JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Abstract

חומצה sialic (Sia) הוא נתין מאוד חשוב glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בשל מיקומו בתחנת טרמיני ללא צמצום של oligo - סוכרים, וכן כימי מאפייניו הייחודיים, חומצה sialic מעורב שפע של קולטן שונים-ליגנד אינטראקציות. על-ידי שינוי הביטוי של חומצה sialic על פני התא, כתוצאה מכך מימוש אינטראקציות תלויי-חומצה sialic. זה יכול להיות מועיל לחקור אינטראקציות תלויי-חומצה sialic, יש פוטנציאל להשפיע על מחלות מסוימות בצורה מועילה. Via glycoengineering מטבולית (MGE), הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן. במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו כל בעלי החיים מטופלים עם C2-השתנה נגזרות של N- acetylmannosamine (ManNAc). אלה סוכרים אמינו לשמש sialic חומצה קודמן מולקולות, ולכן מטבוליזם המינים חומצה sialic המתאימים, הביע על glycoconjugates. יישום שיטה זו יוצרת אפקטים מסקרן על תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, הוא יכול להפחית באופן דרסטי את הביטוי של חומצה polysialic (polySia) התייחס תאים עצביים, ובכך משפיע על גדילה עצביים ובידול. . הנה, אנחנו מראים את הסינתזה של שני נגזרות - acylmannosamine הנפוץ ביותר C2-השתנה N, N- propionylmannosamine (ManNProp) כמו גם N- butanoylmannosamine (ManNBut), בהמשך להראות כיצד אלה הלא טבעי ניתן להחיל אמינו סוכרים בניסויים התרבות תאים. הביטוי של חומצה sialic ששונה מינים לכמת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה. ההשפעות על הביטוי חומצה polysialic הם הובהר באמצעות תספיג באמצעות נוגדן חומצה polysialic זמינים מסחרית.

Introduction

חומצה sialic היא חד-סוכר כי בדרך כלל ניתן למצוא בתחנת טרמיני ללא הפחתת של glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בין כל monosaccharides, חומצה sialic יש כמה מאפיינים כימיים ייחודיים. יש שדרה 9 C-אטום, קבוצה קרבוקסילית במיקום C-1, deprotonated, טעונים שלילית ובכך תחת התנאים הפיזיולוגיים, ותפקוד אמינו במצב C-5. למרות מעל 50 באופן טבעי וריאציות של חומצה sialic מאפינים תאריך1, הצורה הדומיננטית של חומצה sialic נמצאו אצל בני אדם הוא N- acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac). יונקים אחרים מבטאים גם את כמויות גבוהות יותר של N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc)2,3.

בשל מעמדה חשוף glycoconjugates, חומצה sialic מעורב שפע של אינטראקציות קולטן-ליגנד, למשל, הכריכה תלויים hemagglutinin של נגיף שפעת מארח תאים4. Epitope sialic חומצה עם תפקודים ביולוגיים חשובים, במיוחד במהלך מופרה, במערכת העצבים, היא חומצה polysialic. חומצה Polysialic הוא פולימר של עד 200 חומצות sialic אלפא מקושרים-2,8. החלבון העיקרי המוביל של חומצה polysialic היא מולקולת אדהזיה תא עצבי (NCAM). הביטוי חומצה Polysialic שמחליש את המאפיין דבק של NCAM בכך ביטוי חומצה polysialic מקטין את הידבקות ומגביר את הפלסטיות עם מערכת העצבים5.

שינויים בביטוי של חומצה sialic (פולי) בסופו של דבר משפיעים שפע של אינטראקציות ביולוגיים שונים. זה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים התלויים חומצה sialic ידועים ברמה המולקולרית, לחשוף את הרומן glycoconjugate אינטראקציות, או לחקור גישות טיפוליות אפשריות. ישנן שיטות שונות זמינים שלפיו הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן, למשל טיפול עם חומצה sialic glycosidases ספציפיים (sialidases), עיכוב של אנזימים המעורבים ביוסינטזה חומצה sialic6 7, ,8, או הורסים או שינוי הביטוי של האנזים מפתח של חומצה sialic ביוסינטזה9.

שיטה נוספת תכליתי כדי לווסת את הביטוי חומצה sialic היא MGE (הנדסה מטבולית הידוע גם פחמימה # מיון הפחמימות, מו). במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו חיות מטופלים עם נגזרות הלא טבעי של ManNAc אשר C2-אמינו שינויים. להיות קודמן מולקולות של חומצה sialic, לאחר ספיגת תאית, תחליפי ManNAc אלה הן חומצות חד כיווני sialic אל הלא טבעי מטבוליזם, יכול לבוא לידי ביטוי sialylated glycoconjugates. תאים שטופלו ManNAc נגזרים נושאת אליפטיות C2-שינויים, כגון ManNProp או ManNBut, לשלב N- propionylneuraminic חומצה (Neu5Prop) או חומצה - butanoylneuraminic N(Neu5But) שלהם glycoconjugates10 , 11. באמצעות קבוצות פונקציונליות הציג C2-העמדה של ManNAc, חומצות sialic המתרחשים את הלא טבעי יכול להיות יחד, למשל, דרך מצדו Staudinger או את cycloaddition alkine של אזיד, עם צבעי פלורסנט, ולכן דמיינו על פני שטח התא12.

הביטוי של חומצות אלה sialic הלא טבעי יש השפעות מסקרן על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל זיהומים הפתוגן, אדהזיה נדידה של תאים סרטניים, אדהזיה תא הכללית, כמו גם vascularization, בידול (לסקירה ראה:. Wratil et al. 13). מעניין, MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines יכול לשמש גם כדי להפריע הביטוי של חומצה polysialic. חומצה Polysialic נוצר על ידי שני polysialyltransferases שונים (ST8SiaII, ST8SiaIV). זה הוכח, כי polysialyltransferase ST8SiaII מעוכבת על ידי סימנים מקדימים חומצה sialic לא טבעי, כגון ManNProp או ManNBut14,15. בנוסף, זה הוכח בתאים אנושיים נוירובלסטומה ManNProp או ManNBut יישום גם מפחית sialylation הכולל15.

MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines הוא קל ליישם את השיטה כבר בהצלחה בשימוש, לא רק מידע יונקים והתרבות תאי חיידקים אלא גם אצל בעלי חיים שלם של מינים שונים, כגון Caenorhabditis elegans16, דג זברה17, או עכברים18,19,20,21. במיוחד ManNAc נגזרים הנושאת שינויים אליפטיות, כולל ManNProp ו- ManNBut, הם החזרה ציטוטוקסיות, אפילו בריכוזים millimolar תא תרבות בינוני או פלזמה. יתר על כן, הם יחסית קל לסנתז.

כאן, אנו מספקים פרטים על אופן השימוש MGE עם N-acetyl שונה mannosamines. קודם כל, הסינתזה של שני נגזרות ManNAc הנפוצה ביותר בתחום זה, ManNProp, ManNBut, הוא הסביר. בשלב הבא, אנו מראים כיצד ניתן ליישם MGE ניסוי ויוו . כדוגמה, שורת התאים נוירובלסטומה קלי נבחר כדי להדגים ירידה בביטוי של epitope polysialic על ידי המערבי כתם לאחר הטיפול עם נגזרות ManNAc. חומצות sialic את הלא טבעי על פני התא לכמת על ידי HPLC, בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה.

Protocol

1. הכנת Buffers וראגנטים

  1. הכנה של 3 מ מ נתרן methoxide פתרון
    1. להמיס 8.1 מ ג נתרן methoxide ב 50 מ ל מתנול (3 מ"מ) בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר מערבבים. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) למשך מספר שבועות.
  2. הכנת מאגר טריס-HCl
    1. לשלב 8.766 g NaCl, 157 מ ג טריס-HCl ו- 146 מ ג EDTA בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר stir, להתמוסס במים 80 מ.
    2. הוספת סודיום הידרוקסיד (1 מ', במים) או HCl (20%, במים) הפתרון מלהיב, תוך התבוננות על ה-pH עם מד pH, והתאם את ה-pH ל 8.0.
    3. להוסיף נפח המים הדרושים על מנת להגיע נפח סופי של 100 מ. לסנן את הפתרון באמצעות מערכת סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר.
      הערה: 100 מ"ל HCl-טריס מאגר יכיל 150 מ מ NaCl טריס-HCl 10 מ"מ, 5 מ"מ EDTA (pH 8.0). ניתן לאחסן את הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  3. הכנת aprotinin פתרון
    1. להמיס 10 מ ג aprotinin במים 1 מ"ל (1.54 מ מ). Aliquot הפתרון aprotinin לתוך 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות (100 µL כל אחד). לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  4. הכנת leupeptin פתרון
    1. להמיס leupeptin 10 מ ג 2 מ"ל מים (10 מ מ). Aliquot הפתרון leupeptin 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות. לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  5. הכנה של פתרון פלואוריד (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. להמיס 34.8 מ ג PMSF 2 מ"ל אתנול (100 מ מ). Aliquot הפתרון PMSF ב- 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות. לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  6. הכנה של פתרון 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB)
    1. לשלב מ"ג 15.62 אינצ DMB, 352 µL β-mercaptoethanol וביסולפאט נתרן 48 µL-פתרון (39%), וכן להוסיף 9.6 מ ל מים (6.9 מ"מ DMB, 500 מ מ β-mercaptoethanol ו- 0.19% ביסולפיט). Aliquot הפתרון DMB ב 40 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות (250 µL כל אחד). חנות מוגן מפני אור ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  7. הכנה של 1 מ' trifluoroacetic חומצה (TFA) פתרון
    1. הוספת µL 770.3 של 100% TFA 9.23 מ"ל מים צינור פלסטיק 15 מ"ל (1 מ'). לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  8. הכנה של פתרון TFA 120 מ מ
    1. להוסיף µL 92.4 TFA (100%) 9.91 מ"ל מים (120 מ"מ) צינור פלסטיק 15 מ"ל. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  9. הכנת תמיסת נתרן הידרוקסידי (NaOH) 400 מ
    1. להמיס 160 מ"ג NaOH 10 מ"ל מים (400 מ מ) צינור פלסטיק 15 מ"ל. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  10. הכנת מאגר פירוק תספיג חלבון
    1. להמיס 5.84 g NaCl, 0.1 g טריס (hydroxymethyl)-aminomethan (טריס), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2ו- 1 g טריטון-X100 ב- 100 מ ל מים ולהתאים את ה-pH ל 7.8. חנות ב 4 º C. להוסיף 100 µL של כל מעכב פרוטאז (aprotinin, leupeptin ו PMSF) לפני השימוש המאגר פירוק.
  11. הכנה של נתרן dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) מאגר
    1. להמיס 0.3 g טריס, 1.5 גרם גליצין ו- 0.1 g מרחביות במים 100 מ ל ולהתאים את ה-pH ל 7.3. החנות RT.
  12. הכנת מאגר תספיג חלבון
    1. להמיס 0.3 g טריס, 1.1 גרם גליצין במים 90 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל אתנול. החנות RT.
  13. הכנה של חסימת פתרון
    1. להמיס 1 גר' שומן חלב חינם כוח בתוך 25 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). תמיד להכין טרי.

2. סינתזה של ManNProp וקשורים N-acyl השומן-שונה Mannosamines

  1. להמיס מ"ג 431.2 הידרוכלוריד mannosamine ב פתרון methoxide של נתרן 3 מ מ 10 מ ל בקבוק זכוכית 50 מ עם בר מערבבים.
  2. מגניב את התערובת על קרח כדי 0 ° C. הפיתרון מלהיב, להוסיף לאט µL dropwise 210 propionyl כלוריד (2.4 mmol), או 248 כלוריד butanoyl µL (2.4 mmol) לסנתז ManNProp או ManNBut, בהתאמה. דגירה התערובת מלהיב ב-0 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
  3. להעביר את הפתרון לתוך צינור פלסטיק 50 מל. דווח 4-8 חורים המכסה של צינור פלסטיק עם מחט דקה. במהירות להקפיא את הפתרון בעזרת חנקן נוזלי, לאחר מכן lyophilize (להקפיא יבש) זה למשך 48 שעות או עד זה התייבש לחלוטין.
  4. מערבבים 350 גר' סיליקה ג'ל 60 עם 750 מ ל אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1) (זו השעיה). מילוי עמודה זכוכית (35 מ מ קוטר ו- 70 ס מ אורך) עם המתלה סיליקה ג'ל 60 ולשטוף את העמודה מוכן עם 100 מ ל נוספים אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1) לפני השימוש.
  5. להמיס את המוצרים מיובשים מהשלב 2.3 (5 g מיובשים מוצר) 10 מ"ל אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1), טען אותם באמצעות פיפטה על גבי סיליקה ג'ל עמודה. לאסוף 4 מ"ל שברים לאחר 500 מ"ל (עבור ManNProp). הערה: ManNBut elute עמודה כ לאחר 700 מ"ל.
  6. העברת שברים eluted לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל. דווח 3-6 חורים המכסה של צינור פלסטיק עם מחט דקה. רפיד להקפיא את הפתרון בעזרת חנקן נוזלי, לאחר מכן lyophilize את זה עד זה התייבש לחלוטין.
    הערה: המוצרים lyophilized ניתן לאחסן במשך מספר חודשים-RT.
  7. לאמת את הטוהר של המוצרים על ידי ספקטרומטר מסה (ראה סעיף 9).
    הערה: לחלופין, טוהר גם ניתנת לאימות כמקורית על-ידי 1H תהודה מגנטית גרעינית (NMR).

3. תרבית תאים

  1. התרבות התאים נוירובלסטומה קלי במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI), המכיל 10% סרום שור עוברית, 100 U פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ ג, 2 מ מגלוטמין המכילה 5 מ מ ManNAc, 5 מ מ ManNProp או 5 מ מ. ManNBut, ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
    הערה: תאים תרבותי בינוני ללא ManNAc או מקבילים שלו משמשים פקד.
  2. לפני היישום של mannosamines, לנתק את התאים נוירובלסטומה קלי מאת המקננת בהם במשך 10 דקות עם טריפסין/EDTA (0.25%, 0.02%, ב- PBS) ולספור באמצעות מונה נויבאואר-חדר או תא. הזרע התאים במספרים מוגדרת בהתבסס על גודל המנה/הצלחת.
    1. כדי למדוד חומצה sialic monosaccharides, זרע עונה 1 פרק 10 תאים5 בינוני µL 500 לתוך צלחת תרביות רקמה 48-. טוב. לניתוח של חומצות polysialic, זרע עונה 1 פרק 10 תאים6 מ"ל 3 בינוני על גבי צלחת תרבות תא בקוטר 6 ס מ. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2. החלף את המדיום כל 24 שעות.
      הערה: מגביר האפקט של MGE עם הזמן הכולל של הטיפול. עבור יעילות מטבולית גבוהה לפנק את התאים במשך 5-7 ימים.
  3. לאחר הטיפול, decant של המדיום. לשטוף את הכלים/הצלחות עם PBS. ניתוק התאים על ידי המקננת בהם במשך 10 דקות עם טריפסין/EDTA (0.25%, 0.02%, ב- PBS). לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת באותו אמצעי אחסון בינוני התרבות התא לתאים מנותקת. העבר את התאים מנותקת לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל. Centrifuge את הדגימות למשך 3 דקות ב 500 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    1. הוסף 5 מ ל תאים PBS וצנטריפוגה (ראה שלב 3.3). חזור על הפעולות כביסה עוד פעמיים.
      הערה: בגדר תא שטף ללא תגובת שיקוע ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים. אם הביטוי של חומצה polysialic כדי להיות הובהר להמשיך סעיף 10.

4. תא פירוק לניתוח HPLC

  1. הכנת מאגר פירוק HPLC
    1. לשלב 5 מ"ל HCl-טריס מאגר 5 µL aprotinin פתרון, פתרון 20 של leupeptin µL, 50 µL PMSF פתרון.
      הערה: מאגר HPLC פירוק 5 מ"ל יכיל 150 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס-HCl, 5 מ מ EDTA, aprotinin 1.54 מיקרומטר, 40 µM Leupeptin, ו- 1 מ מ PMSF (pH 8.0). מאגר זה צריך תמיד להיות מוכן טרי לפני פירוק התא.
  2. מחדש להשעות את התא שנאספו כדורי (שלב 3.3) כל 500 µL קר כקרח HPLC פירוק-מאגר ולאחר אולטרה-sonicate הדגימות עם המחט מעבד אולטרה קוליים שלוש פעמים במשך תקופה של 30 s ב amplitudes בינונית-גבוהה. מגניב הדגימות על קרח לפחות 1 דקות בין המחזורים.

5. ההפרדה של השבר ממברנה

  1. Centrifuge הדגימות תא lysed עבור 2 h ב- 20,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס. הפרד את תגובת שיקוע (µL כ 480), המייצג חלבונים cytosolic, צינורות פלסטיק 1.5 מ. לקבוע ריכוז חלבון אלו שברים באמצעות, למשל, של ברדפורד או חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו.
    הערה: ריכוז חלבון (כ 1 מ"ג/מ"ל) של שברים cytosolic אחר כך שניתן לקשר את כמויות מדודות של המין חומצה sialic מכובד. בגדר מייצג את השבר הממברנה, אשר משמש בשלב 6.1.

6. הידרוליזה חומצית

הערה: Oligo - ופוליסכרידים ב קרום התא הן הידרוליזה ל monosaccharides. עוד, ניתן O-שינויים ב- monosaccharides הן הידרוליזה, גם כן. זה נחוץ לצורך ניתוח כמותי HPLC, כי הרוב המכריע של חומצות sialic בחלקים קרום משולבים באופן טבעי glycoconjugates, אולי יכול לסבול O-אצטיל או O- lactolyl שינויים.

  1. להוסיף 150 µL 1 מ' TFA-פתרון שברים קרום מופרד (גלולה של סעיף 5). דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 80 ° C ברעידות-200-600 סל ד.
  2. Centrifuge את הדגימות כ 30 דקות ב- 20,000-g ו- 21 ° C באמצעות צינורות מסנן 0.5 mL עם 3 kDa אי-הכללה של ממברנות, עד שאמצעי האחסון העליון µL פחות מ-20.
    הערה: השלב זה חשוב להשליך פסולת מולקולרית גבוהה יותר.
  3. העברת השלב התחתון המכילה מולקולות קטנות יותר, כולל המין חומצה sialic, לתוך צינורות פלסטיק 2 מ"ל. דווח 2-4 חורים הפקקים של צינורות פלסטיק עם מחט דקה. רפיד להקפיא את הדגימות בעזרת חנקן נוזלי, ואז lyophilize אותם בן לילה.
    הערה: הדגימות יבשים ניתן לאחסן במשך מספר ימים-RT. להחליף כובע בלי חורים לאחסון ארוך יותר.

7. תיוג פלורסנט

  1. מחדש להשעות את הדגימות מיובשים בפתרון TFA 120 מ"מ µL 10 ולהוסיף 50 µL DMB פתרון. העברת דגימות לתוך צינורות mL 1.5 כהה כדי להגן עליהם מפני האור האולטרה סגול.
  2. עבור תקנים, להמיס 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, במים) או 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, במים) פתרון TFA 120 מ"מ µL 10 mL 1.5 כהה צינורות. להוסיף 50 µL DMB פתרון.
  3. דגירה בדגימות קרום התא, תקני 1.5 h ב 56 ° C מוגן מפני אור. לאחר דגירה, להוסיף 4 µL 400 מ NaOH פתרון כל דגימה כדי לעצור את התגובה תיוג.

8. hplc, קורס ניתוח

הערה: דגימות שכותרתו מנותחים על מערכת HPLC מצויד עמודה סי18 RP (110, גודל החלקיקים מיקרומטר 3, 4.6 x 150 מ מ), גלאי קרינה פלואורסצנטית, ואני אספן שבר. ממיסים המשמש הן מתנול, acetonitrile ומים. הקפד דגה ממיסים כל לפני המדידות, אם מערכת HPLC חסר של degasser פנימית.

  1. הגדר את הטמפרטורה של העמודה עד 40 ° צלזיוס ולהגדיר את גלאי קרינה פלואורסצנטית עם 373 nm עירור, 448 ננומטר על פליטה, בהתאמה. להזריק 10 נפח דגימה µL ולהפריד את הגששים למשך 50 דקות בקצב זרימת 0.5 mL/min כשהמים מתנול/acetonitrile / (6:8:86) eluent. לניתוח ספקטרומטר מסה, לאסוף את הפסגות של ריבית.
    הערה: Neu5Gc צפוי eluate לאחר 6-8 דקות, Neu5Ac לאחר 9-12 דקות, Neu5Prop לאחר 17-23 דקות, Neu5But לאחר 38-44 דקות. ניתן לאחסן את הדגימות fractionated h מספר 4 ° C מוגן מפני אור.
  2. לאחר מדידת כל דגימה, לשטוף את העמודה עבור 7.5 דקות בקצב זרימת 1.0 mL/min (≈ עמודה 1.5 כרכים) עם מתנול/acetonitrile/מים (6:25:69), equilibrate מחדש את המערכת. של 7.5 דקות בקצב זרימת 1.0 mL/min עם מתנול/acetonitrile/מים (6:8:86).
  3. עבור ניתוח כמותי, לחשב את השטח מתחת העקומה של הפסגות חומצה sialic עניין באמצעות תוכנות הפעלה של מערכת HPLC בהתאמה22.
    הערה: נתונים המתקבלים שניתן לקשר את Neu5Ac או תקן Neu5Gc, ריכוז חלבון נמדד בחלקים cytosolic (ראו סעיף 5.1).

9. ספקטרומטר מסה ניתוח של חומצה Sialic Monosaccharides

הערה: HPLC פסגות השמירה של עניין ניתן עוד לנתח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) ספקטרומטריית electrospray-יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS), על מנת לוודא המין חומצה sialic לא טבעי.

  1. לניתוח ספקטרומטר מסה, להחדיר µL 20 מדגם שנאספו אל תוך מערכת גלאי סלקטיבי LC/מסה (MSD) 79.9% מתנול, אלכוהול איזופרופיל 20% ו- 0.1% חומצה פורמית כמו eluent, קצב הזרימה 0.5 mL/min, 4 kV מתח נימי חום קפילרי 350 ° C 22 , 23.
  2. התוכנה הערכה של מערכת LC/MSD בהתאמה, בחר הפסגה של עניין chromatogram יון סה. להציג את הספקטרום המונית של הפסגה נפתרה. להציג את יחס מסה/מטען חיובי בין 300 ל- 700.
    הערה: בנק דיסקונט למשכנתאות תיוג של חומצות sialic מוביל לעלייה המסה המולקולרית של 116.2 גרם/מול. המין התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic יש את ההמונים מולקולרית הבאים: בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac = 424.2 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc = 441.8 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Prop = 436.2 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5But = 453.2 g/משותף mol. adducts acetonitrile, נתרן או אלכוהול איזופרופיל.

10. תספיג ניתוח של חומצה Polysialic בתאים נוירובלסטומה קלי

  1. הכנת תא lysates
    1. להוסיף 1 מ"ל תספיג פירוק מאגר כדורי תא מ שלב 3.3 ו מערבולת. תקופת דגירה של 30 דקות על קרח. מערבולת כל 5 דקות. Centrifuge את הדגימות עבור h 1.5 ב20, 000-g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע המכיל את החלבונים את התאים lysed.
    2. לקבוע ריכוז חלבון של שברים חלבון, למשל, של ברדפורד או BCA וזמינותו. לדלל את הדוגמאות כדי ריכוז חלבון של 1.5 µg µL במאגר פירוק.
    3. להכין את הדגימות מרחביות-הדף על-ידי הוספת 10 µL Laemmli מדגם מאגר µL 90 חלבון שבר (1.5 µg µL), מרתיחים את הדגימה עבור 5 דקות24.
  2. Immunoblotting
    1. השתמש 8% מרחביות-אקרילאמיד ג'לים עם כיסים µL ו- 0.75 או 1 מ"מ עובי 20-30. הפעל את הג'ל בגיל 25 מא עבור 2 h-RT.
    2. הסר בזהירות את מכסה הזכוכית של הג'ל. לגזור ולמחוק את החלק העליון של הג'ל המכיל את הכיסים טעינה. מקם את הג'ל על קרום ניטרוצלולוזה (0.2 µm) בעבר טבולים תספיג מאגר. להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה לפי המלצתם של המערכת (למשל, 250 mA עבור h 1 ב 4 ° C).
    3. הסר את הקרום ניטרוצלולוזה ממערכת blotting. מכתים את האבן החשופה עם צבע מאכל פונסו אדום כדי להמחיש את החלבונים. להעביר את הקרום ניטרוצלולוזה לתוך תא פלסטיק ולהוסיף 10 מ"ל חסימת פתרון. תקופת דגירה של 1 h RT או למשך הלילה ב 4 º C.
    4. Decant הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן monoclonal anti-polySia 735 (1 µg/mL) ב- PBS. דגירה הקרום עבור 1 h RT או למשך הלילה ב 4 º C. לאחר דגירה, לשטוף את הקרום לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
    5. הוסף polyclonal העכבר אנטי איג משני נוגדנים (1 µg/mL) מצמידים חזרת peroxidase (HRP) או בתווית פלורסנט ב- PBS. דגירה הקרום עבור h 1-RT. לאחר דגירה, לשטוף את הקרום לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
    6. להעביר את הקרום על גבי צלחת imager המתאים. לזהות את האות לפי הוראות היצרן.

תוצאות

Chromatograms HPLC של פלורסנט תווית Neu5Ac ואת הסטנדרטים Neu5Gc מתוארת באיור2. באמצעות השיטה המתוארת במסמך זה, התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות Neu5Gc בדרך כלל elutes בין 7-9 דקות • תנאי הזמן, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac בין 10-12 דקות. מספר פסגות ההרים קטנים יותר chromatogram מופיעים ...

Discussion

אם נגזרות מסונתז כימית ManNAc, ManNProp ו- ManNBut הם ניתחו באמצעות ספקטרומטר מסה, צריך להיות מזוהה רק הפסגה המוני הנכון עבור שתי דגימות. לכן, ניתן להניח את המוצרים יש טוהר של מעל 99%. כמויות קטנות של Neu5Gc, אשר בדרך כלל לא נמצא תאים אנושיים29, מזוהים בחלקים הממברנה של התאים lysed. זה קרוב לוודאי מ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ל' ד נגוין להגהת כתב היד ועל דיונים פוריים. יתר על כן, אנו מודים Dernedde ג' וה' ג' נגוין שעזרת לנו להכין את. הצילומים. רוב סצנות של הווידאו נורו במעבדות ר טאובר. אנו מודים גם מכון מקס פלנק קולואידים ואמולסיות, ממשקים, ואשר נתן לנו גישה חופשית למתקן ספקטרומטר מסה שלהם. RH נתמכה על ידי DFG (ProMoAge).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
ESI-MSD-SystemAgilent

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129Sialicpolysialicglycoengineering

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved