JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

Abstract

תאים יכולים לתקשר באמצעות אקסוסומים, ~ 100 ננומטר שלפוחית ​​תאיים (EVs) המכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין. Non-חסיד / mesenchymal תא אפיתל החלב (NAMEC), שודד שלפוחית ​​תאיים יכול להיות מבודדים בינוני NAMEC באמצעות ultracentrifugation דיפרנציאלי. בהתבסס על הצפיפות שלהם, EVs ניתן לטהר באמצעות ultracentrifugation ב 110,000 x גרם. ההכנה EV מן ultracentrifugation ניתן להפריד עוד באמצעות שיפוע צפיפות מתמשכת כדי למנוע זיהום עם חלבונים מסיסים. EVs מטוהרים לאחר מכן ניתן להעריך עוד באמצעות ניתוח nanoparticle מעקב, אשר מודד את הגודל ואת מספר שלפוחית ​​בהכנה. שלפוחית ​​תאיים עם גודל הנעים בין 50 ל 150 ננומטר הם exosomes. NAMEC הנגזרות EVs / exosomes ניתן לבלוע על ידי תאים אפיתל החלב, אשר ניתן למדוד על ידי cytometry הזרימה מיקרוסקופיה confocal. כמה תכונות תא גזע החלב ( למשל, יכולת בלוטת החלב יוצרת) יכוליועברו מן NAMECs דמויי גזע לתאי אפיתל החלב באמצעות NAMEC הנגזרות EV / exosomes. מבודד EpCAM היי / CD49f לו תאים luminal החלב epithelial לא יכול ליצור בלוטות החלב לאחר השתלתם לתוך רפידות שומן העכבר, בעוד EpCAM lo / CD49f היי תאים אפיתל החלב הבסיס החלב טופס בלוטות החלב לאחר ההשתלה. ספיגה של NAMEC הנגזרות EV / exosomes על ידי EpCAM היי / CD49f Lo לומינאלי תאים אפיתל החלב מאפשר להם לייצר בלוטות החלב לאחר השתלת לתוך רפידות שומן. ה- EVS / exosomes נגזר כמו תאי גזע כמו אפיתל החלב העברת בלוטת החלב יוצרת יכולת APCAM היי / CD49f lo לומינלית תאים אפיתל החלב.

Introduction

Exosomes יכול לתווך תקשורת סלולרית על ידי העברת חלבונים ממברנה cytosolic, שומנים, ו RNAs בין התאים 1 . תקשורת Exosome בתיווך הוכח להיות מעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים ( כלומר, מצגת אנטיגן, התפתחות סובלנות 2 , התקדמות הגידול 3 ). Exosomes לעתים קרובות יש תוכן דומה לאלה של תאים המקור לשחרר אותם. לפיכך, exosomes יכול לשאת מאפייני תאים ספציפיים מתאי המקור ולהעביר תכונות אלה לתאים לבלוע אותם 4 .

Exosomes הם 50 עד 150 ננומטר כפול שכבת קרום שלפוחית ​​ו הנוכחי סמנים ספציפיים ( למשל, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix, ו TSG101). לפיכך, אקסוסומים חייבים להיות מאופיינים בשיטות שונות להיבטים שונים. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ניתן להשתמש כדי לדמיין את שלפוחית ​​הממברנהכגון exosomes 4 , 5 . ניתוח מעקף ננו-חלקיקים (NTA) וניתוח פיזור אור דינמי (DLS) משמשים למדידת גודל ומספר אקוסומות מטוהרות 4 . תוכן קרום השומנים של exosomes ניתן לאמת על ידי שיפוע צפיפות. סמנים Exosomal, כגון CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix, ו TSG101 6 , 7 , ניתן למדוד על ידי סופג המערבי.

תאי הבסיס החלב יש את היכולת לייצר בלוטות החלב כאשר מושתלים לתוך רפידות שומן, בעוד תאים לומינליים לא יכול 8 , 9 , 10 . לפיכך, תאי הבסיס החלב מכונים גם יחידות repopulating החלב. על ידי שימוש במודל של תאי הבסיס ותאי לומיני החלב, ניתן לבחון את היכולת של EV / exosomes להעביר מאפייני התא בין אוכלוסיות תאים שונות. העבודה הזומדגים את השיטה של ​​העברת יכולת יצירת בלוטות מן תאים אפיתל הבסיס החלב לתאי אפיתל לומינלי החלב באמצעות EVS / exosomes נגזר תאי אפיתל הבסיס החלב. תאים אפיתל החלב לומיני רכשה תכונות תא הבסיס לאחר בליעה של EVs / exosomes מופרשים מתאי הבסיס ולאחר מכן ניתן ליצור בלוטות החלב 4 .

Protocol

כל המחקרים העוסקים בבעלי חיים עמדו בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.

1. שלפוחית ​​תאיים / בידוד exosome ו Validation

  1. תאים NAMECs 4 , עם מדיום טרי, ללא סרום, עשוי 500 מ"ל של MCDB 170, pH 7.4 + 500 מ"ל של DMEM / F12 עם סודיום ביקרבונט (0.2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0.5 מיקרוגרם / מ"ל); אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל); תמצית יותרת המוח (BPE, 35 מיקרוגרם / מ"ל); ו GW627368X (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב 15 ס"מ מנות.
  2. לאחר ספירת התאים עם hemocytometer, זרע 1.2 x 10 6 תאים 12 מ"ל של מדיום לכל צלחת 15 ס"מ ביום 0 במשך 4 ימים 4 .
  3. לאחר 4 ימים בתרבות, צנטריפוגה בינוני תרבות ב XG 300 במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחן השולחן. מעבירים את supernatant לצינור חרוטי ( איור 1 ).
  4. צנטריפוגה supernatantב 2000 xg במשך 20 דקות בצנטריפוגה שולחן למעלה. מעבירים את supernatant לצינור ultracentrifuge ולהשאיר את התאים המתים ואת פסולת התא ( איור 1 ).
  5. צנטריפוגה supernatant ב XG 10,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant לצינור ultracentrifuge חדש ( איור 1 ).
  6. צנטריפוגה supernatant ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend EV / גלולה exosome ב PBS ( איור 1 ).
  7. צנטריפוגה supernatant ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. Resuspend EV / גלולה exosome ב PBS ( איור 1 ). Resuspend גלולה מבודד 240-480 מ"ל של המדיום NAMEC מותנה μL 100.
  8. למדוד את ריכוז החלבון של ההשעיה EV עם assay חלבון BCA. ודא כי הריכוז הוא סביב 20-40 מיקרוגרם / 100 μL. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עבורניתוח נוסף.
  9. למדוד את הריכוז והגודל של EV / exosomes ידי ניתוח nanoparticle מעקב (NTA), כפי שתואר קודם על ידי Gardiner et al. 11 . לדלל את EVs / exosomes (20 מיקרוגרם / 100 μL) עם PBS ל -10,000 לקפל לניתוח NTA.
    הערה: תוצאה של ניתוח NTA משקף את מספר וגודל שלפוחית ​​ניתח.
  10. תמונה EVs / exosomes עם מיקרוסקופיה הילוכים אלקטרונית (TEM), כפי שתואר קודם לכן על ידי Lin et al 4 .

2. Exosome טיהור באמצעות שיפוע צפיפות

  1. Resuspend את גלולה 110,000 גרם משלב 1.7 ב 40% (w / v) iodixanol ב PBS (2 מ"ל). שכבת התערובת ברצף עם aliquots של 30%, 20%, 10%, ו 5% (w / v) iodixanol ב PBS (2 מ"ל כל אחד) כדי ליצור שיפוע צפיפות בצינור ultracentrifuge.
  2. צנטריפוגה התערובת ב XG 200,000 עבור 8 שעות ב 4 ° C.
  3. אסוף כל שברי הדרגתי (10 fractiOns; 1 מ"ל / חלק) עם פיפטה מהחלק העליון של הצינור.
  4. ניתוח נוכחות של סמנים exosome ( למשל, CD81, CD9, CD63, ו Tsg101) בכל חלק על ידי SDS-PAGE 12 כתם המערבי. טען 50-μL השעיות של כל חלק על גבי ג'ל 10% המכיל 0.1% (w / V) SDS ולהפריד את החלבונים שברים עם ג'ל אלקטרופורזה.
  5. מעבירים את החלבונים מ ג 'ל לקרום PVDF ו דגירה של קרום עם נוגדנים נגד סמנים exosome ( למשל, CD81, CD9, CD63, ו Tsg101) וחלבון GAPDH חלבון לילה ( טבלה של חומרים ) ב 4 ° C.
    הערה: התוצאה מזהה את החלק המכיל אקסוסומות.

3. שלפוחית ​​תאיים / Exosome תיוג

  1. להשעות את EVs / exosomes, שהושג בשלב 1.7, ב 10 מיקרומטר carboxyfluorescein succinimidyl diacetate אסתר (CFSE) ב 20 מיקרוגרם של חלבון אקסוסומלי / 100 μL. הכן משותף מדגם מקבילNene רק CFSE ו PBS, מעובד באותו אופן, כמו שליטה שלילית עבור מבחני EV / evosake מאוחר יותר. השאירו את תערובות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. להשעות את EVs / exosomes בנפח 50x של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה ב XG 110,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend גלולה EV / exosome ב PBS. חזור על שלב 3.2 פעם אחת.
  3. להשעות את EVs / exosomes ב PBS בריכוז של 20 מיקרוגרם של חלבון אקסוסומלי / 100 μL ולאחר מכן לסנן את EVs / exosomes דרך 0.22 מיקרומטר קרום לפני הוספת EVs / exosomes לתאים.

4. שלפוחית ​​תאיים / Exosome Uptake Assay

  1. כדי להפוך בינוני תרבות, מערבבים 500 מ"ל של MCDB 170, pH 7.4 + 500 מ"ל של DMEM / F12 עם סודיום ביקרבונט (0.2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0.5 מיקרוגרם / מ"ל); אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל); ו BPE (35 מיקרוגרם / מ"ל) 4 . פלייט בתאי HMLE אפיתל החלב האנושי במנות 6-היטב (1 x 10 6 </ Sup> תאים / טוב) יום לפני טיפול EV / exosome. הוסף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​CFSE הקרינה שכותרתו EVs / exosome, שהושג בשלב 3.3, בינוני התרבות של תאים HMLE עבור 2-6 שעות. טפל בתאי HMLE של קבוצת הביקורת השלילית עם ההכנה המקבילה, המתואר בשלב 3.1.
  2. לאחר הדגירה 2-6 שעות, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
  3. לנתק את התאים עם טריפסין 0.25% למשך 10 דקות מחדש להשעות את התאים PBS המכיל 0.2% FBS. למדוד את ספיגה EV / exosome מן עוצמת הקרינה בתאים באמצעות מנתח תא פלואורסצנטי 4 . תמונה התאים שטופלו EVs / exosomes או שליטה שלילית באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
    הערה: הקרינה הירוקה בתאים נגרמת על ידי ספיגת EV / exosome. ראה את האגדה של איור 6 עבור הגדרות מיקרוסקופ.

בידוד של תאים עכבר ראשי אפיתל החלב

  1. הכינו מנות מצופות ג'לטין על ידי הוספת 12 מ"ל של פתרון ג'לטין 0.1% ל 10 מנות ס"מ. מניחים את הצלחות 37 ° C חממה למשך 30 דקות. הסר את הפתרון ג'לטין ולהשאיר את המכסים את הכלים במכסה המנוע זרימה למינרית במשך 4 שעות עד ציפוי ג'לטין התייבש.
  2. לנתח את מספר 2, 3, 4, ו 5 בלוטות החלב ( איור 2 ) מ 12 שבועות בת נקבה C57BL נקבה / 6 עכברים באמצעות מספריים לחתוך את הבלוטות לחתיכות קטנות (2 מ"מ 2 ) באמצעות סכין גילוח.
  3. עוד לנתק את slurry של בלוטות החלב (במשך 10 דקות) ב 60 דקות ב 37 ° C, 120 תסיסה סל"ד עם 50 מ"ל של DMEM / F12 המכיל 0.2% collagenase סוג IV, 0.2% טריפסין, 5% FBS, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin , ו 1x עט סטרפט.
  4. גלולה את האורגנים אפיתל מן התערובת על ידי צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות.
  5. להשעות את האורגנים אפיתל ב 4 מ"ל של DMEM / F12 עם 0.1 מ"ג / מ"ל ​​DNase אני 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 6 מ"ל של DMEM / F12 לגמרנפח של 10 מ"ל.
  6. צנטריפוגה ההשעיה ב XG 400 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant.
  7. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל של DMEM / F12. צנטריפוגה ההשעיה אבל להכות את הבלם כאשר המהירות מגיעה 400 x גרם. מחק את supernatant.
    הערה: על ידי להכות את הבלם, אורגנואידים אפיתל במהירות pelleted למטה, בעוד fibroblasts, כמו תאים בודדים, עדיין להישאר supernatant.
  8. חזור על שלב 5.6 ו -5.7 5-7 פעמים. הוסף ירידה של ההשעיה כדי hemocytometer ולאחר מכן לבדוק את פינוי fibroblasts מן התערובת האורגנואידים תחת מיקרוסקופיה לאחר כל סיבוב של צנטריפוגה ( איור 3 ).
  9. צלחת את האורגנונים בצלחת ג'לטין מצופה, שהושג בשלב 5.1, במשך 48 שעות עם DMEM / F12 המכיל 1x ITS, 5% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin, 10 ng / מ"ל ​​EGF, ו 1x עט סטרפט.
  10. לאחר 48 שעות, להסיר את התאים הצפים בתרבות על ידי החלפת המדיום בינוני בינוני טרי ללא FBS (DMEM / F12 המכיל 1x ITS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin, 10 NG / מ"ל ​​EGF, ו 1x עט סטרפט).
  11. ודא כי monolayer של תאים אפיתל החלב נודדת וצומח מתוך אורגנואידים epithelial המצורפת ב 3 ימים.

6. ההפרדה של ראשי בזלת העכבר / תאים אפיתל לומינל החלב

  1. לאחר 3 ימים התרבות, לנתק את תאי החלב העיקרי העכבר עם תערובת אנזים טבעי עם פעילות אנזים proteolytic ו collagenolytic במשך 20 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS.
  2. צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. Resuspend גלולה התא ב dispes 5 מ"ג / מ"ל ​​במשך 20 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS.
  3. צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant.
  4. Re- מושעה התאים μL 100 μL עם 0.2% FBS בריכוז של 10 7 תאים / מ"ל ​​עם מדוללנוגדן אנטי-CD49f ואנטי-APCAM על קרח במשך שעה אחת בחושך.
  5. לשטוף את התאים עם PBS ולאחר מכן דגירה התאים עם נוגדן משני fluorophore מצומדות על הקרח במשך 30 דקות בחושך.
  6. לשטוף מחדש להשעות את התאים PBS עם 0.2% FBS.
  7. מיין את epcam היי / CD49f lo לומינלית תאים אפיתל החלב על סדרן התא 4 .

7. שלפוחית ​​שלפוחיתית / Exosome טיפול

  1. זרעים ממוינים epCAM היי / CD49f לו לומינל החלב תאים אפיתל משלב 6.7 על ג 'לטין מצופה 6-גם מנות (2 x 10 5 תאים / טוב) ולאחר מכן לטפל בהם עם PBS או 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​NAMEC הנגזרות EV / exosomes שהתקבלו בשלב 1.7.
  2. כדי להבטיח את היעילות הביולוגית של EVs / exosomes בטיפול תרבות לטווח ארוך, להחליף את המדיום תרבות התא בינוני טרי המכיל PBS או 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​NAMEC הנגזרות EV / exosomes כל יומיים. אין לפצל את פרימה העכברתאים luminal ry במהלך הטיפול 10 יום.

8. שומן Pad הזרקת תאים אפיתל החלב

  1. להרדים נקבה C37BL נקבה בת 3 שבועות עם 6 עכברים עם שאיפה 2-3% isofluorane.
  2. מניחים את העכבר הרדים על גבו. הסר את הפרווה על הבטן באמצע עם קרם גילוח / שיער לנקות את אתר הניתוח עם שלושה מחזורים לסירוגין של אלכוהול 70% פובידון יוד.
  3. לעשות חתך אנכי 1.5 ס"מ דרך העור לאורך אזור החזה-המעי הגחון במספריים ולאחר מכן לחילופין לחשוף את ימין ושמאל 4 pads שומן החלב.
  4. נקה כל כרית שומן על ידי הסרת parenchyma בלוטת עם מספריים. אתר את הלימפה הצומת פנקס השומן ולאחר מכן להסיר את פרנכימה הבלוטה כולה מתחת הצומת הלימפה.
    הערה: שני שלישים של משטח שומן צריך להישאר במקום.
  5. לנתק את התאים המתקבלים משלב 7.2 עם תערובת אנזים טבעי (ראה טבלה של חומרים ) עם proteolytic אפעילות אנזים קולגניוליטי במשך 10 דקות. לנטרל את פעילות האנזים עם 5% FBS ב PBS.
  6. צנטריפוגה ההשעיה ב XG 450 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך supernatant. לספור את התאים עם hemocytometer ולהשעות את התאים PBS בריכוז כזה μL 15 מכיל את המינון התא הרצוי (10 4 -10 2 תא / כרית).
  7. להזריק 15 μL של ההשעיה תא אפיתל החלב לתוך משטח שומן באמצעות מזרק זכוכית 100 μL המצורפת מחט 27G.
  8. חזור על שלבים 8.4-8.7 עבור משטח שומן בצד השני.
  9. סגור את העור עם קליפים הפצע.

9. בלוטת החלב הר שלם

  1. להרדים את העכבר עם CO 2 פלוס צוואר הרחם ב 8 שבועות לאחר הזרקת התא (שלב 8.7).
  2. ביצוע חתך אנכי דרך שכבת העור מאזור החזה לאזור המפשעה באמצעות מספריים ולאחר מכן לחשוף את ימין ושמאל 4 מ 'רפידות שומן אמריות. הסר את בלוטות החלב 4 ( איור 2 ).
  3. מורחים את רפידות שומן על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לתקן את רפידות שומן עם מקבע של Kahle (פורמלדהיד 4%, EtOH 30%, ו 2% חומצה אצטית קרח) בטמפרטורת החדר לילה.
    זהירות: מקבע של Kahle הוא מגרה. בצע שלב זה ברדס כימי.
  4. לשטוף את כריות שומן 250 מ"ל של EtOH 70% במשך 15 דקות ולאחר מכן ב 250 מ"ל של DH 2 O במשך 5 דקות. כתם את רפידות שומן עם alum carmine (1 גרם של carmine ו -2.5 גרם של אלומיניום גופרתי אשלגן 500 מ"ל של DH 2 O) בטמפרטורת החדר לילה.
  5. לשטוף את כריות שומן עם 250 מ"ל של EtOH 70% במשך 15 דקות, 250 מ"ל של EtOH 95% במשך 15 דקות, ו 250 מ"ל של EtOH 100% במשך 15 דקות.
  6. נקו את כריות השומן בקסילן במשך ימים ועצרו את דגירה של קסילן כאשר רפידות השומן הופכות שקופות.
    זהירות: קסילן הוא מגרה. בצע שלב זה ברדס כימי.
  7. הר שקופיות wiבינוני גובר ולקחת תמונות (2,400 dpi) של רפידות שומן באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי.

תוצאות

מאז הוכח כי חסימת PGE 2 / EP 4 איתות מפעילה EV / שחרור exosome מתאי גזע דמויי הבסיס החלבני 4 , עבודה זו מציגה שיטה לבידוד EVs המושרה / exosomes מתרבות תא אפיתל החלב (NAMEC) החלב. מאז NAMECs הם מתורבת בינוני ללא סרום, אין קיימים EV / exosomes נגזר 13...

Discussion

Exosomes לעתים קרובות לשאת מאפיינים של התאים ששחררו אותם, ואת כמות exosomes שוחרר יכול להיגרם על ידי גירויים 4 . המדיום התרבות של תאים ניתן לאסוף ונתונה ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור EV / אוסף exosome ( איור 1 ). אין כרגע הסכמה כללית על שיטה אידיאלית לבודד EVS...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחקר הבריאות (05A1-CSPP16-014, HJL) וממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K ultracentrifugeBeckman393253
SW28 Ti RotorBeckman342204
SW41 RotorBeckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep Sigma-AldrichD155660% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibodyGeneTexGTX1017661:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD9 antibodyGeneTexGTX1009121:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD63 antibodyAbcamAb594791:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
TSG101 antibodyGeneTexGTX1187361:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
GAPDHGeneTexGTX1001181:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesfluorescence cell analyzer
collagenase Type IV Thermo17104019
trypsinThermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutaseebioscience00-4555-56a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase STEMCELL79135 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibodyBiolegend3136111:50
anti-EpCAM antibodyBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencescell sorter
carmine alumSigma-AldrichC1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)gifts from Dr. Robert Weinberg
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
sodium bicarbonateZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisoneSigma-AldrichSI-H0888
Insulin Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15 cm culture dishFalcon 353025
table-top centrifugeEppendrof Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tubeBeckman344058
PBS (Phosphate-buffered saline) Corning46-013-CM
BCA Protein AssayThermo Fisher Scientific 23228
Transmission Electron MicroscopyHitachiHT7700
gelatin STEMCELL7903
10 cm culture dishFalcon 353003
6-well culture dishCorning3516
female C57BL/6 miceNLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)BioWest S01520
gentamycinThermo Fisher Scientific 15710072
Pen/StrepCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
isofluorane HalocarbonNPC12164-002-25
formaldehydeMACRONH121-08
EtOH (Ethanol)J.T. Baker800605
glacial acetic acidPanreac131008.1611
aluminum potassium sulfateSigma-Aldrich12625
Xylene Leica3803665
0.22 μm membranesMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP Wound Clip ApplierBD Biosciences427630
CellMask™ Deep RedThermo Fisher Scientific C10046plasma membrane stain

References

  1. Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
  2. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  3. Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
  4. Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
  5. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
  6. György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  7. Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  12. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  13. Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  16. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
  17. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
  18. Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124exosomenanoparticleultracentrifugation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved