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요약

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

초록

Sialic acid (Sia) glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 매우 중요 한 구성입니다. 올리고-및 다 당 류, 뿐만 아니라 독특한 화학 특성의 비 감소 테르미니에서 그것의 위치 때문 sialic acid는 다른 수용 체 ligand 상호 작용의 무리에 포함 된다. 세포 표면에 sialic acid의 식을 수정 하 여 sialic acid 종속 상호 작용 따라서 좌우 될. 이 sialic acid 종속 상호 작용을 조사 하는 데 도움이 될 수 있습니다 하 고 유익한 방식으로 특정 질병에 영향을 미칠 가능성이 있다. 신진 대사 glycoengineering (MGE)을 통해 세포 표면에 sialic acid의 식이 변조 수 있습니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 전체 동물 N-acetylmannosamine (ManNAc)의 파생 상품 c 2 수정 처리 됩니다. 이러한 아미노 설탕 sialic 산 성 선구자 분자 역할 따라서는 해당 sialic acid 종 대사와 glycoconjugates에 표현. 이 방법을 적용 다양 한 생물학 과정에 흥미로운 효과 생성 합니다. 예, 그것은 치료 신경 세포에 있는 polysialic 산 (polySia)의 식을 획기적으로 줄일 수 있다 고 따라서 신경 성장과 분화에 영향을 줍니다. 자, 우리 N-butanoylmannosamine (ManNBut), 뿐만 아니라 가장 일반적인 C2 수정 N-acylmannosamine 유도체, N-propionylmannosamine (ManNProp)의 2의 화학 합성을 보여 더 보여 어떻게이 아닌 자연 아미노 설탕은 세포 배양 실험에 적용할 수 있습니다. 수정된 sialic acid 종의 식 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계량 하 고 더욱더 질량 분석을 통해 분석. Polysialic 산 식에 대 한 효과 서쪽 오 점 상용 polysialic 산 성 항 체를 사용 하 여 통해 해명.

서문

Sialic acid glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 비 감소 테르미니에서 일반적으로 찾을 수 있는 단 당 류 이다. 모든 단 중 sialic acid는 몇 가지 독특한 화학 특성이 있다. 9 C 원자 백본, deprotonated 이며 그로 인하여 부정 청구에서 생리 적 조건, C-1 위치에 carboxylic 그룹 및 아미노 기능 C-5 위치에 있다. 날짜1, 자연스럽 게 sialic acid의 변종 발생 50 이상 성격 되었습니다 sialic acid 인간에서 발견의 주된 형태는 N-acetylneuraminic 산 (Neu5Ac). 다른 포유동물은 또한 N-glycolylneuraminic 산 (Neu5Gc)2,3의 더 높은 금액을 표현 한다.

Glycoconjugates, 노출된 위치로 인해 sialic acid 수용 체 ligand 상호 작용의 과다 한 예를 들어, 호스트 셀4인플루엔자 바이러스의 조류 종속 바인딩 포함 된다. 중요 한 생물 학적 기능, 특히 embryogenesis 동안와 신 경계에 sialic acid epitope polysialic 산 이다. Polysialic 산 최대 200 알파 2, 8-연결 sialic 아미노산의 중합체 이다. Polysialic 산의 주요 단백질 캐리어는 신경 세포 접착 분자 (여). Polysialic 산 식 polysialic 산 식 접착을 감소 하 고 신 경계5가 소성을 증가 보안의 접착제 속성을 조절 한다.

변화 (폴 리) sialic acid의 식에서 궁극적으로 여러 다른 생물 학적 상호 작용을 영향을 줍니다. 이 알려진된 sialic acid 종속 프로세스 밝히기 소설 glycoconjugate 상호 작용, 또는 가능한 치료 방법 탐구를 분자 수준에서 연구를 사용할 수 있습니다. 다른 방법이 있다 사용할 수 있는 세포 표면에 sialic acid의 표현을 변조 수, sialic acid 특정 glycosidases (sialidases),6 sialic 산 생 합성에 관련 된 효소의 억제와 치료 예 ,7,8또는 노크 하거나 sialic 산 생 합성9의 주요 효소의 표현 변경.

또 다른 다재 다능 한 sialic acid 식 변조 하 방법은 MGE (일컬어 대사 처리한후 공학, 모에)입니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 동물 아닌 자연의 파생 상품 ManNAc는 c 2-아미노 수정 처리 됩니다. 세포질 통풍 관 후 sialic acid에 대 한 선구자 분자 이기 때문에, 이러한 ManNAc 아날로그 단방향 비 자연적인 대사 sialic 산 이며 sialylated glycoconjugates에 표현 될 수 있습니다. 와 같은 ManNProp 또는 ManNBut, N-propionylneuraminic 산 (Neu5Prop) 또는 그들의 glycoconjugates10 N-butanoylneuraminic 산 (Neu5But)를 통합 할 셀 들고 지방 족 C2-수정, ManNAc 유도체로 치료 , 11. ManNAc의 C2 위치에 도입 하는 기능적인 그룹을 사용 하 여 발생 비 자연적인 sialic 산 결합 될 수 있다, 예를 들어, Staudinger 결 찰 이나 아 지 드 alkine cycloaddition 형광 염료를 통해 따라서 12셀 표면 시각.

이러한 비 자연적인 sialic이 표현 병원 체 감염, 접착 및 종양 세포, 일반 세포 접착으로 vascularization와 차별화 (검토를 위해의 마이그레이션 등 많은 생물 학적 과정에 흥미로운 효과가 참조: Wratil 외. 13). 흥미롭게도, MGE n-acyl 수정 mannosamines polysialic 산의 표현에 방해가 사용할 수 있습니다. Polysialic 산 (ST8SiaII 및 ST8SiaIV) 두 개의 서로 다른 polysialyltransferases에 의해 생성 됩니다. 그것은 입증 되었습니다, 그 polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp 또는 ManNBut,1415등 부자연 스러운 sialic acid 선구자에 의해 저해. 또한, 그것은 증명 되었습니다 인간의 신경 세포에서 ManNProp 또는 ManNBut 응용 프로그램 또한 총15sialylation를 감소 시킨다.

MGE n-acyl 수정 mannosamines는 성공적으로, 뿐만 아니라 포유류와 꼬마 선 충16, 같은 다른 종족의 전체 동물에 뿐만 아니라 박테리아 세포 배양에 사용 된 메서드를 적용 하 게 쉬운 zebrafish17또는 쥐18,19,,2021. 특히 ManNAc 파생 상품 지방 족 수정, ManNProp 및 ManNBut, 포함 한 베어링은 사소, 셀 문화 매체 또는 혈액 플라스마 millimolar 농도 에서도 세포 독성. 또한, 그들은 비교적 쉽게 합성 하기입니다.

여기, 우리는 nMGE를 사용 하는 방법에 세부 정보를 제공-틸 수정 mannosamines. 첫째, ManNProp 및 ManNBut,이 분야에서 가장 널리 사용 되는 ManNAc 파생 상품의 2의 화학 합성은 설명 했다. 다음으로, 우리는 어떻게 MGE vivo에서 실험에 적용할 수 보여줍니다. 예를 들어, 신경 세포 선 켈리 선정 되었다 polysialic epitope의 감소 식 보여 서양 오 점 ManNAc 유도체 치료 후. 세포 표면에 비 자연 sialic 산 HPLC로 정량 이었고 더 질량 분석을 통해 분석.

프로토콜

1입니다. 버퍼 및 시 약의 준비

  1. 3mm 나트륨 methoxide 솔루션의 준비
    1. 8.1 mg 나트륨 methoxide 메탄올 50 mL (3 m m)에 저 어 바 100 mL 유리 용기에 녹. 몇 주 동안 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
  2. Tris HCl 버퍼의 준비
    1. 저 어 바 8.766 g NaCl, 157 mg Tris HCl 및 146 mg 100 mL 유리병에 EDTA 결합 하 고 80 mL 물에 용 해.
    2. PH-미터, pH를 관찰 하는 동안 교 반 솔루션을 수산화 나트륨 (1 M, 물) 또는 HCl (20%, 물)를 추가 하 고 pH 8.0에 조정.
    3. 물 100 mL의 최종 볼륨을 달성 하는 데 필요한 볼륨을 추가 합니다. 0.22 μ m 살 균 필터 시스템을 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
      참고: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl 및 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL Tris HCl 버퍼 포함 됩니다. 솔루션 4 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.
  3. Aprotinin 솔루션의 준비
    1. 1 mL 물 (1.54 m m)에 10 mg aprotinin 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (100 µ L 각) x 10에 aprotinin 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  4. Leupeptin 솔루션의 준비
    1. 2 물 (10 m m)에 10 mg leupeptin 분해. 약 leupeptin 솔루션 수 10 mL-플라스틱 튜브 1.5 배. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  5. Phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 솔루션의 준비
    1. 2 mL 에탄올 (100 mM)에 34.8 mg PMSF 디졸브. 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 x 10에서 PMSF 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 저장 합니다.
  6. 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) 솔루션의 준비
    1. 15.62 mg DMB, 352 µ L β-mercaptoethanol, 및 48 µ L 나트륨 중 아 황산 염-솔루션 (39%), 결합 하 고 추가 9.6 mL 물 (6.9 m DMB m, 500 m m β-mercaptoethanol, 그리고 0.19% 나트륨 중 아 황산 염). 약 수 1.5 mL 플라스틱 튜브 (250 µ L 각) x 40에서 DMB 솔루션. 몇 주 동안-20 ° C에서 빛에서 보호 하는 상점.
  7. 1 M trifluoroacetic 산 (TFA) 솔루션의 준비
    1. 100%의 770.3 µ L 추가 TFA 9.23 물 15 mL 플라스틱 튜브 (1 M)에. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  8. 120mm TFA 솔루션의 준비
    1. 9.91 물 (120mm) 15 mL에 플라스틱 튜브를 92.4 µ L TFA (100%)를 추가 합니다. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  9. 400 m m 수산화 나트륨 (NaOH) 용액의 준비
    1. 160 mg 10 mL 물 (400mm) 15 mL에 플라스틱 튜브에 NaOH를 분해. 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.
  10. 서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼의 준비
    1. 분해 5.84 g NaCl, 0.1 g 트리 (hydroxymethyl)-aminomethan (트리 스), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2, 100ml에 1 g 트리톤 X100 물 및 7.8에 pH를 조정. 4 ° c.에 게 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 전에 각 protease 억제제 (aprotinin, leupeptin, 및 PMSF)의 100 µ L를 추가 합니다.
  11. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 버퍼의 준비
    1. 0.3 g 트리 스, 1.5 g 글리신, 그리고 0.1 g SDS 물 100 mL에에서 녹이 고 pH 7.3 조정. 실시간에 저장소
  12. 서쪽 오 점 버퍼의 준비
    1. 0.3 g 트리 스, 1.1 g 글리신 물 90 mL에에서 녹이 고 에탄올 10 mL을 추가. 실시간에 저장소
  13. 차단 하는 솔루션의 준비
    1. 1 g 25 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 지방 무료로 우유 힘의 분해. 항상 신선한 준비.

2. 합성 ManNProp 및 관련된 N-acyl-Mannosamines를 수정

  1. 저 어 바 50 mL 유리 용기에 10 mL 3 m m 나트륨 methoxide 솔루션에서 431.2 mg mannosamine 염 산 염을 분해.
  2. 차가운 얼음 0 ° c에 혼합물 감동적인 솔루션에 천천히 dropwise 210 µ L propionyl 염화 (2.4 mmol), 또는 합성 ManNProp 또는 ManNBut, 각각 248 µ L butanoyl 염화 (2.4 mmol)를 추가 합니다. 4 h 0 ° C에서 교 반 혼합 품 어.
  3. 솔루션 50 mL 플라스틱 튜브로 전송 합니다. 얇은 바늘으로 플라스틱 튜브의 뚜껑으로 4-8 구멍을 찌른. 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 급속 동결 하 고 이후 (동결 건조) lyophilize 48 h 또는 그것은 완전히 건조 될 때까지 그것.
  4. 750 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) (이 서 스 펜 션) 믹스 350 g 실리 카 젤 60. 실리 카 젤 60 서 스 펜 션 유리 열 (35 m m 직경 70 cm 길이)를 사용 하기 전에 추가 100 mL 에틸-아세테이트/메탄올/물으로 (15:2:1) 준비 열을 씻어.
  5. 2.3 단계에서 말린된 제품 분해 (5 g 건조 제품) 10ml 에틸-아세테이트/메탄올/물 (15:2:1) 및 부하에는 실리 카에 피 펫을 사용 하 여 열 젤. (ManNProp)에 대 한 후 500 mL 4 mL 분수를 수집 합니다. 참고: ManNBut 약 700 mL 후 열에서 elute 것입니다.
  6. 15 mL 플라스틱 튜브에 eluted 분수를 전송 합니다. 3-6 구멍 플라스틱 튜브의 뚜껑에 얇은 바늘 찌른. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 솔루션을 동결 하 고 이후 그것은 완전히 건조 될 때까지 lyophilize.
    참고: 동결 건조 된 제품 실시간에 몇 달 동안 저장 될 수 있다
  7. 질량 분석 (섹션 9 참조) 하 여 제품의 순도 확인 합니다.
    참고: 또는, 순도 확인할 수 있습니다 1H 핵 자기 공명 (NMR).

3. 세포 배양

  1. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U 페니실린, 100 mg 스, 37 ° C, 5% CO2에서 2 mM L-글루타민 포함 5 m ManNAc m, 5 m ManNProp, m 또는 5 mM ManNBut, 포함 된 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 문화 켈리 신경 세포.
    참고: ManNAc 또는 그것의 아날로그 매체에 경작 하는 세포는 컨트롤로 사용 됩니다.
  2. 전에 mannosamines의 응용 프로그램, 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 켈리 신경 세포를 분리 하 고 Neubauer 챔버 또는 셀 카운터를 사용 하 여 계산 합니다. 시드 플레이트/접시의 크기에 따라 정의 된 숫자에서 셀입니다.
    1. 측정 sialic 산 단, 48-잘 조직 문화 접시에 500 µ L 매체에 1 x 105 셀을 씨. Polysialic 산의 분석에 대 한 1 x 106 셀 6 cm 직경 셀 문화 접시에 3 mL 매체에 씨. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 매체 마다 24 h를 교체 합니다.
      참고: MGE의 효과 치료의 총 시간으로 증가합니다. 높은 신진 대사 효율을 위한 5-7 일에 대 한 셀을 취급 합니다.
  3. 치료 후, 매체를 가만히 따르다. PBS 가진 접시/접시를 씻어. 트립 신/EDTA (0.25%, PBS에서 0.02%)와 10 분 동안 그들을 배양 하 여 세포를 분리 합니다. 분리 된 세포에 세포 배양 매체의 동일한 볼륨을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 15 mL 플라스틱 튜브로 분리 된 세포를 전송 합니다. 원심 500g x 3 분에 대 한 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
    1. 5 mL PBS와 원심 분리기 세포 (단계 3.3 참조)을 추가 합니다. 두 번 더 세척 절차를 반복 합니다.
      참고: 상쾌한 없이 씻어 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 몇 일 동안. Polysialic 산의 식 해명 될 것입니다 섹션 10 계속.

4. HPLC 분석을 위한 세포 세포의 용 해

  1. HPLC 세포의 용 해 버퍼의 준비
    1. 5 mL Tris HCl 버퍼, 5 µ L aprotinin 솔루션, 20 µ L leupeptin 솔루션 및 50 µ L PMSF 솔루션을 결합 합니다.
      참고: 5 mL HPLC 세포의 용 해 버퍼 150 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 1.54 μ M aprotinin, 40 µ M 포함 됩니다 Leupeptin, 및 1 밀리미터 PMSF (pH 8.0). 이 버퍼 항상 신선한 세포 세포의 용 해 전에 대비해 야.
  2. 다시 500 µ L 얼음 HPLC 세포-버퍼에 수집 된 셀 펠 릿 (단계 3.3) 각을 일시 중단 하 고 울트라-sonicate 샘플 초음파 프로세서 바늘 3 시간 동안 30의 중간-높은 진폭에서 s. 주기 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 샘플 멋진.

5입니다. 분리 막 분수의

  1. 2 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 lysed 세포 샘플을 원심 상쾌한 (약 480 µ L), 1.5 mL 플라스틱 튜브에 있는 cytosolic 단백질 대표를 구분 합니다. 이 분수를 사용 하 여, 예를 들어는 브래드 퍼 드 또는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다.
    참고: cytosolic 분수의 단백질 농도 (약 1 mg/mL) 나중에 존경 받는 sialic acid 종의 양이 측정된 연관 될 수 있습니다. 펠 릿 단계 6.1에서에서 사용 되는 막 비율을 나타냅니다.

6. 산 성 가수분해

참고: 올리고-및 다 당 류는 세포 막에 단을 분해. 또한, 가능한 O-는 단에서 수정, 또한 분해는. 이 양적 HPLC 분석에 필요한 막 분수에 sialic 산의 압도적 glycoconjugates에 자연스럽 게 통합 됩니다 이며 O부담 가능성이 있습니다 때문-틸 또는 O-lactolyl 수정.

  1. 150 µ 1 M L 추가 TFA-솔루션 분리 막 분수 (섹션 5에서에서 펠 릿). 200-600 rpm에서 떨고와 80 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
  2. 20000 x g와 상위 단계 볼륨은 20 µ L까지 3 kDa 제외 멤브레인과 0.5 mL 필터 튜브를 사용 하 여 21 ° C에서 약 30 분 동안 샘플 원심
    참고:이 단계는 높은 분자 파편을 처분 하는 것이 중요.
  3. 2 mL 플라스틱 튜브에 sialic acid 종을 포함 하 여 작은 분자를 포함 하는 낮은 단계를 전송 합니다. 얇은 바늘으로 구멍을 2-4 플라스틱 튜브의 뚜껑에 구멍. 빠른 액체 질소를 사용 하 여 샘플을 동결 하 고 하룻밤 사이 그들을 lyophilize.
    참고: 말린된 견본 저장을 위해 실시간 바꾸기 구멍 없이 모자에 며칠 동안 저장할 수 있습니다.

7. 형광 라벨

  1. 다시 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서 말린된 견본을 일시 중단 하 고 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다. 자외선 으로부터 보호 하기 위해 어두운 1.5 mL 튜브에 샘플을 전송 합니다.
  2. 표준, 디졸브 1 µ L Neu5Ac (60 ng/mL, 물에서) 또는 1 µ L Neu5Gc (60 ng/mL, 물에) 어두운 1.5 mL 튜브에 10 µ L 120 m m TFA 솔루션에서. 50 µ L DMB 솔루션을 추가 합니다.
  3. 세포 막 샘플을 품 어와 56 ° C에서 1.5 h에 대 한 표준 빛에서 보호. 부 화, 후 라벨 반응을 중지를 각 샘플을 4 µ L 400 m m NaOH 솔루션을 추가 합니다.

8. HPLC 분석

참고: 레이블된 샘플 C18 RP 열을 갖춘 HPLC 시스템에 분석 (110 Å, 3 µ m 입자 크기, 4.6 x 150 m m), 형광 검출기, 그리고 분수 수집. 사용 하는 용 매는 메탄올, 이기, 그리고 물 있습니다. HPLC 시스템 내부 degasser를 결여 하는 경우는 측정 전에 모든 용 매를 드 되었는지 확인 합니다.

  1. 열 온도 40 ° C를 설정 하 고 373와 형광 검출기를 구성 구동 및 448 nm nm 방출에 대 한 각각. 10 µ L 샘플 볼륨을 주입 하 고 메탄올/이기/물 (6:8:86)는 eluent으로 0.5 mL/min 흐름 속도로 50 분에 대 한 프로브를 분리. 질량 분석 분석에 대 한 관심의 봉우리를 수집 합니다.
    참고: Neu5Gc 6-8 분, 9-12 분, 17-23 분 후 Neu5Prop와 38-44 분 후 Neu5But 후 Neu5Ac 후 eluate을 예정 이다. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 여러 h에 대 한 분류 한 샘플을 저장할 수 있습니다.
  2. 각 샘플을 측정 한 후 1.0 mL/min 유량 (≈ 1.5 열 볼륨) 메탄올/이기/물 (6:25:69)에서 7.5 분에 대 한 열을 세척 하 고 다시 메탄올/이기/물 (6:8:86)로 1.0 mL/min 흐름 속도로 7.5 분에 대 한 시스템을 equilibrate.
  3. 정량 분석을 위해22각각 HPLC 시스템 운영 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 sialic 산 봉우리의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다.
    참고: cytosolic 분수 (섹션 5.1 참조)에 측정 된 단백질 농도 Neu5Ac 또는 Neu5Gc 표준을 얻은 데이터 관련 될 수 있습니다.

9. 질량 분석 분석 Sialic 산 단

참고: 관심의 HPLC 보존 봉우리 분석할 수 있습니다 추가 액체 크로마토그래피 (LC) 분무 이온화 질량 분석 (MS ESI)에 의해 부자연 스러운 sialic acid 종 확인.

  1. 질량 분석 분석을 위해 수집 된 샘플의 20 µ L에 주입 LC/대량 선택적인 검출기 (MSD) 시스템 79.9% 메탄올, 20% 이소프로필 알콜, 및 0.1% 개미 산 성 eluent, 0.5 mL/min 유량, 4 kV 모 세관 전압, 및 모 세관 온도 350 ° C 22 , 23.
  2. 해당 하는 LC/엠 시스템의 평가 소프트웨어에서 총 이온 크로마의 피크를 선택 합니다. 확인 된 피크의 질량 스펙트럼 보기 300과 700 사이의 긍정적인 질량/전 비를 표시 합니다.
    참고: DMB sialic 산의 라벨 116.2 g/mol의 분자 질량에 있는 증가에 지도 한다. DMB 라는 sialic acid 종가지고 다음 분자 질량: DMB Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = mol. 공통 adducts/이기, 나트륨, 또는 소 프로필 알코올.

10. 서쪽 오 점 분석 켈리 신경 세포에 Polysialic 산의

  1. 세포 lysates의 준비
    1. 3.3 단계 및 소용돌이에서 셀 펠 릿을 1 mL 서쪽 오 점 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 품 어. 5 분 마다 소용돌이입니다. 1.5 h g와 4 ° C x 20000에 대 한 샘플을 원심 Lysed 세포에서 단백질을 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
    2. 단백질 분수, 예를 들어,는 브래드 퍼 드 또는 BCA 분석 결과의 단백질 농도 결정 합니다. 세포의 용 해 버퍼에서 µ 1.5 µ g/L의 단백질 농도에 샘플을 희석.
    3. 90 µ L 단백질 분수 (1.5 µ g / µ L) 10 µ L Laemmli 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 하 고 5 분24에 대 한 샘플을 끓여.
  2. Immunoblotting
    1. 20-30 µ L 주머니와 0.75 또는 1 m m 두께 8 %SDS-아크릴 아 미드 젤을 사용 합니다. 25에 젤을 실행 실시간에서 2 h mA
    2. 젤에서 유리 덮개를 조심 스럽게 제거. 잘라 고 로드 주머니를 포함 하는 젤의 위쪽 부분을 삭제. 서쪽 오 점 버퍼에 배어 이전 니트로 멤브레인 (0.2 µ m)에 젤을 놓습니다. 단백질은 니트로 시스템 (4 ° C에서 1 시간예를 들어, 250 mA)의 권고에 따라 전송.
    3. 더 럽 히 시스템에서 니트로 멤브레인을 제거 합니다. 단백질을 시각화 하기 위해 빨간색 Ponceau와 얼룩 얼룩. 니트로 막 플라스틱 챔버로 전송 하 고 차단 솔루션 10 mL를 추가 합니다. RT에 1 h incubate 또는 4 ° c.에서 하룻밤
    4. 차단 솔루션을 가만히 따르다와 PBS에서 안티-polySia 735의 단일 클로 널 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. RT에 1 h 막 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.
    5. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 또는 PBS에 형광 라벨 결합 polyclonal 항 마우스 IgG 이차 항 체 (1 µ g/mL)를 추가 합니다. 실시간에서 1 h 막 품 어 부 화, 후 세 번 이상 PBS 가진 5 분 동안 막 세척.
    6. 적절 한 영상 접시에 막 전송. 제조업체의 지침에 따라 신호를 감지 합니다.

결과

Neu5Ac 그리고 Neu5Gc 표준 형광의 HPLC chromatograms는 그림 2에 묘사 된다. 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여, DMB 라는 Neu5Gc 일반적으로 elutes 7-9 분 차입, 시간과 DMB-Neu5Ac 10-12 분 사이. 여러 작은 봉우리는 크로마는 일반적으로 2-6 분 사이 나타납니다. 이러한 봉우리 unreacted DMB 나타내고 반응 중개자25.

토론

화학적 합성된 ManNAc 파생 상품, ManNProp 및 ManNBut는 질량 분석을 통해 분석 하는 경우만 두 표본에 대 한 올바른 대량 피크 식별 되어야 합니다. 따라서, 제품 99% 이상의 순도가지고 추측 될 수 있다. 일반적으로 찾을 수 없는 인간의 셀29에, Neu5Gc의 적은 양은 lysed 세포의 막 분수에서 검색 됩니다. 이 대부분 미디어30에 소 태아 혈 청 sialoglycoconjugates에서 Neu5Gc 신병 ?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
ESI-MSD-SystemAgilent

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