Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Özet

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Özet

Hücreler, ekzozomlar, proteinler, lipidler ve nükleik asitler içeren ~ 100 nm'lik ekstraselüler veziküllerle (EV'ler) iletişim kurabilir. Yapışık olmayan / mezenkimal meme epitel hücresi (NAMEC) kaynaklı ekstrasellüler veziküller, NAMEC ortamından diferansiyel ultra-santrifüj ile izole edilebilir. Yoğunluklarına bağlı olarak EV'ler 110.000 x g'de ultra-santrifüjleme yoluyla saflaştırılabilir. Ultra-santrifüjden elde edilen EV preparatı, çözünebilir proteinlerle kontaminasyonu önlemek için sürekli bir yoğunluk gradyanı kullanılarak daha da ayrılabilir. Ardından, saflaştırılmış EV'ler, müstahzar içindeki veziküllerin sayısını ve sayısını ölçen nanopartikül izleme analizi kullanılarak daha da değerlendirilebilir. 50 ila 150 nm arasında değişen boyuttaki hücre dışı veziküller eksozomlardır. NAMEC türevli EV'ler / eksozomlar, flow sitometri ve konfokal mikroskopi ile ölçülebilen meme epitel hücreleri tarafından alınabilir. Bazı meme kök hücre özellikleri ( örneğin, meme bezi oluşturma yeteneği) canGövde benzeri NAMEC'lerden NAMEC türevi EVs / eksozomlar yoluyla meme epitel hücrelerine aktarılmalıdır. EpCAM ^lo / CD49f ^yüksek bazal meme epitel hücreleri transplantasyondan sonra meme bezlerini oluştururken, izole primer EpCAM ^merhaba / CD49f luminal meme epitel hücreleri fare yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri oluşturamazlar. EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücreleri tarafından NAMEC türevi EVs / ekzozomların alınması, yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri üretmelerine izin verir. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilen EVs / eksozomlar meme bezi oluşturma yeteneğini EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerine aktarır.

Giriş

Eksozomlar, hücreler arasında membran ve sitozolik proteinler, lipidler ve RNA'lar aktararak hücresel iletişimi arabuluculuk edebilir ¹ . Eksozom aracılı iletişimin pek çok fizyolojik ve patolojik sürece dahil olduğu gösterilmiştir ( örn., Antijen sunumu, tolerans ² gelişimi ve tümör ilerlemesi ³ ). Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan kaynak hücrelerinkine benzer içerikler içerir. Böylece, eksozomlar, kaynak hücrelerden spesifik hücre özelliklerini taşıyabilir ve bu özellikleri, hücreleri sindiren hücrelere aktarabilir ⁴ .

Ekzozomlar, 50 ila 150 nm çift katmanlı veziküllü ve mevcut spesifik belirteçlerdir ( örn., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101). Bu nedenle, eksosomlar farklı yönler için çeşitli yöntemlerle karakterize edilmelidir. İletim elektron mikroskobu, zar vezikülleri görselleştirmek için kullanılabilirEksosomlar ^{4 , 5 gibi} . Saflaştırılmış eksosomların boyut ve sayısını ölçmek için nanopartikül izleme analizi (NTA) ve dinamik ışık saçılım analizi (DLS) kullanılmaktadır. Ekzozomların lipid zar içeriği yoğunluk gradyanı ile doğrulanabilir. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101 ^{6 , 7} gibi ekzozom belirteçleri Western blot ile ölçülebilir.

Laminal hücreler ^{8 , 9 , 10} olamazken, meme bazal hücreleri yağ bezlerine implante ederken meme bezleri üretme özelliğine sahiptir. Böylece, meme bazal hücreleri aynı zamanda meme yeniden nüfuz üniteleri olarak da adlandırılır. Meme bazal ve luminal hücrelerin modelini kullanarak EV / eksosomların farklı hücre popülasyonları arasında hücre özelliklerini aktarma yeteneği incelenebilir. Bu işMeme bazal epitel hücrelerinden meme luminal epitel hücrelerine gland oluşturma yeteneğini, meme bazal epitelyal hücrelerden türetilen EVs / eksozomları kullanarak aktarma yöntemini göstermektedir. Luminal meme epitel hücreleri, bazal hücrelerden salınan EV / ekzosomların alımını takiben bazal hücre özelliklerini kazanmış ve daha sonra meme bezlerini oluşturabilir ⁴ .

Protokol

Hayvanları ilgilendiren tüm araştırmalar, Hayvan Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere uymaktadır.

1. Ekstraselüler Vesikül / Ekzoz İzolasyonu ve Validasyonu

1. 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12'den sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile yapılmış taze, serum içermeyen ortam ile kültür meme epitelyal bazal hücreleri, NAMEC'ler ⁴ ; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Sığır hipofiz hulasası (BPE; 35 μg / mL); Ve GW627368X (1 μg / mL) ile 15 cm bulaşık yıkayın.
2. Hücreleri bir hemocytometer ile saydıktan sonra, 4 gün süreyle 0 günde 15 cm'lik tabaka başına 12 mL ortamda 1.2 x 106 hücre tohumlayın.
3. Kültürde 4 gün sonra, bir masa üstü santrifüj kullanarak 5 dakika 300 xg'de kültür ortamı santrifüjleyin. Süpernatantı konik bir boruya aktarın ( Şekil 1 ).
4. Süpernatantı santrifüjleyinBir masa üstü santrifüjünde 2,000 xg'de 20 dakika. Süpernatantı bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ve ölü hücreleri ve hücre pisliğini bırakın ( Şekil 1 ).
5. Süpernatantı 10,000 xg'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ( Şekil 1 ).
6. Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ).
7. Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. EV / exosome peletini PBS'ye tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ). 240 uM-80 mL NAMEC klimatlı ortamdan izole edilen pelleti 100 uL'de tekrar süspanse edin.
8. EV süspansiyonunun protein konsantrasyonunu BCA protein deneyi ile ölçün. Konsantrasyonun 20-40 μg / 100 μL civarında olduğundan emin olun. Için -20 ° C'de muhafaza edinIleri analiz.
9. Daha önce Gardiner ve ark. Tarafından anlatıldığı gibi nanopartikül izleme analizi (NTA) ile EV'lerin / eksosomların konsantrasyonunu ve boyutunu ölçün . ¹¹ . EVs / ekzozomları (20 μg / 100 μL) PBS ile NTA analizi için 10.000 katına kadar sulandırın.
   NOT: NTA analizinin sonucu analiz edilen veziküllerin sayısını ve boyutunu yansıtır.
10. Daha önce Lin ve ark . Tarafından açıklandığı üzere transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile EV / eksosomları görüntüleme ⁴ .

2. Bir Yoğunluk Degradesi Kullanılarak Exosome Arıtma

1. PBS (2 mL) içinde% 40'lık (w / v) iyodixanol içinde adım 1.7'den elde edilen 110.000 g peleti tekrar süspansiyon haline getirin. Bir ultra-santrifüj tüpünde bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için karışımı sırayla PBS'de (her biri 2 mL)% 30,% 20,% 10 ve% 5 (w / v) iyodiksanol bölümleriyle örtün.
2. Karışımı 200 ° C'de 8 saat boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
3. Her gradyan fraksiyonunu toplayın (10 çarpıons; 1 mL / fraksiyon) tüpün üstünden bir pipet ile kondu.
4. SDS-PAGE ¹² ve Western leke ile her bir fraksiyonda exozom belirteçlerinin ( örneğin, CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) varlığını analiz edin. Her fraksiyonun 50 μL'lik süspansiyonlarını% 0.1 (w / v) SDS içeren% 10'luk bir jel üzerine yükleyin ve fraksiyonlarda proteinleri jel elektroforeziyle ayırın.
5. Proteinleri bir jelden bir PVDF zarına aktarın ve membranı, exozom belirteçlerine ( örn., CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) karşı antikorlar ve gece boyunca oda ısısı proteini GAPDH'yi ( Tablolar Tablosu ) 4 ° C'de inkübe edin .
   NOT: Sonuç, eksosom içeren fraksiyonu tanımlar.

3. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Etiketleme

1. Adım 1.7'de elde edilen EVs / ekzosomları 10 μM karboksi floresein sukkinimidil diasetat ester (CFSE) 20 μg exozomal protein / 100 μL'de askıya alınız. Paralel bir örnek hazırlayınSadece CFSE'ye ve PBS'e sahip olmak, daha sonra EV / eksozom alım testleri için negatif bir kontrol olarak işlendi. Karışımları 37 ° C'de 30 dakika bekletin.
2. EVs / ekzosomları 50x hacim PBS'de askıya alın ve süspansiyonu 110,000 xg'de 4 ° C'de 60 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin. Adım 3.2'yi bir kez tekrarlayın.
3. EVs / ekzosomları PBS'de 20 μg exozomal protein / 100 μL konsantrasyonda askıya alın ve sonra EV / eksosomları hücrelere eklemeden önce EV / exosomes'ı 0.22 μm membranlar yoluyla filtreleyin.

4. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Alım Testi

1. Kültür ortamı yapmak için, 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12, sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile karıştırılır; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Ve BPE (35 μg / mL) ^4'tür . İnsan meme epitel HMLE hücrelerini 6 oyuklu tabaklarda (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> hücreler / kuyu) EV / eksozom tedavisinden bir gün önce. 2-6 saat boyunca HMLE hücrelerinin kültür ortamına adım 3.3'te elde edilen 2 μg / mL CFSE floresan etiketli EVs / exosome ekleyin. Negatif kontrol grubunun HMLE hücrelerini 3. adımda anlatılan paralel hazırlık ile tedavi edin.
2. 2-6 saatlik inkübasyondan sonra hücreleri oda sıcaklığında 4 mL PBS ile iki kez yıkayın.
3. 10 dakika% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve% 0.2 FBS içeren PBS hücrelerini yeniden askıya alın. Bir flüoresan hücre analizörü ⁴ kullanarak hücrelerdeki floresans yoğunluğundan EV / exosome alımını ölçün. EVs / eksosomlarla tedavi edilen hücreleri veya konfokal mikroskobu kullanarak negatif kontrol edin.
   NOT: Hücrelerdeki yeşil flüoresans EV / eksosom tutulumundan kaynaklanır. Mikroskop ayarları için Şekil 6'daki efsaneye bakın.

5. Primer Fare Memeli Epitelyal Hücrelerinin İzolasyonu

1. 10 cm bulaşıklara 12 ml% 0.1 jelatin solüsyonu ekleyerek jelatin kaplı yemekleri hazırlayın. Plakaları 30 dakika 37 ° C inkübatör yerleştirin. Jelatin solüsyonunu çıkartın ve jelatin kaplaması kuruyana kadar kapakları tabakalı tabakalar halinde 4 saat boyunca bırakın.
2. Makas kullanarak 12 haftalık bakire diş C57BL / 6 farelerinden 2, 3, 4 ve 5 numaralı meme bezlerini ( Şekil 2 ) parçalayın ve bezleri küçük parçalar halinde (2 mm2) bir ustura ile kesip kesin.
3. Daha sonra 37 ° C'de 60 dakika boyunca meme bezlerinin bulamaçını (10 fareden) ayrıştırın,% 0.2 kolajenaz IV,% 0.2 tripsin,% 5 FBS, 5 μg / mL gentamisin içeren 50 mL DMEM / F12 ile 120 rpm karıştırma , Ve 1x kalem strep.
4. 10 dakika süreyle 350 xg'da santrifüje ederek karışımdaki epitelyal organoidleri peletleyin.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 mg / mL DNase I ile 4 mL DMEM / F12'deki epitelyal organoidleri askıya alın. Final'e 6 mL DMEM / F12 ekleyin.Hacmi 10 mL.
6. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
7. Peleti 10 mL DMEM / F12 içinde tekrar süspanse edin. Süspansiyonu santrifüjleyin, ancak hız 400 x g'ye ulaştığında frene basın. Süpernatanı atın.
   NOT: Fren isabet ederek, epitel organoitleri çabucak peletlenirken fibroblastlar tek hücreler olarak hala süpernatantta kalırlar.
8. 5.6 ve 5.7 adımlarını 5-7 kere tekrarlayın. Süspansiyonu bir hemositometreye bir damla ilave edin ve sonra her santrifüj işleminden sonra mikroskopik olarak organoid karışımdan fibroblastların temizlenmesini kontrol edin ( Şekil 3 ).
9. Adım 5.1'de elde edilen jelatin kaplı çanak içerisindeki organoidleri 1x ITS,% 5 FBS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strep içeren DMEM / F12 ile 48 saat plaka haline getirin.
10. 48 saat sonra, kültür ortamındaki yüzen hücreleri ortamı, FBS içermeyen taze kültür ortamı ile değiştirerek çıkarın (1x ITS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strepten oluşan DMEM / F12).
11. Memedeki epitel hücrelerinin tek tabaka- sının 3 gün içinde bağlı epitel organoidlerinden göç ettiğini ve büyüdüğünü doğrulayın.

6. Primer Fare Bazal / Luminal Memeli Epitelyal Hücrelerin Ayrılması

1. 3 günlük kültürden sonra fare birincil meme hücrelerini proteolitik ve kolajenolitik enzim aktivitesi olan doğal bir enzim karışımı ile 20 dakika ayırın. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
2. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre pelletini 5 mg / mL dispazda 20 dakika boyunca tekrar süspanse edin. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
3. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
4. Seyreltilmiş 10 ⁷ hücre / mL'lik bir konsantrasyonda% 0.2 FBS ile 100 uL PBS'de hücrelerin yeniden askıya alındıAnti-CD49f ve anti-EpCAM antikorlarının buz üzerinde 1 saat karanlıkta tutulması.
5. PBS ile hücreleri yıkayın ve daha sonra karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde fluorofor-konjuge sekonder antikor ile hücreleri inkübe edin.
6. Yıkayın ve% 0.2 FBS ile PBS içinde hücreleri askıya alınız.
7. EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini bir hücre sıralayıcı ⁴ üzerinde sıralayın.

7. Ekstrasellüler Vesikül / Exozom Tedavisi

1. Sıralanmış EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini jelatin kaplı 6-iyi kaplar (2 x 10 ⁵ hücre / oyuk) üzerinde adım 6.7'den tohumlayın ve daha sonra bunlara PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevi EVs / ekzozomlar ile muamele edin Adım 1.7'de elde edilmiştir.
2. Uzun süreli kültür tedavisinde EVs / eksosomların biyolojik etkinliğini sağlamak için, hücre kültürü ortamını her iki günde PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevli EV / eksosom içeren taze ortam ile değiştirin. Fare primasını bölme.Ry luminal hücrelerinde 10 gün süreyle tedavi edildi.

8. Memeli Epitelyal Hücrelerin Yağ Pad Enjeksiyonu

1. İzoflüoran 2-3% inhalant içeren 3 haftalık bir kadın C57BL / 6 fareyi anestezi altına alın.
2. Anestezi uygulanmış fareyi sırtına yerleştirin. Karın ortasındaki kürkü bir ustura / saç kremi kullanarak çıkarın ve cerrahi alanı% 70 alkol ve povidon iyot içeren üç dönüşüm döngüsü ile temizleyin.
3. Makaslarla ventral torasik-inguinal bölge boyunca cilt boyunca 1.5 cm dikey kesi yapın ve ardından dönüşümlü olarak sağ ve sol ^4. meme yağ pedlerini gösterin.
4. Her yağ yastığını, bez parankimi makasla çıkartarak temizleyin. Yağ pedindeki lenf düğümünü bulun ve lenf düğümünün altındaki tüm bez parankimini çıkarın.
   NOT: Yağ yastığının üçte ikisi yerde kalmalıdır.
5. Adım 7.2'den elde edilen hücreleri , doğal bir enzim karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız ) ile proteolitik a10 dakika boyunca kolajenolitik enzim aktivitesi. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
6. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bir hemositometre ile hücreleri sayın ve 15 μL istenen hücre dozu (10 ⁴ -10 ² hücre / ped) içeren bir konsantrasyonda PBS hücreleri askıya alın.
7. Bir meme epitel hücre süspansiyonu 15 mcL bir yağ yastığı içine bir 27G iğne bağlı bir 100 uL cam şırınga kullanarak enjekte edin.
8. Diğer taraftaki yağ yastığı için 8.4-8.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Yara klipleri ile deriyi kapatın.

9. Meme Bezi Tüm Montaj

1. Fareyi, hücre enjeksiyonundan 8 hafta sonra CO ₂ artı servikal çıkığı ile euthanize edin (Adım 8.7).
2. Göğüs bölgesinden kasık bölgesine makas kullanarak cilt katmanı üzerinden dikey bir kesi yapın ve ardından sağ ve sol ^4. mAmmary yağ pedleri. ^4. meme bezlerini çıkartın ( Şekil 2 ).
3. Yağlı pedleri cam mikroskop lamları üzerine yayın ve gece boyunca oda sıcaklığında Kahle fiksatif (% 4 formaldehit,% 30 EtOH ve% 2 buzlu asetik asit) ile yağ yastıklarını sabitleyin.
   Dikkat: Kahle fiksatif maddesi tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın.
4. Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH içinde 15 dakika yıkayın ve sonra 250 mL dH20 ile 5 dakika yıkayın. Yağ pedlerini gece boyunca oda sıcaklığında karmine şapla (1 g araba atığı ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat içinde 500 mL dH20) lekeleyin.
5. Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH ile 15 dakika yıkayın, 250 mL 95% EtOH 15 dakika ve 250 mL% 100 EtOH ile 15 dakika yıkayın.
6. Yağlı pedler gün boyunca ksilen içinde temizlenir ve yağ pedleri saydam hale geldiğinde ksilen inkübasyonunu durdururlar.
   Dikkat: Ksilen tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın.
7. Slaytları monte edin(2,400 dpi) dijital bir slayt tarayıcısı kullanarak yağ yastıklarının alın.

Sonuçlar

PGE ₂ / EP ₄ sinyallemesinin engellenmesinin, meme bazal benzeri kök hücrelerden EV / exosome salınımını tetiklediği gösterildiğinden, bu çalışma, meme epitelyal bazal hücre (NAMEC) kültüründen indüklenen EV / eksosomların izole edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. NAMEC'ler serum içermeyen ortamda kültürlendiğinden, serum 13'den türetilmiş önceden EV / ekzosom bulunmamaktadır. Serum içeren ortamda kültürlenen hücreler için...

Tartışmalar

Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan hücrelerin özelliklerini taşır ve salınan eksosom miktarı uyaranlar 4 tarafından indüklenebilir. Hücrelerin kültür ortamı toplanabilir ve EV / ekzosom toplamak için diferansiyel ultrasantrifüj işlemine tabi tutulur ( Şekil 1 ). Şu anda EV'leri / eksosomları izole etmek için ideal bir yöntem hakkında genel bir mutabakat yok. Burada kullanılan en uygun yöntem, aşağı yönlü uygulama ¹⁴ tarafı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15 cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10 cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain