de densidad

1. Resuspender el gránulo de 110.000 g de la etapa 1.7 en yodixanol al 40% (p / v) en PBS (2 ml). Superponer la mezcla en secuencia con alícuotas de yodixanol al 30%, 20%, 10% y 5% (p / v) en PBS (2 ml cada uno) para formar un gradiente de densidad en un tubo de ultracentrífuga.
2. Centrifugar la mezcla a 200.000 xg durante 8 h a 4 ° C.
3. Recoja cada fracción de gradiente (10 fractiOns 1 ml / fracción) con una pipeta de la parte superior del tubo.
4. Analizar la presencia de marcadores de exosomas ( por ejemplo, CD81, CD9, CD63 y Tsg101) en cada fracción mediante SDS-PAGE ¹² y Western blot. Cargar 50 μl de suspensiones de cada fracción en un gel al 10% que contenga SDS al 0,1% (p / v) y separar las proteínas en fracciones con electroforesis en gel.
5. Transferir las proteínas de un gel a una membrana de PVDF e incubar la membrana con anticuerpos contra los marcadores de exosomas ( por ejemplo, CD81, CD9, CD63 y Tsg101) y la proteína doméstica GAPDH durante la noche ( Tabla de Materiales ) a 4ºC.
   NOTA: El resultado identifica la fracción que contiene los exosomas.

3. Etiquetado de vesículas / exosomas extracelulares

1. Suspender los EVs / exosomas, obtenidos en el paso 1.7, en 10 μM de éster de diacetato de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 20 μg de proteína exosomal / 100 μl. Preparar una muestra paralela coConservando sólo CFSE y PBS, procesados ​​de la misma manera, como un control negativo para los ensayos de absorción de EV / exosoma más tarde. Dejar las mezclas a 37 ° C durante 30 min.
2. Suspender los EVs / exosomas en 50 x volumen de PBS y centrifugar la suspensión a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se resuspende el pellet EV / exosoma en PBS. Repita el paso 3.2 una vez.
3. Suspender los EVs / exosomas en PBS a una concentración de 20 μg de proteína exosomal / 100 μL y luego filtrar los EVs / exosomas a través de membranas de 0,22 μm antes de añadir los EVs / exosomas a las células.

4. Ensayo de Absorción de Vesículas / Exosomas Extracelulares

1. Para preparar el medio de cultivo, mezclar 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 con bicarbonato sódico (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hidrocoritisona (0,5 mu g / ml); Insulina (5 mu g / ml); Y BPE (35 mu g / ml) ⁴ . Placa las células HMLE epitelial mamaria humana en placas de 6 pocillos (1 x 106 ^</ Sup> células / pocillo) un día antes del tratamiento EV / exosoma. Se a~nadieron EVs / exosoma marcados con fluorescencia CFSE de 2 μg / mL, obtenidos en el paso 3.3, al medio de cultivo de las células HMLE durante 2-6 h. Tratar las células HMLE del grupo de control negativo con la preparación paralela, descrita en el paso 3.1.
2. Después de la incubación de 2 a 6 h, lavar las células dos veces con 4 ml de PBS a temperatura ambiente.
3. Se separan las células con tripsina al 0,25% durante 10 min y se vuelven a suspender las células en PBS que contiene 0,2% de FBS. Mida la absorción EV / exosoma de la intensidad de fluorescencia en las células utilizando un analizador de células de fluorescencia [ ^4] . Imagen de las células tratadas con EVs / exosomes o el control negativo mediante microscopía confocal.
   NOTA: La fluorescencia verde en las células es causada por la absorción de EV / exosoma. Vea la leyenda de la Figura 6 para los ajustes del microscopio.

5. Aislamiento de células epiteliales mamarias de ratón primario

1. Preparar platos recubiertos con gelatina añadiendo 12 ml de solución de gelatina al 0,1% a platos de 10 cm. Colocar las placas en una incubadora a 37 ° C durante 30 min. Quitar la solución de gelatina y dejar las tapas de los platos en una campana de flujo laminar durante 4 h hasta que el recubrimiento de gelatina se ha secado.
2. Diseccionar las glándulas mamarias número 2, 3, 4 y 5 ( Figura 2 ) de ratones C57BL / 6 hembra virgen de 12 semanas usando tijeras y cortar las glándulas en pedazos pequeños (2 mm ² ) usando una maquinilla de afeitar.
3. Disociar aún más la suspensión de glándulas mamarias (de 10 ratones) durante 60 minutos a 37ºC, agitación de 120 rpm con 50 ml de DMEM / F12 que contiene 0,2% de colagenasa tipo IV, tripsina al 0,2%, FBS al 5%, gentamicina 5 μg / ml , Y 1x pen-strep.
4. Recoger los organoides epiteliales de la mezcla por centrifugación a 350 xg durante 10 min.
5. Suspender los organoides epiteliales en 4 mL de DMEM / F12 con 0,1 mg / ml de DNasa I durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 6 ml de DMEM / F12 a una solución finalVolumen de 10 ml.
6. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
7. Resuspender el sedimento en 10 ml de DMEM / F12. Centrifugar la suspensión pero golpear el freno cuando la velocidad alcanza 400 x g. Deseche el sobrenadante.
   NOTA: Al golpear el freno, los organoides epiteliales se precipitan rápidamente, mientras que los fibroblastos, como células individuales, permanecen en el sobrenadante.
8. Repita los pasos 5.6 y 5.7 5-7 veces. Añadir una gota de la suspensión a un hemocitómetro y luego comprobar el aclaramiento de fibroblastos de la mezcla de organoides bajo microscopía después de cada ronda de centrifugación ( Figura 3 ].
9. Se cubren los organoides en el plato recubierto con gelatina, obtenidos en el paso 5.1, durante 48 h con DMEM / F12 que contiene 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / ml de gentamicina, 10 ng / ml de EGF y 1x pen-strep.
10. Después de 48 h, eliminar las células flotantes en el cultivo mediante la sustitución del medio con medio de cultivo fresco sin FBS (DMEM / F12 que contiene 1x ITS, 50 μg / ml de gentamicina, 10 ng / ml de EGF y 1x pen-strep).
11. Confirme que una monocapa de células epiteliales mamarias migra y crece a partir de los organoides epiteliales unidos en 3 días.

6. Separación de las células epiteliales mamarias basales / lumínicas del ratón primario

1. Después del cultivo de 3 días, separar las células mamarias primarias de ratón con una mezcla enzimática natural con actividad enzimática proteolítica y colagenolítica durante 20 minutos. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS.
2. Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 5 mg / ml dispase durante 20 min. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS.
3. Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
4. Se volvieron a suspender las células en 100 μl de PBS con FBS al 0,2% a una concentración de 10 ⁷ células / ml con el diluidoAnti-CD49f y anticuerpos anti-EpCAM en hielo durante 1 h en la oscuridad.
5. Lavar las células con PBS y luego incubar las células con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
6. Lavar y volver a suspender las células en PBS con 0,2% de FBS.
7. Clasificar el EpCAM ^hi / CD49f ^lo células epiteliales mamarias luminal en un clasificador de células [ ^4] .

7. Tratamiento extracelular de vesículas / exosomas

1. Seed las células epiteliales mamarias lumonales EpCAM ^hi / CD49f seleccionadas de la etapa 6,7 ​​en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina (2 x 10 ^ { ⁵ } células / pocillo) y luego se tratan con PBS o EVs / exosomas derivados de NAMEC de 2 μg / mL Obtenido en el paso 1.7.
2. Para asegurar la eficacia biológica de los VE / exosomas en el tratamiento de cultivo a largo plazo, reemplazar el medio de cultivo celular con medio fresco que contenga PBS o 2 μg / mL de EVs / exosomas derivados de NAMEC cada dos días. No divida el mouse primaDurante el tratamiento de 10 días.

8. Inyección de grasa de células epiteliales mamarias

1. Anestesiar a una mujer de 3 semanas de edad C57BL / 6 ratones con isofluorano 2-3% inhalante.
2. Coloque el ratón anestesiado en la espalda. Retire la piel del abdomen medio con una crema de afeitar / cabello y limpie el sitio de la cirugía con tres ciclos alternos de alcohol al 70% y yoduro de povidona.
3. Hacer una incisión vertical de 1,5 cm a través de la piel a lo largo de la región ventral torácico-inguinal con tijeras y, alternativamente, exponer las almohadillas ^de grasa mamaria derecha e izquierda 4.
4. Limpie cada almohadilla de grasa quitando el parénquima de las glándulas con unas tijeras. Localice el ganglio linfático en la almohadilla de grasa y luego retire el parénquima de la glándula entera debajo del ganglio linfático.
   NOTA: Dos tercios de la almohadilla de grasa deben permanecer en su lugar.
5. Se separan las células obtenidas de la etapa 7.2 con una mezcla enzimática natural (véase la Tabla de Materiales ) con proteolítica aY la actividad enzimática colagenolítica durante 10 min. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS.
6. Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Contar las células con un hemocitómetro y suspender las células en PBS a una concentración tal que 15 μL contengan la dosis celular deseada (10 ⁴ -10 ² células / almohadilla).
7. Inyectar 15 μL de suspensión de células epiteliales mamarias en una almohadilla grasa usando una jeringa de vidrio de 100 μL unida a una aguja 27G.
8. Repita los pasos 8.4-8.7 para la almohadilla de grasa en el otro lado.
9. Cierre la piel con clips de herida.

9. Suelo entero de la glándula mamaria

1. Eutanasia el ratón con CO ₂ más dislocación cervical a las 8 semanas después de la inyección celular (Paso 8.7).
2. Hacer una incisión vertical a través de la capa de la piel de la región torácica a la región inguinal con tijeras y luego exponer tanto la derecha y la izquierda 4 ^thAlmohadillas de grasa amiga. Retire las ^glándulas mamarias ^cuarto ( Figura 2 ).
3. Se separan las almohadillas de grasa en portaobjetos de microscopio de vidrio y se fijan las almohadillas de grasa con fijador de Kahle (formaldehído al 4%, EtOH al 30% y ácido acético glacial al 2%) a temperatura ambiente durante la noche.
   Precaución: El fijador de Kahle es irritante. Realice este paso en un capó químico.
4. Lave las almohadillas de grasa en 250 ml de EtOH al 70% durante 15 minutos y luego en 250 ml de dH _$ ₂ _$ O durante 5 min. Mancha las almohadillas de grasa con alumbre de carmín (1 g de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de dH _$ ₂ _$ O) a temperatura ambiente durante la noche.
5. Lavar las almohadillas de grasa con 250 ml de EtOH al 70% durante 15 min, 250 ml de EtOH al 95% durante 15 min y 250 ml de EtOH al 100% durante 15 min.
6. Limpie las almohadillas de grasa en xileno durante días y detenga la incubación de xileno cuando las almohadillas de grasa se vuelven transparentes.
   Precaución: El xileno es irritante. Realice este paso en un capó químico.
7. Monte las diapositivas conTh y tomar imágenes (2.400 dpi) de las almohadillas de grasa utilizando un escáner digital de diapositivas.

Resultados

Debido a que se ha demostrado que el bloqueo de la señalización PGE2 / EP4 desencadena la liberación de EV / exosoma a partir de células madre mamarias basales ⁴ , este trabajo presenta un método para aislar los EVs / exosomas inducidos del cultivo de células basales epiteliales mamarias (NAMEC). Dado que NAMECs se cultivan en suero libre de medio, no hay pre-existentes EVs / exosomas derivados de suero [ ^13] . Para las células culti...

Discusión

Los exosomas a menudo llevan características de las células que las liberaron, y la cantidad de exosomas liberados puede ser inducida por los estímulos [ ^4] . El medio de cultivo de células puede ser recogido y sometido a ultracentrifugación diferencial para EV / exosome colección ( Figura 1 ]. Actualmente no existe un acuerdo general sobre un método ideal para aislar EVs / exosomas. El método óptimo utilizado aquí ha sido determinado por la aplicación des...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15 cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10 cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain