Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Özet

Sialik asit (SIA) glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi son derece önemli bir kurucu olduğunu. Sigara azaltarak termini adlı oligo - ve polisakkaritler, aynı zamanda benzersiz kimyasal özellikleri onun konumunu nedeniyle çok sayıda farklı Reseptör-ligand etkileşimleri sialik asit ilgilenmektedir. Sialik asit hücre yüzeyinde ifade değiştirerek, sialik asit bağımlı etkileşimleri sonuç olarak etkilenir. Bu sialik asit bağımlı etkileşimleri araştırmak yararlı olabilir ve bazı hastalıklara yararlı bir şekilde etkilemek için bir potansiyele sahiptir. (MGE) metabolik glycoengineering sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu. Burada, hücre, doku veya hatta tüm hayvanlar N- acetylmannosamine (ManNAc) C2-modified türevleri ile tedavi edilir. Bu amino şeker sialik asit öncül molekül olarak hareket ve bu nedenle ilgili sialik asit tür metabolize edilir ve glycoconjugates üzerinde dile getirdi. Bu yöntemi uygulayarak çeşitli biyolojik süreçleri ilginç etkiler üretir. Örneğin, bu ifade polysialic asit (polySia) tedavi nöronal hücre önemli ölçüde azaltır ve böylece nöronal büyüme ve farklılaşma etkiler. İşte, N- butanoylmannosamine (ManNBut), yanı sıra iki en yaygın C2-modified N- acylmannosamine türevleri, N- propionylmannosamine (ManNProp) kimyasal sentez göstermektedir ve daha fazla nasıl bu doğal olmayan göster amino şeker hücre kültür deneylerde uygulanabilir. Ifade değiştirilmiş sialik asit türlerin yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sayılabilir ve kütle spektrometresi ile daha fazla analiz. Polysialic asit ifade üzerinde etkileri bir piyasada bulunan polysialic asit antikor kullanarak Western blot yolu ile aydınlatılmamıştır.

Giriş

Sialik asit glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi sigara azaltarak termini genellikle bulunabilir bir yaşam var. Tüm bol arasında sialik asit bazı benzersiz kimyasal özelliklere sahiptir. C-5 bulunduğu bir 9 C-atom omurga, karboksilik grubu deprotonated ve böylece olumsuz altında ücret fizyolojik şartlarda C-1 pozisyonda ve amino bir işlevi vardır. Sialik asit türevleri doğal olarak meydana gelen 50'in üzerinde tarihi1olarak nitelendirmiştir rağmen en baskın sialik asit insanlarda bulunan N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) biçimidir. Diğer memeliler de N- glycolylneuraminic asit (Neu5Gc)2,3daha yüksek miktarda hızlı.

Glycoconjugates nedeniyle maruz konumunu, sialik asit reseptör-ligand etkileşimleri, Örneğin, ana bilgisayar hücreleri4grip virüsü hemagglutinin bağımlı bağlantısını bir bolluk ilgilenmektedir. Sialik asit epitope önemli biyolojik fonksiyonları, özellikle sırasında embriyo ve sinir sisteminde polysialic asittir. Polysialic asit 200 alfa 2,8 bağlı sialik asit bir polimerdir. Polysialic asit büyük protein taşıyıcı sinir hücre adezyon molekülü (NCAM) olduğunu. Polysialic asit ifade yapışma azalır ve plastisite sinir sistemi5ile artar Polysialic asit ifade NCAM yapışkanlı mülkiyeti modüle.

Değişiklikler (poli) sialik asit ifadesi sonuçta bir çok farklı biyolojik etkileşimlerin etkiler. Bu bilinen sialik asit bağımlı işlemler roman glycoconjugate etkileşimleri ortaya çıkarmak veya olası tedavi edici yaklaşımlar keşfetmek için moleküler düzeyde eğitim için kullanılabilir. Farklı yöntem kullanılabilir örneğin sialik asit belirli glycosidases (sialidases), enzimler sialik asit biyosentezi6 dahil inhibisyonu ile tedavi hangi sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu, vardır ,7,8, ya da vurma veya anahtar enzim sialik asit biyosentezi9ifade değiştirme.

Sialik asit ifade modüle için başka bir çok yönlü MGE (olarak da bilinen metabolik oligosakkarit mühendislik, MOE) yöntemidir. Burada, hücre, doku veya hayvanlar için bile C2-amino değişiklikleri taşıyan doğal olmayan türevleri ManNAc ile tedavi edilir. Habercisi moleküller sialik asit, sonra hücresel alımını olmak, bu ManNAc analogları tek yönlü doğal olmayan metabolize sialik asit vardır ve sialylated glycoconjugates ifade edilebilir. ManNProp veya ManNBut, dahil N- propionylneuraminic asit (Neu5Prop) veya N- butanoylneuraminic asit (Neu5But) onların glycoconjugates10 olarak hücreleri Alifatik C2-değişiklikler, taşıma ManNAc türevleri ile kabul edilir , 11. fonksiyonel ManNAc C2-pozisyon tanıttı gruplarını kullanarak, meydana gelen doğal olmayan sialik asit birleştiğinde olabilir, mesela Staudinger ligasyonu veya floresan boyalar ile azid alkine cycloaddition üzerinden ve bu nedenle hücre yüzey12görüntülenir.

Bu doğal olmayan sialik asit ifade patojen enfeksiyonlar, yapışma ve göç tümör hücreleri, genel hücre adezyon, yanı sıra vaskülarizasyon ve farklılaşma (gözden geçirme için de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri üzerinde ilginç etkileri vardır bkz: Wratil vd. 13). İlginçtir, MGE ile N-modifiye asil mannosamines polysialic asit ifade ile müdahale için de kullanılabilir. Polysialic asit tarafından iki farklı polysialyltransferases (ST8SiaII ve ST8SiaIV) oluşturulur. Bu göstermiştir, bu polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp veya ManNBut14,15gibi doğal olmayan sialik asit öncüleri tarafından engellenir. Buna ek olarak, bu insan Nöroblastom hücrelerde ManNProp veya ManNBut uygulaması da toplam15sialylation azalttığı gösterilmiştir.

MGE ile N-modifiye asil mannosamines başarılı bir şekilde, sadece memeli ve bakteri hücre kültürü Caenorhabditis elegans16gibi farklı türlerin tüm hayvanlarda aynı zamanda kullanılmıştır yöntemi uygulamak kolay bir şey Zebra balığı17, ya da fareler18,19,20,21. Özellikle ManNProp ve ManNBut, dahil olmak üzere Alifatik değişiklik taşıyan ManNAc türevleri negligibly sitotoksik hücre kültür orta veya kan plazması millimolar konsantrasyonlarda bile. Ayrıca, onlar sentez nispeten kolaydır.

Burada, MGE Nile kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak-asetil değiştiren mannosamines. İlk olarak, iki ManNProp ve ManNBut, bu alanda en yaygın olarak kullanılan ManNAc türevlerinin kimyasal sentez açıkladı. Daha sonra biz MGE vivo içinde deney uygulanabilir nasıl gösterir. Örnek olarak, Nöroblastom hücre kültürünü Kelly seçildi polysialic epitope azalmış ifade göstermek için tarafından Western blot tedavi ManNAc türevleri ile sonra. Doğal olmayan sialik asit hücre yüzeyinde HPLC tarafından sayısal ve daha fazla kütle spektrometresi ile analiz edildi.

Protokol

1. hazırlanması arabellekleri ve Kimyasalları

  1. 3 mM sodyum methoxide çözüm hazırlanması
    1. 8.1 mg sodyum methoxide 50 mL metanol (3 mM) içinde bir heyecan çizgiyle 100 mL cam şişede geçiyoruz. Oda sıcaklığında (RT) birkaç hafta için saklayın.
  2. Tris-HCl tampon hazırlanması
    1. 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl ve 146 mg 100 mL cam şişe içinde EDTA bir heyecan bar ile birleştirin ve 80 mL suda çözülür.
    2. Sodyum hidroksit (suda 1 M) veya HCl (suda %20) karıştırma, pH metre ile pH kesilmediğini gözleyerek ekleyin ve 8,0 pH ayarlayın.
    3. 100 mL son hacmi elde etmek için gereken su hacmi ekleyin. 0,22 µm steril filtre sistemi kullanarak çözüm filtre.
      Not: 100 mL Tris-HCl tampon 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl ve 5 mM EDTA (pH 8.0) içerir. Çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanır.
  3. Aprotinin çözüm hazırlanması
    1. 10 mg aprotinin (1.54 mM) 1 mL suda çözülür. Aliquot 10 x 1,5 mL-plastik tüpler (100 µL her) aprotinin çözümde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  4. Leupeptin çözüm hazırlanması
    1. 10 mg leupeptin (10 mM) 2 mL suda çözülür. Aliquot leupeptin çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  5. Phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) çözüm hazırlanması
    1. 34.8 mg PMSF 2 mL etanol (100 mM) geçiyoruz. Aliquot PMSF çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler içinde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  6. 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) çözüm hazırlanması
    1. 15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol ve 48 µL Sodyum bisülfit-çözüm (% 39) birleştirin ve 9,6 mL su (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol ve %0.19 Sodyum bisülfit) ekleyin. Aliquot 40 x 1,5 mL-plastik tüpler (250 her µL) DMB çözümde. Mağaza için birkaç hafta ışık-20 ° C'de korunuyorsunuz.
  7. 1 M trifluoroacetic asit (TFA) çözüm hazırlanması
    1. % 100 770.3 µL eklemek TFA bir 15 mL plastik tüp (1 M) 9,23 mL su için. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  8. 120 mM TFA çözüm hazırlanması
    1. 92,4 µL TFA (% 100) 9.91 mL suda 15 mL plastik tüp (120 mM) ekleyin. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  9. 400 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözüm hazırlanması
    1. 160 mg 15 mL plastik tüp 10 mL su (400 mM) NaOH geçiyoruz. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  10. Western blot lizis arabellek hazırlanması
    1. Dağıtılması 5,84 g NaCl, 0.1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2ve 1 g Triton-X100 100 ml su ve pH 7.8 için ayarlayın. 4 ° C'de mağaza Her proteaz inhibitörü (aprotinin, leupeptin ve PMSF) 100 µL lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.
  11. Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) arabellek hazırlanması
    1. 0.3 g Tris, 1.5 g glisin ve 0.1 g SDS 100 mL suda çözülür ve pH 7,3 için ayarlayın. Mağazada RT.
  12. Western blot arabellek hazırlanması
    1. 0.3 g Tris, 1.1 g glisin 90 mL suda çözülür ve 10 mL etanol ekleyin. Mağazada RT.
  13. Hazırlık çözüm engelleme
    1. Yağlı ücretsiz süt güç 25 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 g geçiyoruz. Her zaman taze hazırlayın.

2. ManNProp ve ilgili Nsentezi-asil-Mannosamines modifiye

  1. 431.2 mg mannosamine hidroklorid çözümde 10 mL 3 mM sodyum methoxide 50 mL cam şişe bir heyecan çizgiyle geçiyoruz.
  2. Buz 0 ° c üzerinde karışımı serin Karıştırma, yavaş yavaş dropwise 210 µL propionyl klorür (2.4 mmol) veya ManNProp veya ManNBut, sırasıyla sentez 248 µL butanoyl klorür (2.4 mmol) ekleyin. 0 ° C 4 h için karıştırma karisimin kuluçkaya.
  3. Çözüm 50 mL plastik tüpün içine aktarın. 4-8 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızla sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra lyophilize (dondurma kuru) bu 48 h veya kadar tamamen kurudu.
  4. 350 g silikon jel 60 750 mL Etil-asetat/metanol / (Bu bir süspansiyon) mix su ile (15:2:1). Bir cam sütun (35 mm çap ve 70 cm uzunluk) silika jel 60 süspansiyon ile doldurun ve bir ek 100 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ile hazırlanmış sütun kullanmadan önce yıkayın.
  5. Adım 2.3 kurutulmuş Urun dağıtılması (5 g kurutulmuş ürün) 10 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ve yük bir pipet silis üzerine kullanarak sütun jel. 4 mL kesirler sonra 500 mL (ManNProp için) toplamak. Not: ManNBut sütundan sonra yaklaşık 700 mL elute.
  6. Eluted kesirler 15 mL plastik tüpler içine aktarın. 3-6 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra tamamen kurudu kadar lyophilize.
    Not: Lyophilized ürünleri RT. birkaç ay depolanabilir
  7. Saflık Ürünler Kütle spektrometresi (bakınız Bölüm 9) doğrulayın.
    Not: Alternatif olarak, saflık da 1tarafından H Nükleer manyetik rezonans (NMR) doğrulanabilir.

3. hücre kültürü

  1. Kültür Kelly Nöroblastom Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta % 10 fetal sığır serum, 100 U penisilin, 100 mg streptomisin, 2 mM L-glutamin içeren 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp veya 5 mM ManNBut, 37 ° C ve % 5 CO2içeren hücrelerde.
    Not: Orta ManNAc veya kendi analogları olmadan kültürlü hücreler bir denetim olarak kullanılır.
  2. Mannosamines uygulanması önce onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka Kelly Nöroblastom hücre bağlantısını kesin ve Neubauer-odası veya hücre sayaç saymak. Tohum hücreleri tanımlanmış numaralarından plaka/çanak boyutuna bağlı.
    1. Sialik asit bol ölçmek için 1 x 105 500 µL orta hücrelerde bir 48-iyi doku kültürü tabak tohum. Polysialic asitler analiz için 1 x 106 6 cm çapında hücre kültür çanak 3 mL ortamına hücrelerde tohum. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. Her 24 h orta yerine.
      Not: Tedavi toplam süresi ile MGE etkisini artırır. Yüksek metabolik verimlilik için 5-7 gün için hücreleri tedavi.
  3. Kullanımdan sonra orta dikkatle boşaltmak. PBS ile plakalar/bulaşıkları yıkamak. Hücreleri onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka bağlantısını kesin. Tripsin müstakil hücrelere hücre kültür orta aynı hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin. Müstakil hücreleri 15 mL plastik tüpler içine aktarın. Örnekleri için 500 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    1. (Bkz. Adım 3.3) 5 mL PBS ve santrifüj hücreleri ekleyin. Yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın.
      Not: Yıkanmış hücre Pelet süpernatant olmadan birkaç gün için-20 ° C'de muhafaza edilebilir. Polysialic asit ifade aydınlatılmamıştır için ise 10 bölümüne gidin.

4. hücre lizis HPLC analiz için

  1. HPLC lizis arabellek hazırlanması
    1. 5 mL Tris-HCl tampon, 5 µL aprotinin çözüm, 20 µL leupeptin çözüm ve 50 µL PMSF çözüm birleştirir.
      Not: 5 mL HPLC lizis arabellek 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1.54 µM aprotinin, 40 µM içerecektir Leupeptin ve 1 mM PMSF (pH 8.0). Bu arabellek her zaman taze hücre lizis önce hazırlanmalıdır.
  2. Toplanan hücre granül (Adım 3.3) her 500 µL buz gibi HPLC lizis-arabellekte yeniden askıya alma ve ultra-örnekleri bir ultra sonik işlemci iğne ile üç kez bir süre 30 için solüsyon içeren temizleyicide orta-yüksek genlikleri s. Örnekleri için en az 1 dk döngüleri arasında buzda ne yapıyorsun?

5. membran kesir ayrılması

  1. 20.000 x g ve 4 ° c 2 h lysed hücre örnekleri santrifüj kapasitesi 1.5 mL plastik tüpler sitozolik protein temsil eden süpernatant (yaklaşık 480 µL), ayırın. Kullanarak, örneğin, Bradford veya bicinchoninic asit (BCA) tahlil bu kesirler protein konsantrasyonu belirlemek.
    Not: Sitozolik kesirler protein konsantrasyonu (yaklaşık 1 mg/mL) daha sonra saygın sialik asit türü ölçülen miktarlarda ilgili olabilir. Pelet 6.1 adımda kullanılan membran kesir temsil eder.

6. asidik hidroliz

Not: Oligo - ve hücre zarlarında polisakkaritler için bol hidrolize. Ayrıca, olası O-bol olarak değişiklikleri hidrolize, de. Sialik asit membran kesirler ezici çoğunluğu doğal olarak glycoconjugates içinde dahil edilmiştir ve muhtemelen Oayı olabilir kantitatif HPLC analiz için gerekli olmasıdır-asetil ya da O- lactolyl değişiklikler.

  1. 150 µL 1 M eklemek TFA-çözüm için ayrılmış membran kesirler (Pelet bölümünden 5). Örnekleri 200-600 devir / dakikada sallayarak ile 80 ° C 4 h için kuluçkaya.
  2. Yaklaşık 30 dakika 20.000 x g ve üst aşama birim daha az 20 µL olana 3 kDa dışlama membranlar ile 0.5 mL filtre tüpler kullanarak 21 ° C için örnekler santrifüj kapasitesi.
    Not: Bu adım daha yüksek moleküler enkaz imha etmek önemlidir.
  3. 2 mL plastik tüpler içine sialik asit türler de dahil olmak üzere daha küçük moleküller içeren alt aşaması aktarın. 2-4 delik plastik tüpler kapaklar ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak örnekleri donma ve sonra onları bir gecede lyophilize.
    Not: Kurutulmuş örnekleri RT. Değiştir bir kap delik olmadan, birkaç gün daha uzun depolama için saklanır.

7. floresan etiketleme

  1. Kurutulmuş örnekleri 10 µL 120 mM TFA çözümde yeniden askıya alma ve 50 µL DMB çözüm ekleyin. Örnekleri ultraviyole ışık onları korumak için karanlık 1,5 mL tüpler içine aktarın.
  2. Standartları için 1 µL çözülür Neu5Ac (60 ng/mL, su) veya 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, su) 10 µL 120 mM TFA çözüm karanlık 1,5 mL tüpler içinde. 50 µL DMB çözüm ekleyin.
  3. Hücre zarının örnekleri kuluçkaya ve 1,5 saat 56 ° c standartları ışıktan korunan. Kuluçka sonra etiketleme reaksiyonu durdurmak için her bir örneği için 4 µL 400 mM NaOH çözüm ekleyin.

8. HPLC analiz

Not: Etiketli örnekleri C18 RP sütun ile donatılmış bir HPLC sistemi analiz edilir (110 Å, 3 µm partikül büyüklüğü 4.6 x 150 mm), Floresans dedektörü ve kesir toplayıcı. Kullanılan çözücüler metanol, Asetonitril ve su vardır. HPLC sistemi dahili bir degasser yoksa ölçümler önce tüm çözücüler degas emin olun.

  1. Sütun sıcaklık 40 ° C ila ayarlayın ve floresan dedektörü ile 373 yapılandırmak için uyarma ve 448 nm nm için emisyon, sırasıyla. 10 µL numune hacmi enjekte ve metanol/Asetonitril/su (6:8:86) olarak eluent ile 50 dk az 0.5 mL/dk akış hızı probları ayrı. Kütle spektrometresi analiz için faiz doruklarına toplamak.
    Not: Neu5Gc 6-8 min, 9-12 dakika, 17-23 dk sonra Neu5Prop ve 38-44 dakika sonra Neu5But sonra Neu5Ac sonra eluate için bekleniyor. Fraksiyonlara örnekleri için birkaç h ışıktan korunan 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Her örnek ölçme sonra sütun için 7.5 dak 1.0 mL/dk akış hızı (≈ 1.5 sütun birimler) metanol/Asetonitril/su (6:25:69) ile yıkama ve 1.0 mL/dk akış hızı metanol/Asetonitril/su (6:8:86) ile 7.5 dakika için sistemi yeniden equilibrate.
  3. Kantitatif analiz için ilgili HPLC sistemi22işletim yazılımı kullanarak faiz sialik asit doruklarına eğri altındaki alan hesaplamak.
    Not: Elde edilen veri Neu5Ac veya Neu5Gc standart ve ölçülen protein konsantrasyonları sitozolik kesirler (bakınız Bölüm 5.1) ilgili olabilir.

9. sialik asit bol kütle spektrometresi analizleri

Not: HPLC saklama doruklarına ilgi daha fazla sıvı Kromatografi (LC) electrospray-iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS), tarafından doğal olmayan sialik asit türler doğrulamak için analiz edilebilir.

  1. Kütle spektrometresi analiz için toplanan örnek 20 µL %79.9 metanol, % 20 izopropil alkol ve %0,1 formik asit eluent, 0.5 mL/dk akış hızı, 4 kV kapiller gerilim ve kapiller 350 ° C sıcaklık ile bir LC/kütle seçici dedektörü (MSD) sistemi içine enjekte 22 , 23.
  2. Değerlendirme yazılım ilgili LC/MSD sistem, toplam iyon Kromatografik ilgi zirvesine seçin. Çözümlenmiş tepe kütle spektrumu görüntüleyin. 300 ve 700 arasındaki olumlu kütle/şarj oranı görüntüler.
    Not: DMB sialik asit etiketleme 116.2 g/mol moleküler kütlesi bir artışa yol açar. DMB etiketli sialik asit türü aşağıdaki moleküler kütlesi var: DMB-Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = / moleküler ortak adducts Asetonitril, sodyum veya izopropil alkol vardır.

10. Western Blot analizi Kelly Neuroblastoma hücre Polysialic asit

  1. Hücre lysates hazırlanması
    1. 1 mL Western blot lizis arabellek hücre topakları adım 3.3 girdap ekleyebilir. Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Girdap her 5 dak. 20.000 g ve 4 ° c x 1,5 saat için örnekler santrifüj kapasitesi Lysed hücrelerden protein içeren süpernatant toplamak.
    2. Protein kesirler, örneğin, Bradford veya BCA tahlil protein konsantrasyonu belirlemek. Örnekleri için 1,5 µg/µL lizis arabellekte bir protein konsantrasyonu sulandırmak.
    3. Örnekleri 10 µL Laemmli örnek arabellek 90 µL protein Fraksiyonu (1,5 µg/µL) ekleyerek SDS-sayfa için hazırlamak ve örnek 5 min24için kaynatın.
  2. Immunoblotting
    1. % 8 SDS-Akrilamid jelleri 20-30 µL cepler ve 0,75 veya 1 mm kalınlığı ile kullanın. Jel 25, koş mA RT 2 h için
    2. Dikkatli bir şekilde cam kapak jel çıkarın. Kes şunu ve yükleme cepler içeren jel üst kısmını atın. Daha önce Western blot arabellekte batırılmış jel nitroselüloz membran (0.2 µm), üzerinde yerleştirin. Proteinler nitroselüloz öneri sistemi (Örneğin, 250 mA için 1 h 4 ° C'de) göre aktarın.
    3. Nitroselüloz membran blotting sisteminizden kaldırın. Leke Ponceau olan proteinleri görselleştirmek için kırmızı leke. Plastik bir odaya nitroselüloz membran aktarmak ve 10 mL çözüm engelleme ekleyin. RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
    4. Engelleme çözüm dikkatle boşaltmak ve PBS içinde monoklonal anti-polySia 735 antikor (1 µg/mL) ekleyin. Membran RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.
    5. Poliklonal Anti-fare IgG ikincil antikor (1 µg/mL) horseradish peroksidaz (HRP) veya floresan bir etiket PBS ile birleştiğinde ekleyin. Membran RT. 1 h için kuluçkaya Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.
    6. Membran uygun bir Imager bir tabak üzerine aktarın. Üreticinin yönergelerine uygun sinyal tespit.

Sonuçlar

HPLC chromatograms Neu5Ac ve Neu5Gc standartları etiketli Floresan, Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, DMB etiketli Neu5Gc genellikle 7-9 dk elüsyon süresi ile DMB-Neu5Ac arasında 10-12 dk arasında elutes. Kromatografik birkaç daha küçük tepeler genellikle 2-6 dk arasında görünür. Bu tepeler unreacted DMB temsil ve reaksiyon25ara ürün.

Tartışmalar

Kimyasal sentez ManNAc türevleri, ManNProp ve ManNBut kütle spektrometresi ile analiz edilir, sadece doğru kitle tepe her iki örnekleri için tespit edilmelidir. Bu nedenle, ürünler üzerinde % 99 saflık için kabul edilebilir. İnsan hücreleri29normalde bulunmazsa, Neu5Gc az miktarda lysed hücre membran kesirler tespit edilir. Bu en olası fetal sığır serum sialoglycoconjugates medya30' dan Neu5Gc acemi bir kurtarma yol boyunca oluşur. Sialik asit biyosentezi,...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz L. ö Nguyen için el yazması yazım denetleme ve verimli tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca, biz J. Dernedde ve H. G. Nguyen video çekimi hazırlanıyor bize yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Çoğu sahneleri video R. Tauber laboratuvarlarda çekildi. Ayrıca Max Planck Enstitüsü Kolloidler ve arabirimleri ile ilgili ve bize kütle spektrometresi tesislerini ücretsiz erişim verdiğiniz için teşekkür ederiz. RH DFG (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCShimadzu

Referanslar

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. . Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 129sialik asitpolysialic asity ksek performansl s v Kromatografih cre k lt rmetabolik glycoengineeringmetabolik oligosakkarit m hendislik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır