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요약

이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

초록

세포는 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 ~ 100-nm 세포 외 소포 (EVs) 인 엑소 좀을 통해 전달할 수 있습니다. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) 유래 세포 외 소포는 차별적 인 초 원심 분리를 통해 NAMEC 배지에서 분리 할 수 ​​있습니다. 밀도에 따라 EV는 110,000 x g에서 초 원심 분리를 통해 정제 할 수 있습니다. 초 원심 분리로 얻은 EV 준비물은 가용성 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 연속 밀도 구배를 사용하여 더욱 분리 할 수 ​​있습니다. 그런 다음 정화 된 EVs는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 추가로 평가할 수 있으며, 이는 준비 과정에서 소포의 크기와 수를 측정합니다. 50 내지 150 nm 범위의 세포 외 소포가 엑소 좀이다. NAMEC에서 추출한 EVs / exosomes는 유선 상피 세포에서 섭취 할 수 있는데, 이는 유동 세포 계측법과 공 촛점 현미경으로 측정 할 수 있습니다. 일부 유방 줄기 세포 특성 ( 예 : 유선 형성 능력)은줄기 모양의 NAMEC에서 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀을 통해 유방 상피 세포로 전달 될 수있다. 격리 된 일차 성 EpCAM hi / CD49f lo 내시경 상피 ​​세포는 마우스 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 형성 할 수 없으며, EpCAM lo / CD49f hi 기저 유방 상피 세포는 이식 후 유방 땀샘을 형성합니다. EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포에 의한 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀의 섭취는 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 생성하게한다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은 유방 내 형성 능력을 EpCAM hi / CD49f lo 내강 유방 상피 세포로 전달한다.

서문

Exosomes는 막과 세포질 단백질, 지질 및 RNA를 세포간에 전달하여 세포 간 통신을 매개 할 수 있습니다 1 . Exosome-mediated communication은 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정 ( 즉, 항원 제시, 내성 2 의 발달 및 종양 진행 3 )에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 엑소 좀은 종종 그것들을 방출하는 원천 세포와 비슷한 내용을 가지고있다. 따라서, exosomes은 소스 세포에서 특정 세포 속성을 수행하고 4 그들을 섭취 세포 에이 특성을 전송할 수 있습니다.

Exosomes는 50 ~ 150 nm의 이중층 멤브레인 베 시클이며 특정 마커 ( 예 : CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101)를 나타냅니다. 따라서, 엑소 좀은 다양한 측면에 대한 다양한 방법으로 특징 지어 져야한다. 투과 전자 현미경으로 막 소포를 시각화 할 수 있습니다.엑소 좀 4 , 5 와 같은 나노 입자 추적 분석 (NTA)과 동적 광산란 분석 (DLS)은 정제 된 엑소 좀의 크기와 수를 측정하는 데 사용됩니다 4 . 엑소 좀의 지질막 함량은 밀도 구배로 확인할 수 있습니다. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101 6 , 7 같은 엑소 좀 마커는 웨스턴 블 랏팅으로 측정 할 수 있습니다.

유방 기저 세포는 유방 패드에 이식 될 때 유선을 생성 할 수있는 능력이 있지만 luminal 세포는 8 , 9 , 10 일 수 없습니다. 따라서, 유방 기초 세포는 유방 재 분산 단위라고도합니다. 유방 기저 세포 및 내강 세포의 모델을 사용하여 EVs / 엑소 좀이 다른 세포 집단간에 세포 특성을 전달하는 능력을 검사 할 수 있습니다. 이 일유방 기초 상피 세포에서 유래 한 EVs / exosomes를 이용하여 유방 기초 상피 세포에서 유방 내피 세포로 유선 형성능을 전달하는 방법을 보여줍니다. 근위 유방 상피 세포는 기저 세포에서 분비 된 EV / 엑소 좀을 섭취 한 후 기저 세포 특성을 획득하고 유방 땀 샘을 형성 할 수 있습니다 4 .

프로토콜

동물과 관련된 모든 연구는 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care Committee)가 승인 한 의정서를 준수했습니다.

1. 세포 외 소포 / 엑소 좀 격리 및 검증

  1. 문화 유방 상피 기저 세포, NAMECs, 500 mL의 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 중탄산 나트륨 (0.2438 %)을 함유 한 DMEM / F12로 제조 된 신선한 무 혈청 배지; EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 소 뇌하수체 추출물 (BPE; 35㎍ / mL); 및 GW627368X (1 μg / mL)를 15 cm 접시에 넣었다.
  2. hemocytometer로 세포를 계산 후 4 일 동안 0 일째에 15cm dish 당 12mL의 배지에 1.2x10 6 세포를 사육한다.
  3. 배양 4 일 후 탁상용 원심 분리기를 사용하여 300 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 원추형 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다.
  4. 상등액을 원심 분리한다.탁상용 원심 분리기에서 2,000 xg에서 20 분간. 뜨는 원심 분리기 튜브에 뜨는를 전송하고 죽은 세포와 세포 잔해를 남겨주세요 ( 그림 1 ).
  5. 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 상등액을 새로운 초 원심 분리기 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다.
  6. 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거하고 PBS ( 그림 1 )에서 EV / exosome 펠렛을 resuspend.
  7. 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거합니다. PBS에 EV / exosome 펠렛을 Resuspend ( 그림 1 ). 100 μL에서 NAMEC - 조건 매체 240-480 ML에서 격리 된 펠렛을 Resuspend.
  8. BCA 단백질 분석으로 EV 현탁액의 단백질 농도를 측정하십시오. 농도가 20-40 μg / 100 μL 정도인지 확인하십시오. -20 ℃에서 보관추가 분석.
  9. 이전에 Gardiner 등이 설명한 것처럼 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 통해 EVs / exosomes의 농도와 크기를 측정하십시오 . 11 . NTA 분석을 위해 PBS로 EVs / exosomes (20 μg / 100 μL)를 10,000 배로 희석합니다.
    참고 : NTA 분석의 결과는 분석 된 소포의 수와 크기를 반영합니다.
  10. 린 (Lin) 등 4 에 의해 이전에 기술 된 바와 같이, 투과 전자 현미경 (TEM)으로 EVs / 엑소 좀을 이미지화한다.

2. 밀도 구배를 이용한 Exosome 정제

  1. PBS (2 mL) 중 40 % (w / v) iodixanol에서 1.7 단계의 110,000 g 펠렛을 재현 탁한다. Ultracentrifuge 튜브에 밀도 기울기를 형성하기 위해 PBS (각각 2 mL)에 30 %, 20 %, 10 % 및 5 % (w / v) iodixanol의 분량으로 혼합물을 중첩하십시오.
  2. 4 ° C에서 8 시간 동안 200,000 xg에서 혼합물을 원심 분리하십시오.
  3. 각 그래디언트 분율 (10도 프랙털ons; 1 mL / 분획)을 피펫으로 튜브의 꼭대기에서 꺼냈다.
  4. SDS-PAGE 12 및 Western blot으로 각 분획에서 exosome marker ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)의 존재를 분석합니다. 0.1 % (w / v) SDS를 포함하는 10 % 겔에 각 분획의 50 μL 현탁액을 적재하고 겔 전기 영동으로 분획으로 단백질을 분리한다.
  5. 단백질을 겔에서 PVDF 막으로 옮기고 exosome 마커 ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)에 대한 항체와 멤브레인을 4 ℃에서 하룻밤 동안 보관하십시오 (재료 표 ).
    참고 : 결과는 exosomes를 포함하는 분획을 식별합니다.

3. 세포 외 소포 / 엑소 좀 표지

  1. 엑소 솜 단백질 20 μg / 100 μL에서 10 μM carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester (CFSE)에 1.7 단계에서 얻은 EVs / exosomes를 정지시킨다. 병렬 샘플 공동 작성동일한 방식으로 처리 된 CFSE 및 PBS만이 나중에 EV / 엑소 좀 섭취 검정에 대한 음성 대조군으로 사용된다. 30 분 동안 37 ° C에서 혼합물을 둡니다.
  2. EV 50 분의 PBS에서 EVs / exosomes를 일시 중지하고 4에서 60 분 동안 110,000 xg에서 현탁액을 원심 분리하십시오 ° C. 뜨는를 제거하고 PBS에 EV / exosome 펠렛을 resuspend. 한 번 단계 3.2를 반복하십시오.
  3. exosomal 단백질 / 100 μL 20 μg의 농도에서 PBS에 EVs / exosomes을 일시 중지하고 세포에 EVs / exosomes를 추가하기 전에 0.22 μm의 세포막을 통해 EVs / exosomes를 필터링합니다.

4. 세포 외 소포 / 엑소 좀 흡수 분석법

  1. 배양 배지를 만들기 위해 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 DMEM / F12를 중탄산 나트륨 (0.2438 %)과 혼합한다. EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 및 BPE (35 μg / mL) 4 . 6 잘 접시에 인간 mammary 상피 HMLE 세포를 플레이트 (1 × 10 6 </ sup> 세포 / 웰) EV / 엑소 좀 처리 하루 전에. 2-6 H 조 HMLE 세포의 문화 매체에 단계 3.3에서 얻은 2 μg / ML CFSE 형광 라벨 EVS / exosome을 추가합니다. 단계 3.1에서 설명한 병렬 준비와 함께 부정적인 제어 그룹의 HMLE 세포를 처리합니다.
  2. 2-6 시간 배양 후 실온에서 PBS 4 mL로 세포를 두 번 씻어 낸다.
  3. 10 분 0.25 % 트립신으로 세포를 분리하고 0.2 % FBS를 포함하는 PBS에 세포를 다시 일시 중지합니다. 형광 셀 분석기 4 를 사용하여 세포의 형광 강도에서 EV / exosome 이해를 측정합니다. 공 촛점 현미경을 사용하여 EVs / exosomes 또는 부정적인 컨트롤로 치료 세포를 이미지.
    참고 : 세포의 녹색 형광은 EV / exosome 섭취로 인해 발생합니다. 현미경 설정에 대해서는 그림 6 의 범례를 참조하십시오.

5. 일차 마우스 유방 상피 세포의 분리

  1. 10cm 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 12ml를 넣어 젤라틴 코팅 요리를 준비하십시오. 30 분 동안 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다. 젤라틴 코팅이 건조 될 때까지 젤라틴 용액을 제거하고 4 시간 동안 층류 후드에서 뚜껑을 접시에서 내려 놓습니다.
  2. 가위를 사용하여 12 주 된 처녀 암컷 C57BL / 6 마우스에서 2, 3, 4, 5 번 유방 땀샘 ( 그림 2 )을 해부하고 면도기를 사용하여 작은 조각 (2mm 2 )으로 땀샘을 자릅니다.
  3. 추가로 0.2 % 콜라게나 제 타입 IV, 0.2 % 트립신, 5 % FBS, 5 μg / ML gentamycin을 포함하는 DMEM / F12 50 ML와 37 ° C, 120 rpm의 교반에서 60 분 (10 생쥐) 유방 땀샘의 해리 , 1x pen-strep.
  4. 10 분 동안 350 XG에서 원심 분리하여 혼합물에서 상피 organoids를 펠렛.
  5. 상온에서 5 분 동안 0.1 MG / ML DNase I와 DMEM / F12의 4 ML에 상피 organoids를 중단. 최종 6 ML의 DMEM / F12를 추가10 mL의 부피.
  6. 현탁액을 실온에서 10 분 동안 400 xg에서 원심 분리하고 상등액을 버린다.
  7. 10 ML의 DMEM / F12에 펠렛을 Resuspend. 서스펜션을 원심 분리하지만 속도가 400 x g에 도달하면 브레이크를 맞 춥니 다. 뜨는 물을 버린다.
    참고 : 브레이크를 치면, 상피 organoids 신속하게 pelleted, fibroblasts, 하나의 세포로, 여전히 뜨는에 머물러 있습니다.
  8. 5.6 단계와 5.7 단계를 5-7 회 반복하십시오. hemocytometer에 정지 현탁액을 추가하고 원심 분리 ( 그림 3 ) 각 라운드 후 현미경하에 organoid 혼합물에서 fibroblasts의 정리를 확인하십시오.
  9. 1x ITS, 5 % FBS, 50㎍ / mL gentamycin, 10ng / mL EGF 및 1x 펜 - 스트렙토닌을 함유하는 DMEM / F12로 단계 5.1에서 얻은 젤라틴 코팅 된 접시에 유기체를 플레이트한다.
  10. 48 시간 후, FBS없이 새로운 배지로 배지를 교체하여 배양 물에서 부유 세포를 제거한다1 x ITS, 50 μg / mL gentamycin, 10 ng / mL EGF 및 1x pen-strep를 함유하는 DMEM / F12).
  11. 유방 상피 세포의 단일 층이 3 일 안에 부착 된 상피 기관 종에서 이동 및 성장한다는 것을 확인하십시오.

6. 일차 마우스 기초 / Luminal 유방 상피 세포의 분리

  1. 3 일 배양 후, 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 활성을 갖는 천연 효소 혼합물을 마우스 기본 유방 세포에서 20 분 동안 분리한다. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
  2. 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. 20 분 동안 5 MG / ML dispase에 세포 펠렛을 Resuspend. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
  3. 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다.
  4. 희석과 10 7 세포 / ML의 농도 0.2 % FBS와 100 μL PBS에 세포를 다시 정지항 -CD49f 및 항 -EpCAM 항체를 얼음에서 1 시간 동안 어둠 속에서 처리 하였다.
  5. PBS로 세포를 씻어 낸 다음 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에 형광 물질이 결합 된 2 차 항체로 세포를 부화시킵니다.
  6. 0.2 % FBS로 PBS에서 세포를 세척하고 재현 탁한다.
  7. EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포를 세포 분류기 4로 분류하십시오.

7. 세포 외 소포 / 엑소 좀 처리

  1. 젤라틴 코팅 6 잘 요리 (2 X 10 5 세포 / 음)에 단계 6.7에서 정렬 EpCAM 안녕 / CD49f lo luminal mammary 상피 세포 씨앗 후 PBS 또는 2 μg / ML NAMEC 파생 EVs / exosomes로 그들을 치료 1.7 단계에서 얻은
  2. 장기간의 배양 처리에서 EV / 엑소 좀의 생물학적 효능을 보장하기 위해 PBS 또는 2 μg / mL NAMEC 파생 EVs / 엑소 좀을 함유하는 새로운 배지로 세포 배양 배지를 교체하십시오. 마우스 prima를 분할하지 마라.10 일간의 치료 중 luminal cell을 관찰 하였다.

유방 상피 세포의 지방 패드 주입

  1. 3 주된 여성 C57BL / 6 마우스를 isofluorane 2-3 % 흡입제로 마취하십시오.
  2. 마취 된 마우스를 뒤쪽에 놓습니다. 중년 복부 면도기 / 모발 크림을 사용하여 모피를 제거하고 70 % 알콜 및 포비돈 요오드 3 회 교대로 수술 부위를 닦으십시오.
  3. 가위로 복부 흉부 - 사타구니 부위를 따라 피부를 통해 1.5 cm 수직 절개를하고 오른쪽 및 왼쪽 4 번째 유방 지방 패드를 교대로 노출시킵니다.
  4. 유선 실질을 가위로 제거하여 지방 패드를 모두 지 웁니다. 지방 패드에서 림프절을 찾은 다음 림프절 아래의 전체 샘 실질을 제거하십시오.
    참고 : 지방 패드의 3 분의 2는 그대로 두어야합니다.
  5. 단계 7.2에서 얻은 세포를 천연 효소 혼합물 ( 물질 표 참조)로 단백질 분해성 a콜라겐 분해 효소 활성 10 분. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
  6. 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. hemocytometer로 세포를 세고 15 μL에 원하는 세포 복용량 (10 4 -10 2 세포 / 패드)이 포함 된 농도의 PBS에 세포를 정지시킵니다.
  7. 27G 바늘에 부착 된 100 μL 유리 주사기를 사용하여 지방 패드에 유방 상피 세포 현탁액의 15 μL를 주입.
  8. 다른 쪽의 지방 패드에 대해 8.4-8.7 단계를 반복하십시오.
  9. 상처 클립으로 피부를 닫으십시오.

9. 유선 전체 마운트

  1. 세포 주입 후 8 주째에 이산화탄소와 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사하십시오 (단계 8.7).
  2. 가위를 사용하여 흉부 영역에서 사타구니 영역으로 피부 레이어를 통해 수직 절개를 만들고 오른쪽과 왼쪽 모두를 노출 4 분ammary 지방 패드. 네 번째 유방 땀샘을 제거하십시오 ( 그림 2 ).
  3. 유리 현미경 슬라이드에 지방 패드를 퍼지하고 하룻밤 실온에서 Kahle의 고정액 (4 % 포름 알데히드, 30 % EtOH 및 2 % 빙초산)로 지방 패드를 고정합니다.
    주의 : Kahle의 정착액은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오.
  4. 지방 패드를 50 분간 70 % EtOH 250 mL에 넣고 15 분 동안 씻은 다음 5 분 동안 250 mL의 dH 2 O에서 씻으십시오. 살찐 명반을 실온에서 하룻밤 동안 밤새 카민의 명반 (카민 1g과 황산 칼륨 2.5g을 dH 2 O 500mL에 넣음)으로 염색합니다.
  5. 지방 패드를 15 분 동안 250 mL의 70 % EtOH, 15 분 동안 95 % EtOH 250 mL 및 15 분 동안 100 % EtOH 250 mL로 씻으십시오.
  6. 뚱뚱한 패드가 투명하게 될 때 일 동안 자일 렌에있는 뚱뚱한 패드를 청소하고 자일 렌 부화를 멈추십시오.
    주의 : 크실렌은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오.
  7. 슬라이드 마운트하기디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 지방 패드의 이미지 (2,400 dpi)를 촬영합니다.

결과

PGE 2 / EP 4 신호 전달을 막음으로써 유방 기초 형 줄기 세포 4 에서 EV / 엑소 좀 방출을 유발한다는 것이 보여지기 때문에,이 연구는 유방 상피 기저 세포 (NAMEC) 배양으로부터 유도 된 EVs / 엑소 좀을 분리하는 방법을 제시한다. NAMEC은 혈청이없는 배지에서 배양되기 때문에 혈청에서 유래 된 EV / 엑소 좀은 존재하지 않는다. 혈청 함유 배지?...

토론

엑소 좀은 종종 그것들을 방출 한 세포의 특성을 가지고 있으며 방출 된 엑소 좀의 양은 자극 4 에 의해 유도 될 수있다. 세포의 배양 배지를 수집하여 EV / exosome 수집을위한 차동 초 원심 분리 (differential centrifuge)에 적용 할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 현재 EVs / exosomes를 분리하는 이상적인 방법에 대한 일반적인 합의는 없다. 여기에서 사용 된 최적의 방법은 다?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 국립 보건 연구원 (05A1-CSPP16-014, HJL)과 과학 기술부 (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL)의 연구비 지원에 의해 뒷받침되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K ultracentrifugeBeckman393253
SW28 Ti RotorBeckman342204
SW41 RotorBeckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep Sigma-AldrichD155660% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibodyGeneTexGTX1017661:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD9 antibodyGeneTexGTX1009121:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD63 antibodyAbcamAb594791:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
TSG101 antibodyGeneTexGTX1187361:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
GAPDHGeneTexGTX1001181:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesfluorescence cell analyzer
collagenase Type IV Thermo17104019
trypsinThermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutaseebioscience00-4555-56a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase STEMCELL79135 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibodyBiolegend3136111:50
anti-EpCAM antibodyBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencescell sorter
carmine alumSigma-AldrichC1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)gifts from Dr. Robert Weinberg
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
sodium bicarbonateZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisoneSigma-AldrichSI-H0888
Insulin Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15 cm culture dishFalcon 353025
table-top centrifugeEppendrof Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tubeBeckman344058
PBS (Phosphate-buffered saline) Corning46-013-CM
BCA Protein AssayThermo Fisher Scientific 23228
Transmission Electron MicroscopyHitachiHT7700
gelatin STEMCELL7903
10 cm culture dishFalcon 353003
6-well culture dishCorning3516
female C57BL/6 miceNLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)BioWest S01520
gentamycinThermo Fisher Scientific 15710072
Pen/StrepCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
isofluorane HalocarbonNPC12164-002-25
formaldehydeMACRONH121-08
EtOH (Ethanol)J.T. Baker800605
glacial acetic acidPanreac131008.1611
aluminum potassium sulfateSigma-Aldrich12625
Xylene Leica3803665
0.22 μm membranesMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP Wound Clip ApplierBD Biosciences427630
CellMask™ Deep RedThermo Fisher Scientific C10046plasma membrane stain

참고문헌

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