Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Zusammenfassung

Zellen können über Exosomen, ~ 100-nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die Proteine, Lipide und Nukleinsäuren enthalten, kommunizieren. Nicht adhärierende / mesenchymale Mamma-Epithelzellen (NAMEC) -gesteuerte extrazelluläre Vesikel können aus NAMEC-Medium durch differentielle Ultrazentrifugation isoliert werden. Basierend auf ihrer Dichte können EVs durch Ultrazentrifugation bei 110.000 x g gereinigt werden. Die EV-Präparation aus der Ultrazentrifugation kann unter Verwendung eines kontinuierlichen Dichtegradienten weiter getrennt werden, um eine Kontamination mit löslichen Proteinen zu verhindern. Die gereinigten EVs können dann mit Hilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse weiter ausgewertet werden, die die Größe und Anzahl der Vesikel in der Präparation misst. Die extrazellulären Vesikel mit einer Größe von 50 bis 150 nm sind Exosomen. Die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen können von Mamma-Epithelzellen aufgenommen werden, die durch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie gemessen werden können. Einige Mamma-Stammzellen-Eigenschaften ( z. B. Brustdrüsen-bildende Fähigkeit) könnenVon den Stamm-ähnlichen NAMECs zu den Mamma-Epithelzellen über die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen übertragen werden. Isolierte primäre EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminalen Mamma Epithelzellen können keine Mammadrüsen bilden, nachdem sie in Mausfettkissen transplantiert wurden, während EpCAM ^lo / CD49f ^hi basale Mammaepithelzellen nach der Transplantation Mamidrüsen bilden. Aufnahme von NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen durch EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminalen Mamma-Epithelzellen ermöglicht es ihnen, Brustdrüsen zu erzeugen, nachdem sie in Fettpolster verpflanzt wurden. Die aus stammähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnenen EVs / Exosomen übertragen die Brustdrüsen-bildende Fähigkeit zu EpCAM ^hi / CD49f-luminalen Mamma-Epithelzellen.

Einleitung

Exosomen können die zelluläre Kommunikation durch Übertragung von Membran und zytosolischen Proteinen, Lipiden und RNAs zwischen den Zellen vermitteln. Es wurde gezeigt, dass die Exosomen-vermittelte Kommunikation in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert ist ( dh die Antigenpräsentation, die Entwicklung der Toleranz ² und die Tumorprogression ³ ). Exosomen haben oft ähnliche Inhalte wie die Quellzellen, die sie freisetzen. So können die Exosomen spezifische Zelleigenschaften aus den Quellzellen tragen und diese Eigenschaften an die Zellen übertragen, die sie einnehmen ⁴ .

Exosomen sind 50- bis 150-nm-Doppelschicht-Membran-Vesikel und präsentieren spezifische Marker ( zB CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix und TSG101). So müssen Exosomen durch verschiedene Methoden für verschiedene Aspekte charakterisiert werden. Die Transmissionselektronenmikroskopie kann zur Visualisierung von Membranblasen verwendet werdenWie Exosomen ^{4 , 5} . Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS) dienen zur Messung der Größe und Anzahl der gereinigten Exosomen ⁴ . Der Lipidmembrangehalt von Exosomen kann durch Dichtegradient verifiziert werden. Exosomale Marker wie CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix und TSG101 ^{6 , 7} können durch Western Blotting gemessen werden.

Mamma-Basalzellen haben die Fähigkeit, Milchdrüsen zu erzeugen, wenn sie in fette Pads implantiert werden, während Luminalzellen nicht ^{8 , 9 , 10 sein können} . So werden Mamma-Basalzellen auch als Mamma-Repopulationseinheiten bezeichnet. Durch die Verwendung des Modells der Mamma-Basal- und Luminalzellen kann die Fähigkeit von EVs / Exosomen, Zellcharakteristiken zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu übertragen, untersucht werden. Diese ArbeitZeigt die Methode der Übertragung von Drüsenbildungsfähigkeit von Mamma-Basal-Epithelzellen zu Mamma-Lumen-Epithelzellen unter Verwendung von EVs / Exosomen, die aus Mamma-Basal-Epithelzellen stammen. Luminale Mammaepithelzellen erhielten Basalzelleneigenschaften nach der Einnahme von aus Basalzellen abgesonderten EVs / Exosomen und können dann Milchdrüsen bilden ⁴ .

Protokoll

Alle Forschungen, die Tiere betreffen, erfüllten Protokolle, die vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege genehmigt wurden.

1. Extrazelluläre Vesikel / Exosom Isolierung und Validierung

1. Kultur-Mamma-Epithel-Basalzellen, NAMECs ⁴ , mit frischem, serumfreiem Medium aus 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 mit Natriumbicarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 & mgr; g / ml); Insulin (5 & mgr; g / ml); Rinder-Hypophysenextrakt (BPE, 35 μg / ml); Und GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm Schalen.
2. Nach dem Zählen der Zellen mit einem Hämocytometer, Saatgut 1,2 x 10 ⁶ Zellen in 12 ml Medium pro 15-cm-Schale am Tag 0 für 4 Tage ⁴ .
3. Nach 4 Tagen in Kultur wird das Kulturmedium bei 300 xg für 5 min unter Verwendung einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand auf ein konisches Rohr (Abbildung 1 ).
4. Zentrifugieren Sie den ÜberstandBei 2.000 xg für 20 min in einer Tischzentrifuge. Übertragen Sie den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und lassen Sie die toten Zellen und Zelltrümmer (Abbildung 1 ).
5. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen (Abbildung 1 ).
6. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren (Abbildung 1 ).
7. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen. Das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren (Abbildung 1 ). Das Pellet, das aus 240-480 ml NAMEC-konditioniertem Medium in 100 & mgr; l isoliert wurde, resuspendieren.
8. Messen Sie die Proteinkonzentration der EV-Suspension mit dem BCA-Protein-Assay. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration etwa 20-40 μg / 100 μL beträgt. Bei -20 ° C aufbewahrenweitere Analyse.
9. Messen Sie die Konzentration und Größe der EVs / Exosomen durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), wie zuvor von Gardiner et al. ¹¹ Verdünnen Sie die EVs / Exosomen (20 μg / 100 μL) mit PBS auf 10.000-fach für die NTA-Analyse.
   HINWEIS: Das Ergebnis der NTA-Analyse spiegelt die Anzahl und Größe der untersuchten Vesikel wider.
10. Bild der EVs / Exosomen mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), wie zuvor von Lin et al. ⁴ beschrieben.

2. Exosome Reinigung mit einem Dichtegradienten

1. Das 110.000 g Pellet aus Schritt 1.7 in 40% (w / v) Iodixanol in PBS (2 ml) resuspendieren. Übertragen Sie die Mischung in Sequenz mit Aliquots von 30%, 20%, 10% und 5% (w / v) Iodixanol in PBS (jeweils 2 ml), um einen Dichtegradienten in einem Ultrazentrifugenröhrchen zu bilden.
2. Die Mischung bei 200.000 xg für 8 h bei 4 ° C zentrifugieren.
3. Sammle jede Gradientenfraktion (10 FraktaleOns; 1 ml / Fraktion) mit einer Pipette von der Oberseite des Röhrchens.
4. Analysieren Sie das Vorhandensein von Exosommarkern ( z. B. CD81, CD9, CD63 und Tsg101) in jeder Fraktion durch SDS-PAGE ¹² und Western Blot. 50 μl Suspensionen jeder Fraktion auf ein 10% Gel mit 0,1% (w / v) SDS geben und die Proteine ​​in Fraktionen mit Gelelektrophorese trennen.
5. Übertragen Sie die Proteine ​​von einem Gel auf eine PVDF-Membran und inkubieren Sie die Membran mit Antikörpern gegen die Exosommarker ( z. B. CD81, CD9, CD63 und Tsg101) und Housekeeping Protein GAPDH über Nacht ( Table of Materials ) bei 4 ° C.
   HINWEIS: Das Ergebnis identifiziert die Fraktion, die Exosomen enthält.

3. Extrazelluläre Vesikel / Exosom-Kennzeichnung

1. Suspendieren Sie die in Schritt 1.7 erhaltenen EVs / Exosomen in 10 μM Carboxyfluorescein-Succinimidyldiacetatester (CFSE) bei 20 μg exosomalen Protein / 100 μl. Vorbereitung einer parallelen Probe coNur CFSE und PBS, die in gleicher Weise verarbeitet wurden, als Negativkontrolle für die späteren EV / Exosom-Aufnahme-Assays. Lassen Sie die Mischungen bei 37 ° C für 30 min.
2. Suspendieren Sie die EVs / Exosomen in 50x Volumen PBS und zentrifugieren Sie die Suspension bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren. Wiederholen Sie Schritt 3.2 einmal.
3. Die EVs / Exosomen in PBS in einer Konzentration von 20 μg exosomalen Protein / 100 μl suspendieren und dann die EVs / Exosomen durch 0,22 μm Membranen filtrieren, bevor die EVs / Exosomen den Zellen zugesetzt werden.

4. Extrazellulärer Vesikel / Exosom-Aufnahme-Assay

1. Zur Herstellung von Kulturmedium werden 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 mit Natriumbicarbonat (0,2438%) vermischt; EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 & mgr; g / ml); Insulin (5 & mgr; g / ml); Und BPE (35 & mgr; g / ml) ⁴ Tafeln Sie die menschlichen Mamma-Epithel-HMLE-Zellen in 6-Well-Schalen (1 x 10 ^{6 <)}/ Sup> Zellen / gut) einen Tag vor EV / Exosom Behandlung. Addieren Sie 2 μg / ml CFSE fluoreszenzmarkiertes EVs / Exosom, erhalten in Schritt 3.3, zum Kulturmedium der HMLE-Zellen für 2-6 h. Behandeln Sie die HMLE-Zellen der negativen Kontrollgruppe mit der in Schritt 3.1 beschriebenen Parallelpräparation.
2. Nach der 2- bis 6-h-Inkubation die Zellen zweimal mit 4 ml PBS bei Raumtemperatur waschen.
3. Die Zellen mit 0,25% Trypsin für 10 min abtrennen und die Zellen in PBS, die 0,2% FBS enthalten, erneut suspendieren. Messen Sie die EV / Exosom-Aufnahme von der Fluoreszenzintensität in den Zellen mit einem Fluoreszenzzellenanalysator ⁴ . Bild die mit EVs / Exosomen behandelten Zellen oder die Negativkontrolle mit konfokaler Mikroskopie.
   HINWEIS: Die grüne Fluoreszenz in den Zellen wird durch die EV / Exosom-Aufnahme verursacht. Siehe die Legende von Abbildung 6 für die Mikroskopeinstellungen.

5. Isolierung der primären Maus Mamma Epithelzellen

1. Gelatine-beschichtete Schalen vorbereiten, indem man 12 ml 0,1% ige Gelatinelösung auf 10 cm Schalen zugibt. Legen Sie die Platten in einen 37 ° C Inkubator für 30 min. Entfernen Sie die Gelatinelösung und lassen Sie den Deckel 4 Stunden lang in einer laminaren Fließhaube aus dem Geschirr, bis die Gelatinebeschichtung getrocknet ist.
2. Die Zahl 2, 3, 4 und 5 Milchdrüsen ( Abbildung 2 ) von 12 Wochen alten weiblichen C57BL / 6 Mäusen unter Verwendung von Scheren zerlegen und die Drüsen in kleine Stücke (2 mm ² ) mit einem Rasiermesser schneiden.
3. Weiterhin dissoziieren Sie die Aufschlämmung von Milchdrüsen (von 10 Mäusen) für 60 min bei 37 ° C, 120 U / min Rühren mit 50 ml DMEM / F12, enthaltend 0,2% Kollagenase Typ IV, 0,2% Trypsin, 5% FBS, 5 μg / ml Gentamycin , Und 1x Pen-Strep.
4. Die Epithelorganoide aus der Mischung durch Zentrifugation bei 350 xg für 10 min abtupfen.
5. Die Epithelorganoide in 4 ml DMEM / F12 mit 0,1 mg / ml DNase I für 5 min bei Raumtemperatur suspendieren. Füge 6 mL DMEM / F12 zu einem Finale hinzuVolumen von 10 ml.
6. Die Suspension bei 400 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
7. Das Pellet in 10 ml DMEM / F12 resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Aufhängung, aber schlagen Sie die Bremse, wenn die Geschwindigkeit 400 x g erreicht. Den Überstand verwerfen.
   HINWEIS: Beim Schlagen der Bremse werden die Epithelorganoide schnell heruntergekrampft, während Fibroblasten als Einzelzellen noch im Überstand bleiben.
8. Wiederholen Sie Schritt 5.6 und 5.7 5-7 mal. Fügen Sie einen Tropfen der Suspension zu einem Hämocytometer hinzu und überprüfen Sie dann den Abstand der Fibroblasten aus der Organoidmischung unter Mikroskopie nach jeder Zentrifugationsrunde (Abbildung 3 ).
9. Die in Schritt 5,1 erhaltenen Organoide in der mit Gelatine beschichteten Schale mit DMEM / F12, enthaltend 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / mL Gentamycin, 10 ng / mL EGF und 1x Pen-Strep.
10. Nach 48 h entfernen Sie die schwimmenden Zellen in der Kultur, indem Sie das Medium durch frisches Kulturmedium ohne FBS (DMEM / F12, enthaltend 1x ITS, 50 μg / ml Gentamycin, 10 ng / ml EGF und 1x Pen-Strep).
11. Vergewissern Sie sich, dass eine Monoschicht von Mamma-Epithelzellen in 3 Tagen aus den angehängten Epithelorganoiden wandert und wächst.

6. Trennung der primären Maus Basal / Luminal Mamma Epithelzellen

1. Nach der 3-tägigen Kultur lösen Sie die Maus-Primär-Mamma-Zellen mit einer natürlichen Enzymmischung mit proteolytischer und kollagenolytischer Enzymaktivität für 20 min. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS.
2. Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 5 mg / ml Dispos für 20 min resuspendiert. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS.
3. Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
4. Die Zellen in 100 μl PBS mit 0,2% FBS in einer Konzentration von 10 ⁷ Zellen / ml mit dem verdünnten erneut suspendiertAnti-CD49f und anti-EpCAM-Antikörper auf Eis für 1 h im Dunkeln.
5. Die Zellen mit PBS waschen und dann die Zellen mit Fluorophor-konjugiertem Sekundärantikörper auf Eis für 30 min im Dunkeln inkubieren.
6. Die Zellen in PBS mit 0,2% FBS waschen und erneut suspendieren.
7. Sortieren Sie die EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal Mamma Epithelzellen auf einem Zellsortierer ⁴ .

7. Extrazelluläre Vesikel / Exosomenbehandlung

1. Die sortierten EpCAM- ^hi / CD49f-luminalen Mamma-Epithelzellen aus Schritt 6.7 auf mit Gelatine beschichteten 6-Well-Schalen (2 x 10 & ^sup5; Zelle / Vertiefung) und behandeln sie dann mit PBS oder den 2 & mgr; g / ml NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen Erhalten in Schritt 1.7.
2. Um die biologische Wirksamkeit der EVs / Exosomen in der Langzeitkulturbehandlung zu gewährleisten, ersetzen Sie das Zellkulturmedium mit frischem Medium, das PBS oder 2 μg / mL NAMEC-abgeleitete EVs / Exosomen enthält, alle zwei Tage. Spalte nicht die Maus primaRum-luminalen Zellen während der 10-tägigen Behandlung.

8. Fat Pad Injektion von Mamma Epithelzellen

1. Betäubung eines 3 Wochen alten weiblichen C57BL / 6 Mäusen mit Isofluoran 2-3% Inhalationsmittel.
2. Lege die betäubte Maus auf den Rücken. Entfernen Sie das Fell auf dem Mittelabdomen mit einem Rasiermesser / Haarcreme und reinigen Sie die Chirurgie mit drei wechselnden Zyklen von 70% Alkohol und Povidon-Jod.
3. Machen Sie einen 1,5 cm vertikalen Schnitt durch die Haut entlang der ventralen thoracic-inguinal Region mit Schere und dann abwechselnd aussetzen die rechten und linken 4th Mamma Fett Pads.
4. Löschen Sie jeden Fett-Pad durch Entfernen von Drüsen-Parenchym mit Schere. Lokalisieren Sie den Lymphknoten in der Fett-Pad und entfernen Sie dann die ganze Drüsen-Parenchym unter dem Lymphknoten.
   HINWEIS: Zwei Drittel des Fettkissens sollten an Ort und Stelle bleiben.
5. Die aus Schritt 7.2 erhaltenen Zellen mit einer natürlichen Enzymmischung (siehe Tabelle der Materialien ) mit proteolytischem a abziehenKollagenolytische Enzymaktivität für 10 min. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS.
6. Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und suspendieren Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration, so dass 15 μl die gewünschte Zelldosis (10 ⁴ -10 ² Zelle / Pad) enthält.
7. Injektion von 15 & mgr; l Mamma-Epithelzellsuspension in ein Fettkissen unter Verwendung einer 100 & mgr; l Glasspritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist.
8. Wiederholen Sie die Schritte 8.4-8.7 für das Fett-Pad auf der anderen Seite.
9. Schließen Sie die Haut mit Wundclips.

9. Mammary Gland Whole Mount

1. Euthanasiere die Maus mit CO ₂ plus Zervixversetzung nach 8 Wochen nach der Zellinjektion (Schritt 8.7).
2. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Hautschicht vom Thoraxbereich zum Leistenbereich mit Schere und setzen Sie dann sowohl die rechte als auch die linke 4. m ausAmmary Fett Pads. Entfernen Sie die 4. Brustdrüsen ( Abbildung 2 ).
3. Verbreiten Sie die Fettpolster auf Glasmikroskop-Objektträger und fixieren Sie die Fettpolster mit Kahle-Fixiermittel (4% Formaldehyd, 30% EtOH und 2% Eisessig) bei Raumtemperatur über Nacht.
   Achtung: Kahles Fixativ ist ein Reizmittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Chemikalienhaube durch.
4. Waschen Sie die Fettpolster in 250 ml 70% EtOH für 15 min und dann in 250 ml dH ₂ O für 5 min. Färben Sie die Fettpolster mit Carmin Alaun (1 g Karmin und 2,5 g Aluminium Kaliumsulfat in 500 ml dH ₂ O) bei Raumtemperatur über Nacht.
5. Waschen Sie die Fettpolster mit 250 ml 70% EtOH für 15 min, 250 ml 95% EtOH für 15 min und 250 ml 100% EtOH für 15 min.
6. Reinigen Sie die Fett-Pads in Xylol für Tage und stoppen Sie die Xylol-Inkubation, wenn die Fett-Pads transparent werden.
   Achtung: Xylol ist ein Reizmittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Chemikalienhaube durch.
7. Montiere die Slides wiTen Aufnahmemedium und fotografieren (2.400 dpi) der Fettkissen mit einem digitalen Dia-Scanner.

Ergebnisse

Da sich gezeigt hat, dass die Blockierung der PGE ₂ / EP _4- Signalisierung die EV / Exosomen-Freisetzung von mamma-basalartigen Stammzellen ₄ auslöst, stellt diese Arbeit ein Verfahren zur Isolierung der induzierten EVs / Exosomen aus der Mamma-Epithel-Basalzellen (NAMEC) -Kultur dar. Da NAMECs im serumfreien Medium kultiviert werden, gibt es keine bereits vorhandenen EVs / Exosomen aus Serum ¹³ . Für Zellen, die in serumhaltigem...

Diskussion

Exosomen tragen oft Eigenschaften der Zellen, die sie freisetzen, und die Menge der freigesetzten Exosomen kann durch Stimuli ⁴ induziert werden. Das Kulturmedium der Zellen kann gesammelt und einer differentiellen Ultrazentrifugation für die EV / Exosom-Sammlung unterzogen werden (Abbildung 1 ). Es gibt derzeit keine allgemeine Vereinbarung über eine ideale Methode, um EVs / Exosomen zu isolieren. Die hier verwendete optimale Methode wurde durch die nachgeschaltet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15 cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10 cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain