Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

Resumen

Ácido siálico (Sia) es un componente muy importante de los glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos. Debido a su posición en el termini no reductores de oligo - y polisacáridos, así como sus características químicas únicas, ácido siálico está implicado en una multiplicidad de las interacciones receptor-ligando diferentes. Modificando la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por lo tanto se verá afectadas interacciones dependientes de ácido siálico. Esto puede ser útil para investigar las interacciones dependientes de ácido siálico y tiene el potencial para influir en ciertas enfermedades de una manera beneficiosa. Vía metabólica glycoengineering (MGE), puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular. Aquí, las células, tejidos o incluso todo animales son tratados con C2 modificados derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estos aminos azúcares actúan como moléculas precursoras de ácido siálico y por lo tanto son metabolizados a las especies correspondientes de ácido siálico y expresó en glicoconjugados. Aplicando este método produce interesantes efectos sobre diversos procesos biológicos. Por ejemplo, puede reducir drásticamente la expresión de ácido polysialic (polySia) en células neuronales tratadas y por lo tanto afecta la diferenciación y el crecimiento neuronal. A continuación, os mostramos la síntesis química de dos de los más comunes derivados de C2 modificado N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) y N- butanoylmannosamine (ManNBut) y además mostrar cómo estos no natural aminos azúcares pueden aplicarse en los experimentos de cultivo celular. La expresión de especies modificadas el ácido siálico es cuantificada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y más analizada mediante espectrometría de masas. Los efectos sobre la expresión de ácido polysialic son aclados mediante Western blot utilizando un anticuerpo ácido polysialic disponibles en el mercado.

Introducción

Ácido siálico es un monosacárido que normalmente se encuentran en el termini de glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos no reductores. Entre los monosacáridos, ácido siálico tiene algunas características químicas únicas. Tiene una red de la troncal 9 C-átomo, un grupo carboxílico en la posición C-1, deprotonated y tal modo negativamente cargadas bajo condiciones fisiológicas y una función amino en la posición de C-5. Aunque más de 50 que naturalmente ocurren variantes de ácido siálico se han caracterizado a fecha1, la forma predominante de ácido siálico encontrado en seres humanos es ácido de N- acetilneuramínico (Neu5Ac). Otros mamíferos también expresan altas cantidades de N- glicolilneurimínico ácido (Neu5Gc)2,3.

Debido a su posición expuesta en glicoconjugados, ácido siálico está involucrado en una gran cantidad de las interacciones receptor-ligando, por ejemplo, la Unión dependiente de hemaglutinina del virus influenza a host células4. Un epítopo de ácido siálico con importantes funciones biológicas, especialmente durante la embriogénesis y en el sistema nervioso, es el ácido polysialic. Polysialic ácido es un polímero de hasta 200 ácidos alfa siálica de 2,8-ligado. El portador de la principal proteína del ácido polysialic es la molécula de adhesión celular neural (NCAM). Expresión ácido Polysialic modula la característica adhesiva de NCAM en que expresión ácido polysialic disminuye la adherencia y aumenta la plasticidad del sistema nervioso5.

Cambios en la expresión de ácidos siálicos de (poli) en última instancia afectará a una multitud de interacciones biológicas diferentes. Esto puede usarse para estudiar procesos dependiente conocido ácido siálico a nivel molecular, para descubrir las interacciones glycoconjugate novela o explorar enfoques terapéuticos posibles. Hay diferentes métodos disponibles que puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por ejemplo el tratamiento con ácido siálico glicosidasas específicas (sialidases), inhibición de enzimas implicadas en la biosíntesis de ácido siálico6 ,7,8, derribar o cambiar la expresión de la enzima clave de la biosíntesis de ácidos siálicos9.

Otro método versátil para modular la expresión de ácido siálico es MGE (ingeniería metabólica también conocido como oligosacáridos, MOE). Aquí, las células, tejidos o incluso animales son tratados con derivados no natural de ManNAc que tener modificaciones C2-amino. Las moléculas precursoras de ácido siálico, después de la absorción celular, estos análogos de ManNAc son unidireccionales los ácidos siálico metabolizados a no natural y pueden expresarse en glicoconjugados sialylated. Las células tratan con derivados de ManNAc llevar alifáticos C2-modificaciones, tales como ManNProp o ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o el ácido N- butanoylneuraminic (Neu5But) en los glicoconjugados10 , 11. mediante el uso de grupos funcionales introducidos en la posición C2 de ManNAc, se pueden acoplar los no naturales siálico que ocurre, por ejemplo, a través de la ligadura de Staudinger o la cicloadición de azidas alkine, con tintes fluorescentes y por lo tanto visualizado en la superficie de la célula12.

La expresión de estos ácidos siálico de natural no tiene efectos interesantes en muchos procesos biológicos, incluyendo las infecciones del patógeno, la adhesión y migración de las células tumorales, adhesión celular general, así como vascularización y diferenciación (para revisión Ver: Wratil et al. 13). Curiosamente, MGE con N-acil modificado mannosamines puede utilizarse también para interferir con la expresión de ácido polysialic. Polysialic ácido se genera por dos polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII y ST8SiaIV). Se ha demostrado, que polysialyltransferase ST8SiaII es inhibida por el ácido siálico antinatural precursores, tales como ManNProp o ManNBut de14,15. Además, se ha demostrado en células de neuroblastoma humano que uso ManNProp o ManNBut también reduce asimismo en total15.

MGE con N-acil modificado mannosamines es fácil aplicar el método que se ha utilizado con éxito, no sólo en mamíferos y cultivo celular de las bacterias sino también en todos animales de diferentes especies, como Caenorhabditis elegans16, pez cebra17, o ratones18,19,20,21. Especialmente los derivados de ManNAc teniendo modificaciones alifáticos, incluyendo ManNProp y ManNBut, son insignificante citotóxicos, incluso en concentración milimolar en medio de cultivo celular o plasma de la sangre. Además, son relativamente fáciles de sintetizar.

Aquí, nos proporcionan detalles sobre cómo usar el MGE con N-acetil modificado mannosamines. En primer lugar, la síntesis química de dos de los derivados de ManNAc más utilizados en este campo, ManNProp y ManNBut, se explica. A continuación, te mostramos cómo MGE puede ser aplicado en un experimento en vivo . Por ejemplo, la línea celular de neuroblastoma Kelly fue elegida para demostrar la expresión disminuida del epitopo polysialic por Western blot después del tratamiento con los derivados de ManNAc. Los ácidos siálicos de no natural en la superficie celular fueron cuantificados por HPLC y más analizados mediante espectrometría de masas.

Protocolo

1. preparación de tampones y reactivos

  1. Preparación de solución de metóxido de sodio de 3 mM
    1. Disolver el metóxido de sodio 8,1 mg en 50 mL de metanol (3 mM) en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitación. Almacenar a temperatura ambiente (RT) por varias semanas.
  2. Preparación del tampón Tris-HCl
    1. Combinar 8,766 g NaCl, 157 mg de Tris-HCl y 146 mg de EDTA en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitación y disolver en 80 mL de agua.
    2. Añadir hidróxido de sodio (1 M, en el agua) o HCl (20% en agua) a la solución de agitación, mientras observa el pH con un medidor de pH y ajustar el pH a 8.0.
    3. Añadir el volumen de agua necesario para alcanzar un volumen final de 100 mL. Filtrar la solución mediante un sistema de filtro estéril de 0,22 μm.
      Nota: 100 mL de Tris-HCl tampón contiene 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl y 5 mM EDTA (pH 8.0). La solución puede conservarse a 4 ° C durante varias semanas.
  3. Preparación de solución de aprotinina
    1. Disolver 10 mg aprotinina en 1 mL de agua (1,54 mM). Parte alícuota de la solución de aprotinina en 10 tubos de 1,5 mL de plástico (100 μL). Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  4. Preparación de solución leupeptin
    1. Disolver leupeptin 10 mg en 2 mL de agua (10 mM). Alícuota de la solución leupeptin 10 tubos de 1,5 mL de plástico. Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  5. Preparación de solución de fluoruro (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Disolver PMSF de 34,8 mg en 2 mL de etanol (100 mM). Parte alícuota de la solución PMSF en 10 tubos de 1,5 mL de plástico. Almacenar a-20 ° C durante varias semanas.
  6. Preparación de solución de 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-diclorhidrato (DMB)
    1. Combinar 15,62 mg DMB 352 μl de β-mercaptoetanol y 48 μl Sodio Bisulfito solución (39%) y añadir 9,6 mL de agua (6,9 mM DMB 500 mM β-mercaptoetanol y 0,19% bisulfito de sodio). Parte alícuota de la solución DMB en 40 tubos de 1,5 mL de plástico (250 μL). Almacenar protegido de la luz a-20 ° C durante varias semanas.
  7. Preparación 1 M ácido trifluoroacético (TFA) de solución de ácido
    1. Añadir 770.3 μl del 100% TFA a 9,23 mL de agua en un tubo de plástico de 15 mL (1 M). Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  8. Preparación de solución TFA de 120 mM
    1. Añadir μl 92,4 TFA (100%) a 9,91 mL de agua (120 mM) en un tubo de plástico de 15 mL. Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  9. Preparación de solución de hidróxido de sodio (NaOH) de 400 mM
    1. Disolver 160 mg NaOH en agua de 10 mL (400 mM) en un tubo de plástico de 15 mL. Almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  10. Preparación de buffer de lisis de Western blot
    1. Disolver 5,84 g NaCl, 0,1 g de Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2y Triton-X100 de 1 g en 100 mL de agua y ajustar el pH a 7.8. Almacenar a 4 ° C. Añada 100 μl de cada inhibidor de la proteasa (aprotinina, leupeptin y PMSF) antes de utilizar el tampón de lisis.
  11. Preparación del tampón de electroforesis (SDS-PAGE) de gel de poliacrilamida de sodio dodecil sulfato
    1. Disolver 0,3 g de Tris, glicina 1.5 g y 0,1 g de SDS en 100 mL de agua y ajustar el pH a 7.3. Tienda a TA.
  12. Preparación de buffer de Western blot
    1. Disolver 0,3 g de Tris, glicina 1,1 g en 90 mL de agua y añadir 10 mL de etanol. Tienda a TA.
  13. Preparación de solución de bloqueo
    1. Disolver 1 g de la energía de la leche descremada en 25 mL fosfato tamponada salino (PBS). Prepare siempre fresco.

2. síntesis de ManNProp y relacionados con N-acil-modificado Mannosamines

  1. Disolver 431,2 mg de clorhidrato de mannosamine en solución de metóxido de sodio 10 mL 3 mM en un frasco de vidrio de 50 mL con una barra de agitación.
  2. Enfriar la mezcla en hielo a 0 ° C. A la solución de agitación, agregue lentamente gota a gota 210 cloruro de propionyl μl (2,4 mmol) o cloruro de butanoyl 248 μl (2,4 mmol) para sintetizar ManNProp o ManNBut, respectivamente. Incubar la mezcla de agitación a 0 ° C durante 4 horas.
  3. Transferir la solución a un tubo de plástico de 50 mL. Meter 4-8 agujeros en la tapa del tubo plástico con una aguja fina. Congelar rápidamente la solución utilizando nitrógeno líquido y posteriormente liofilizar (freeze dry) durante 48 h o hasta que haya secado por completo.
  4. Mezclar 350 g Silicagel 60 750 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) (se trata de una suspensión). Llenar una columna de vidrio (35 mm de diámetro y 70 cm de longitud) con la suspensión de gel de sílice 60 y lavar la columna preparada con un adicional 100 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) antes del uso.
  5. Disolver los productos secos del paso 2.3 (producto 5 g secada) en 10 mL etilo acetato/metanol/agua (15:2:1) y carga a través de una pipeta sobre la sílice gel columna. Recoger fracciones de 4 mL después de 500 mL (para ManNProp). Nota: ManNBut se procederá a la elución de la columna después de aproximadamente 700 mL.
  6. Las fracciones eluídas de transferencia en tubos de plástico de 15 mL. Meter 3-6 agujeros en la tapa del tubo plástico con una aguja fina. Rápida congelación de la solución utilizando nitrógeno líquido y posteriormente liofilizarlo hasta que haya secado por completo.
    Nota: Los productos liofilizados pueden almacenarse durante varios meses a TA.
  7. Verificar la pureza de los productos por espectrometría de masas (véase sección 9).
    Nota: Como alternativa, pureza puede también ser verificada por 1H resonancia magnética Nuclear (RMN).

3. cultivo celular

  1. Cultura Kelly las células del neuroblastoma en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) que contiene 10% de suero fetal bovino, penicilina U 100, estreptomicina 100 mg, 2 mM L-glutamina que contiene 5 mM ManNAc, ManNProp de 5 mM o 5 mM ManNBut, a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Las células cultivadas en medio sin ManNAc o sus análogos se utilizan como un control.
  2. Antes de la aplicación de la mannosamines, separar las células de neuroblastoma de Kelly, incubando durante 10 min con tripsina/EDTA (0.25%, 0,02%, en PBS) y contar usando un contador de la cámara de Neubauer o celular. Las celdas de números definidos en función del tamaño de la placa/plato de semillas.
    1. Para medir el ácido siálico monosacáridos, semillas 1 x 105 células en 500 μl de medio en una placa de cultivo de tejidos 48-bien. Para el análisis de los ácidos polysialic, de la semilla 1 x 106 células en medio de 3 mL en una placa de cultivo celular de 6 cm de diámetro. Incubar a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar el medio cada 24 h.
      Nota: El efecto de MGE aumenta con el tiempo total de tratamiento. De alta eficiencia metabólica tratar las células durante 5-7 días.
  3. Después del tratamiento, decante el medio. Lavar los platos/platos con PBS. Separar las células, incubando durante 10 min con tripsina/EDTA (0.25%, 0,02%, en PBS). Neutralizar la tripsina añadiendo el mismo volumen de medio de cultivo celular para las células separadas. Transferir las células separadas en tubos de plástico de 15 mL. Centrifugar las muestras durante 3 minutos a 500 XG y descartar el sobrenadante.
    1. Añadir 5 mL PBS y centrifugar las células (véase el paso 3.3). Repetir el lavado dos veces más.
      Nota: El precipitado de células lavadas sin sobrenadante puede conservarse a-20 ° C durante varios días. Si la expresión de ácido polysialic es ser aclarada continuar sección 10.

4. lisis de células para análisis de HPLC

  1. Preparación de buffer de lisis HPLC
    1. Combinar el tampón Tris-HCl de 5 mL, 5 μl aprotinina solución, solución de leupeptin de 20 μl y 50 μl PMSF solución.
      Nota: 5 mL de tampón de lisis HPLC contendrá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 5 mM EDTA, 1.54 μm aprotinina, 40 μm Leupeptin y 1 mM PMSF (pH 8.0). Este buffer siempre debe estar preparado fresco antes de la lisis celular.
  2. Resuspenda las células recogidas pelotillas (paso 3.3) cada en 500 μl helada HPLC-tampón de lisis y ultra-someter a ultrasonidos las muestras con una aguja de procesador ultrasónico tres veces durante un período de 30 s a amplitudes de medio-alto. Enfriar las muestras en hielo durante al menos 1 minuto entre los ciclos.

5. separación de la fracción de membrana

  1. Centrifugue las muestras sometidas a lisis celular por 2 h a 20.000 x g a 4 ° C. Separar el sobrenadante (aproximadamente 480 μL), que representan proteínas citosólicas, en tubos de plástico de 1,5 mL. Determinar la concentración de proteína de las fracciones utilizando, por ejemplo, la Bradford o el ensayo de (BCA) ácido bicinchoninic.
    Nota: La concentración de proteína (aproximadamente 1 mg/mL) de las fracciones citosólicas puede más tarde ser relacionados con dosificada de las especies de ácido siálico respetado. El sedimento representa la fracción de membrana, que se utiliza en el paso 6.1.

6. ácido hidrólisis

Nota: Oligo - y polisacáridos de las membranas celulares son hidrolizados a monosacáridos. Además, posible O-modificaciones en los monosacáridos son hidrolizados, así. Esto es necesario para análisis HPLC cuantitativo, porque la mayoría de ácidos siálicos de las fracciones de membrana es incorporada naturalmente en glicoconjugados y posiblemente podría llevar O-acetil o O- lactolyl modificaciones.

  1. Añadir 150 μL 1 M TFA-solución a las fracciones separadas de la membrana (pellet de la sección 5). Incubar las muestras durante 4 horas a 80 ° C con agitación a 200-600 rpm.
  2. Centrifugar las muestras durante aproximadamente 30 minutos a 20.000 x g y 21 ° C usando tubos con 0,5 mL de filtro con 3 membranas de exclusión kDa, hasta que el volumen de la fase superior es menos de 20 μl.
    Nota: Este paso es importante desechar basura molecular mayor.
  3. La transferencia de la fase inferior que contiene moléculas más pequeñas, incluidas las especies de ácido siálico, en tubos de plástico de 2 mL. Meter 2-4 agujeros en las tapas de los tubos de plástico con una aguja fina. Rápido congelar las muestras con nitrógeno líquido y luego les liofilizar durante la noche.
    Nota: Las muestras secas pueden almacenarse durante varios días en RT. reemplazar una tapa sin agujeros para un almacenaje más largo.

7. etiquetado fluorescente

  1. Resuspenda las muestras secadas en solución TFA de 120 mM de μl 10 y añadir 50 μl solución DMB. Transferir las muestras a tubos de 1,5 mL oscuro para protegerlos de la luz ultravioleta.
  2. Normas, disolver 1 μl Neu5Ac (60 ng/mL, en agua) o 1 μl Neu5Gc (60 ng/mL, en agua) en 10 μl 120 mM TFA solución tubos de 1.5 mL oscura. Añadir 50 μl solución DMB.
  3. Incubar las muestras de membrana de la célula y los estándares durante 1,5 h a 56 ° C protección de la luz. Después de la incubación, añadir 4 μL de solución de NaOH de 400 mM a cada muestra para detener la reacción de etiquetado.

8. HPLC análisis

Nota: Las muestras etiquetadas se analizan en un sistema HPLC equipado con una columna C18 RP (110 Å, tamaño de partícula de 3 μm, 4,6 x 150 mm), un detector de fluorescencia y un colector de fracciones. Los solventes utilizados son metanol, acetonitrilo y agua. Asegúrese de desgasificar solventes todos antes de las mediciones, si el sistema HPLC carece de un desgasificador interna.

  1. Ajustar la temperatura de la columna a 40 ° C y configurar el detector de fluorescencia con 373 nm para la excitación y 448 nm para la emisión, respectivamente. Inyectar el volumen de muestra de 10 μl y separar las puntas de prueba de 50 min a 0,5 mL/min de caudal con metanol/acetonitrilo/agua (6:8:86) como eluyente. Para el análisis de espectrometría de masas, recoger los picos de interés.
    Nota: Neu5Gc debe eluido después de 6-8 min., Neu5Ac después de 9-12 min., Neu5Prop después de 17-23 min y Neu5But después de 38-44 min. Las muestras fraccionadas pueden almacenarse durante varias horas a 4 ° C protegido de la luz.
  2. Después de medir cada muestra, se lava la columna 7,5 min a velocidad de flujo de 1.0 mL/min (volúmenes de columna 1,5 ≈) con metanol y acetonitrilo/agua (6:25:69) y volver a equilibrar el sistema de 7,5 min 1,0 mL/min de caudal con metanol y acetonitrilo/agua (6:8:86).
  3. Para el análisis cuantitativo, calcular el área bajo la curva de los picos de ácido siálico de interés utilizando el software de funcionamiento del respectivo sistema de HPLC22.
    Nota: Datos obtenidos pueden ser relacionado con el Neu5Ac o el estándar de Neu5Gc y las concentraciones de proteína medido en la fracción citosólica (ver sección 5.1).

9. espectrometría de masas análisis de monosacáridos ácido siálico

Nota: Picos de retención HPLC de interés pueden ser más analizadas por espectrometría de cromatografía líquida (LC) ionización por electrospray (ESI-MS), para verificar la especie ácido siálico antinatural.

  1. Para el análisis de espectrometría de masas, inyectar 20 μl de la muestra recogida en un sistema de Detector selectivo LC/masa (MSD) con 79.9% metanol, alcohol isopropílico al 20% y 0,1% de ácido fórmico como eluyente, tasa de flujo de 0,5 mL/min, 4 kV tensión capilar y 350 ° C temperatura capilar 22 , 23.
  2. En el software de evaluación del respectivo sistema LC/MSD, seleccionar el pico de interés en el cromatograma total de iones. Ver el espectro de masas del pico resuelto. Mostrar la relación masa/carga positiva entre 300 y 700.
    Nota: DMB etiquetado de ácidos siálicos conduce a un aumento en la masa molecular de 116.2 g/mol. Las especies de ácido siálico marca DMB tienen las siguientes masas moleculares: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, Neu5Gc DMB = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM común aductos son acetonitrilo, sodio o alcohol isopropílico.

10. Western Blot análisis de ácido Polysialic en las células del Kelly Neuroblastoma

  1. Preparación de lysates de la célula
    1. Añadir 1 mL del tampón de lisis Western blot a los pellets de células de paso 3.3 y de vortex. Incubar durante 30 min en hielo. Vortex cada 5 min. Centrifugar las muestras durante 1,5 h a 20.000 x g a 4 ° C. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas de las células sometidas a lisis.
    2. Determinar la concentración de proteína de las fracciones de proteína, por ejemplo, la Bradford o el ensayo BCA. Diluir las muestras a una concentración de proteína de 1.5 μg/μl de tampón de lisis.
    3. Preparar las muestras de la SDS-PAGE añadiendo 10 μl de tampón de muestra Laemmli a fracción de proteína de 90 μl (1,5 μg/μl) y hervir la muestra 5 minutos24.
  2. Immunoblotting
    1. Usar geles de acrilamida SDS 8% con 20-30 μL bolsillos y 0.75 o 1 mm de espesor. Correr el gel a 25 mA por 2 h a TA.
    2. Retire con cuidado la cubierta de cristal del gel. Corte y deseche la parte superior del gel que contienen las bolsas de carga. Coloque el gel en una membrana de nitrocelulosa (0.2 μm), previamente empapado en tampón de Western blot. Las proteínas de transferencia a nitrocelulosa según la recomendación del sistema (por ejemplo, 250 mA durante 1 h a 4 ° C).
    3. Retire el sistema blot a la membrana de nitrocelulosa. La mancha la mancha con Ponceau rojo para visualizar las proteínas. Transferir la membrana de nitrocelulosa en una cámara de plástico y añadir 10 mL de solución de bloqueo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    4. Decantar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo monoclonal anti-polySia 735 (1 μg/mL) en PBS. Incubar la membrana durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación, lavar la membrana por lo menos tres veces durante 5 minutos con PBS.
    5. Añadir policlonal anti-ratón IgG de anticuerpo secundario (1 μg/mL) acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) o una etiqueta fluorescente en PBS. Incubar la membrana durante 1 h a TA. Después de la incubación, lavar la membrana por lo menos tres veces durante 5 minutos con PBS.
    6. Transferir la membrana sobre una placa de un aparato apropiado. Detectar la señal de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Resultados

Cromatogramas HPLC del fluorescente etiquetado Neu5Ac y los estándares de Neu5Gc están representados en la figura 2. Usando el método descrito en este documento, marca DMB Neu5Gc típicamente elutes entre 7-9 min tiempo de elución y DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Varios pequeños picos en el cromatograma generalmente aparecen entre 2-6 min. Estos picos representan DMB no reaccionado y reacción intermedios25.

Discusión

Si los síntesis química derivados de ManNAc, ManNProp y ManNBut son analizados mediante espectrometría de masas, sólo el pico masa correcta para ambos especímenes debe ser identificado. Por lo tanto, los productos se pueden suponer que tiene una pureza de más del 99%. Se detectan pequeñas cantidades de Neu5Gc, que normalmente no se encuentra en las células humanas29, en las fracciones de membrana de las células sometidas a lisis. Esto ocurre probablemente a través de una vía de salvamen...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a L. D. Nguyen para revisar el manuscrito y fructíferos debates. Además, agradecemos a J. Dernedde y H. G. Nguyen por ayudarnos a preparar la sesión de video. Mayoría de las escenas del video se rodaron en los laboratorios de R. Tauber. También agradecemos al Instituto Max Planck para los coloides y las interfaces y por darnos acceso a sus instalaciones de espectrometría de masas. RH fue apoyada por el DFG (ProMoAge).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCShimadzu

Referencias

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier an mero 129cido si licocido polysialiccromatograf a l quida de alto rendimientocultivo celularglycoengineering metab licaingenier a metab lica oligosac rido

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados