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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Sialinsäure Säure ist eine typische Monosaccharid-Einheit in Glykokonjugate gefunden. Es ist in einer Vielzahl von molekularen und zellulären Interaktionen beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Zelle Oberfläche Sialinsäure Säure Ausdruck mit metabolischen Glykan mit N- Acetylmannosamine Derivate zu ändern.

Zusammenfassung

Sialinsäure Säure (Sia) ist ein sehr wichtiger Bestandteil des Glykokonjugate, wie N- O- Glykanen und Glycolipide. Wegen seiner Lage am Termini-Reduzierung von Oligo- und Polysaccharide, sowie seine einzigartigen chemischen Eigenschaften ist Sialinsäure Säure in einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Ligand-Interaktionen beteiligt. Durch Ändern des Ausdrucks der Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche, werden folglich Sialinsäure Säure-abhängige Interaktionen beeinflusst werden. Dies kann hilfreich sein, Sialinsäure Säure-abhängige Interaktionen zu untersuchen und hat das Potenzial, bestimmte Krankheiten in eine positive Weise zu beeinflussen. Über metabolische Glykan (MGE) kann der Ausdruck der Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche moduliert werden. Hierin werden Zellen, Gewebe oder sogar ganze Tiere mit C2-modifizierte Derivate von N- Acetylmannosamine (ManNAc) behandelt. Diese Aminozucker sind fungieren als Sialinsäure-Vorläufer Moleküle und daher zu den entsprechenden Sialinsäure Säure Arten verstoffwechselt und über Glykokonjugate zum Ausdruck gebracht. Anwendung dieser Methode produziert faszinierende Effekte auf verschiedene biologische Prozesse. Z.B. es kann drastisch reduziert die Expression von Polysialic Säure (PolySia) im behandelten neuronalen Zellen und wirkt sich somit auf neuronale Wachstum und Differenzierung. Hier zeigen wir die chemische Synthese von zwei der am häufigsten verwendeten C2-modifizierten N- Acylmannosamine Derivate, N- Propionylmannosamine (ManNProp) sowie N- Butanoylmannosamine (ManNBut), und weiter zeigen, wie diese nicht-natürliche Aminozucker können in Kultur Zellexperimente angewendet werden. Der Ausdruck veränderter Sialinsäure Säure Arten durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) quantifiziert und weiter per Massenspektrometrie analysiert. Die Auswirkungen auf die Polysialic Säure Ausdruck sind über Western-Blot mit einem im Handel erhältlichen Polysialic Säure Antikörper aufgeklärt.

Einleitung

Sialinsäure Säure ist ein Monosaccharid, die in der Regel an die nicht-reduzierende Termini der Glykokonjugate, z. B. N- und O- Glykanen oder Glycolipide gefunden werden kann. Unter alle Monosaccharide hat Sialinsäure Säure einige einzigartigen chemische Eigenschaften. Es hat eine 9 C-Atom Rückgrat, eine carboxylic Gruppe in der c-1-Position, das deprotonierten und dadurch negativ geladenen unter physiologischen Bedingungen und eine amino-Funktion in der c-5-Position. Obwohl mehr als 50 natürlich vorkommenden Varianten der Sialinsäure Säure Datum1charakterisiert wurden, ist die vorherrschende Form der Sialinsäure Säure findet man bei Menschen N- Acetylneuraminic Säure (Neu5Ac). Andere Säugetiere express auch höhere Mengen von N- Glycolylneuraminic Säure (Neu5Gc)2,3.

Aufgrund seiner exponierten Lage in Glykokonjugate ist Sialinsäure Säure in einer Vielzahl von Rezeptor-Ligand-Interaktionen, z. B. die Hämagglutinin abhängige Bindung des Influenza-Virus zu Host Zellen4beteiligt. Ein Epitop Sialinsäure Säure mit wichtige biologische Funktionen, vor allem in der Embryogenese und im Nervensystem, ist Polysialic Säure. Polysialic Säure ist ein Polymer von bis zu 200 2,8 verknüpft Sialinsäure Alphasäuren. Der große Protein Träger der Polysialic Säure ist das neuronale Zelle Adhäsionsmolekül (NCAM). Polysialic Säure Ausdruck moduliert die Hafteigenschaft NCAM in diesem Polysialic Säure Ausdruck die Adhäsion verringert und erhöht die Plastizität mit dem Nervensystem-5.

Veränderungen in der Expression von (Poly) Sialinsäure Säure beeinflußt schließlich eine Vielzahl von verschiedenen biologischen Wechselwirkungen. Dies kann zur bekannten Sialinsäure Säure abhängigen Prozesse auf molekularer Ebene, um neuartige Glycoconjugate Interaktionen zu entdecken, oder erkunden mögliche therapeutische Ansätze zu studieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Verfügung mit denen die Expression von Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche moduliert werden kann, z. B. Behandlung mit Sialinsäure Säure bestimmte Glycosidases (Sialidases), Hemmung der Enzyme bei der Sialinsäure Säure-Biosynthese6 ,7,8, oder umzuwerfen oder den Ausdruck des wichtigsten Enzyms der Sialinsäure Säure Biosynthese9ändern.

Eine weitere vielseitige Methode zu modulieren, Sialinsäure Säure Ausdruck ist MGE (auch bekannt als metabolische Oligosaccharid Engineering, MOE). Hierin werden Zellen, Gewebe oder sogar Tiere mit nicht-natürliche Derivate des ManNAc behandelt, die C2-amino Modifikationen zu tragen. Als Vorläufer-Moleküle für Sialinsäure Säure nach zelluläre Aufnahme, diese ManNAc-Analoga sind unidirektionale metabolisiert, naturfremde Sialinsäure Säuren und auf Sialylated Glykokonjugate ausgedrückt werden können. Zellen mit ManNAc Derivate mit aliphatischen C2-Änderungen, wie z. B. ManNProp oder ManNBut, integrieren, N- Propionylneuraminic Säure (Neu5Prop) oder N- Butanoylneuraminic Säure (Neu5But) in ihrer Glykokonjugate10 behandelt , 11. mithilfe von funktionellen Gruppen in der C2-Position des ManNAc eingeführt, die auftretenden naturfremde Sialinsäure Säuren koppelbar, z. B. über die Staudinger Ligation oder Azid Alkin Cycloaddition, mit Fluoreszenz-Farbstoffen und daher auf der Zelle Oberfläche12visualisiert.

Der Ausdruck dieser naturfremde Sialinsäure Säuren hat faszinierende Wirkung auf viele biologische Prozesse, einschließlich Erreger Infektionen, die Adhäsion und Migration von Tumorzellen, allgemeine Zelladhäsion, sowie Vaskularisierung und Differenzierung (zur Überarbeitung siehe: Wratil Et Al. 13). Interessanterweise MGE mit N-Acyl geändert Mannosamines kann auch verwendet werden, mit dem Ausdruck der Polysialic Säure zu stören. Polysialic Säure wird durch zwei verschiedene Polysialyltransferases (ST8SiaII und ST8SiaIV) erzeugt. Es wurde nachgewiesen, dass Polysialyltransferase ST8SiaII durch unnatürliche Sialinsäure Säure Vorläufer, z. B. ManNProp oder ManNBut14,15gehemmt wird. Darüber hinaus wurde in menschlichen Neuroblastoma Zellen nachgewiesen, dass ManNProp oder ManNBut Anwendung auch Sialylation in insgesamt15reduziert.

MGE mit N-Acyl geändert Mannosamines ist eine einfach anzuwendende Methode, die erfolgreich, nicht nur in Säugetieren und Zellkultur Bakterien sondern auch im gesamten Tiere verschiedener Arten, wie Caenorhabditis Elegans16 eingesetzt wurden, Zebrafisch17oder Mäuse18,19,20,21. Vor allem ManNAc Derivate mit aliphatischen Änderungen, einschließlich ManNProp und ManNBut, sind geringfügig zytotoxische, auch bei millimolaren Konzentrationen im Zellkulturmedium oder Blutplasma. Darüber hinaus sind sie relativ leicht zu synthetisieren.

Hier bieten wir Informationen zur Verwendung von MGE mit N-Acetyl geändert Mannosamines. Zunächst ist die chemische Synthese von zwei der am häufigsten verwendete ManNAc-Derivate in diesem Bereich, ManNProp und ManNBut, erläutert. Als Nächstes zeigen wir, wie MGE in einem in-Vivo -Experiment angewendet werden kann. Als Beispiel der Neuroblastom-Zelllinie Kelly wurde gewählt, um verminderte Expression von Polysialic Epitop demonstrieren durch Western blot nach der Behandlung mit den ManNAc-Derivaten. Die naturfremde Sialinsäure Säuren auf der Zelloberfläche wurden mittels HPLC quantifiziert und weiter per Massenspektrometrie analysiert.

Protokoll

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien

  1. Vorbereitung von 3 mM Natrium метоксида Lösung
    1. 8,1 mg Natrium метоксида in 50 mL Methanol (3 mM) in einer 100 mL-Glasflasche mit Stir Bar auflösen. Lagerung bei Raumtemperatur (RT) für mehrere Wochen.
  2. Vorbereitung der Tris-HCl-Puffer
    1. 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl und 146 mg EDTA in einer 100 mL-Glasflasche mit Stir Bar zu kombinieren und in 80 mL Wasser auflösen.
    2. Die bewegende Lösung unter Beachtung des pH-Wertes mit einem pH-Meter von Natriumhydroxid (1 M, in Wasser) oder HCl (20 % in Wasser) hinzu, und stellen Sie den pH-Wert auf 8.0.
    3. Fügen Sie das Volumen des Wassers benötigt, um ein finales Volumen von 100 mL zu erreichen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µm Sterilfilter System.
      Hinweis: 100 mL Tris-HCl-Puffer enthält 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl und 5 mM EDTA (pH 8,0). Die Lösung kann für mehrere Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
  3. Vorbereitung der Aprotinin-Lösung
    1. 10 mg Aprotinin in 1 mL Wasser (1,54 mM) auflösen. Aliquot der Aprotinin-Lösung in 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre (100 µL). Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  4. Vorbereitung der Leupeptin Lösung
    1. Lösen Sie 10 mg Leupeptin in 2 mL Wasser (10 mM). Aliquoten Leupeptin Lösung 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre. Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  5. Vorbereitung der Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) Lösung
    1. Auflösen von 34,8 mg PMSF in 2 mL Ethanol (100 mM). Aliquoten PMSF Lösung in 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre. Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  6. Herstellung von 1,2-Diamino-4,5-Methyldioxybenzol-Dihydrochloride (DMB) Lösung
    1. Kombinieren Sie 15,62 mg DMB, 352 µL β-Mercaptoethanol und 48 µL Natrium Bisulfit-Lösung (39 %) und 9,6 mL Wasser (6,9 mM DMB, 500 mM β-Mercaptoethanol und 0,19 % Natrium Bisulfit). Aliquoten die DMB-Lösung in 40 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre (250 µL). Shop für mehrere Wochen lichtgeschützt bei-20 ° C.
  7. Vorbereitung der Lösung 1 M Trifluoroacetic Säure (TFA)
    1. Fügen Sie 770.3 µL 100 % TFA in 9,23 mL Wasser in ein Kunststoffrohr 15 mL (1 M). Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  8. Vorbereitung von 120 mM TFA Lösung
    1. 9,91 mL Wasser (120 mM) in 15 mL Kunststoffhülse 92,4 µL TFA (100 %) hinzufügen. Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  9. Vorbereitung von 400 mM (NaOH) Natronlauge
    1. 160 mg NaOH in 10 mL Wasser (400 mM) in einem 15 mL Kunststoff Rohr zu lösen. Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  10. Vorbereitung der Western-Blot-Lyse-Puffer
    1. Lösen Sie 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2und 1 g Triton-X100 in 100 mL Wasser und den pH-Wert 7,8 einstellen. Shop bei 4 ° C. Fügen Sie 100 µL jeder Protease-Inhibitor (Aprotinin, Leupeptin und PMSF) vor der Verwendung des Lyse-Puffers.
  11. Vorbereitung von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Puffer
    1. 0,3 g Tris, 1,5 g Glycin und 0,1 g SDS in 100 mL Wasser auflösen und den pH-Wert 7,3 einstellen. Shop bei RT
  12. Vorbereitung der Western-Blot-Puffer
    1. 0,3 g Tris, 1,1 g Glycin in 90 mL Wasser auflösen und 10 mL Ethanol hinzufügen. Shop bei RT
  13. Vorbereitung der Lösung blockieren
    1. Lösen Sie 1 g Fett Milch macht in 25 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Immer frisch zubereiten.

(2) Synthese von ManNProp und damit verbundenen N-Acyl-Mannosamines geändert

  1. 431,2 mg Mannosamine Hydrochlorid in 10 mL 3 mM Natrium метоксида Lösung in einer 50 mL-Glasflasche mit Stir Bar zu lösen.
  2. Abkühlen der Mischung auf Eis, 0 ° C. Der mitreißende Projektmappe fügen Sie langsam tropfenweise 210 µL Propionyl Chlorid (2,4 Mmol) oder 248 µL-Butanoyl-Chlorid (2,4 Mmol), ManNProp oder ManNBut, bzw. zu synthetisieren hinzu. Inkubieren Sie die mitreißende Mischung bei 0 ° C für 4 h.
  3. Übertragen Sie die Lösung in ein 50 mL-Kunststoff-Rohr. Stechen Sie 4-8 Löcher in den Deckel des Kunststoffrohres mit einer dünnen Nadel. Schnell die Lösung mit Flüssigstickstoff Einfrieren und später lyophilize (Einfrieren trocken) für 48 h oder bis es vollständig getrocknet ist.
  4. Mischen Sie 350 g Kieselgel 60 mit 750 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) (Dies ist eine Suspension). Füllen Sie eine Glassäule (35 mm Durchmesser und 70 cm Länge) mit Kieselgel 60 Federung und waschen Sie die vorbereitete Spalte mit einem zusätzlichen 100 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) vor Gebrauch.
  5. Die Trockenprodukte aus Schritt 2.3 auflösen (5 g getrocknete Produkt) in 10 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) und laden Sie sie mit einer Pipette auf die Silica gel-Spalte. Sammeln Sie 4 mL Fraktionen nach 500 mL (für ManNProp). Hinweis: ManNBut wird aus der Spalte nach etwa 700 mL eluieren.
  6. Übertragen Sie der eluierten Brüche in 15 mL-Kunststoff-Rohre. Stechen Sie 3-6 Löcher in den Deckel des Kunststoffrohres mit einer dünnen Nadel. Rapid die Lösung mit flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend lyophilize, bis es vollständig getrocknet ist.
    Hinweis: Die gefriergetrockneten Produkte können für mehrere Monate bei RT gelagert werden
  7. Überprüfen Sie die Reinheit der Produkte durch Massenspektrometrie (siehe Abschnitt 9).
    Hinweis: Alternativ kann Reinheit auch um 1H Kernspinresonanz (NMR) überprüft werden.

3. die Zellkultur

  1. Kultur-Kelly-Neuroblastom-Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10 % fötalen Rinderserum, 100 U Penicillin, 100 mg Streptomycin, 2 mM L-Glutamin mit 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp oder 5 mM ManNBut, bei 37 ° C und 5 % CO2-haltigem Medium.
    Hinweis: Zellen kultiviert in Medium ohne ManNAc oder seine Analoga sind als Kontrolle verwendet.
  2. Vor der Anwendung von der Mannosamines die Kelly-Neuroblastom-Zellen durch Inkubation sie für 10 min mit Trypsin/EDTA (0,25 %, 0,02 %, mit PBS-Puffer) abnehmen und Neubauer-Kammer oder Zelle Zähler zählen. Samen der Zellen auf definierten Zahlen basierend auf der Größe der Platte/Schale.
    1. Zur Messung der Sialinsäure Säure Monosaccharide Samen Sie 1 x 105 Zellen in 500 µL Medium in einer Gewebekultur 48-Well-Platte. Samen Sie für die Analyse der Polysialic Säuren 1 x 106 Zellen in 3 mL Medium auf einem 6 cm Durchmesser Zelle Kulturschale. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium alle 24 h.
      Hinweis: Die Wirkung von MGE steigt mit der Gesamtzeit der Behandlung. Für hohe Stoffwechseleffizienz behandeln Sie die Zellen für 5-7 Tage.
  3. Nach der Behandlung Dekantieren des Mediums. Waschen Sie die Platten/Geschirr mit PBS. Lösen Sie die Zellen, indem Inkubation sie für 10 min mit Trypsin/EDTA (0,25 %, 0,02 %, mit PBS-Puffer). Die Trypsin zu neutralisieren, indem die freistehenden Zellen die gleiche Menge an Zellkulturmedium hinzufügen. Übertragen Sie die freistehenden Zellen in 15 mL-Kunststoff-Rohre. Zentrifugieren Sie Proben für 3 min bei 500 X g und verwerfen Sie den überstand.
    1. Fügen Sie 5 mL PBS und Zentrifuge Zellen (siehe Punkt 3.3 hinzu). Wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male.
      Hinweis: Das gewaschene Zelle Pellet ohne Überstand kann bei-20 ° C für mehrere Tage gespeichert werden. Wenn der Ausdruck der Polysialic Säure ist geklärt werden weiter zum Abschnitt 10.

(4) Zell-Lyse für HPLC-Analytik

  1. Vorbereitung der HPLC-Lyse-Puffer
    1. Kombinieren Sie 5 mL Tris-HCl-Puffer, 5 µL Aprotinin Lösung, 20 µL Leupeptin Lösung und 50 µL PMSF Lösung.
      Hinweis: enthält 5 mL HPLC Lysis Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM Aprotinin 40 µM Leupeptin, und 1 mM PMSF (pH 8,0). Dieser Puffer sollte immer vor der Zelle Lysis frisch zubereitet werden.
  2. Neu die gesammelten Zelle Pellets (Schritt 3.3) jeder in 500 µL eiskalte HPLC Lyse-Puffer, und Ultra-beschallen die Proben mit einer Ultraschall-Prozessor Nadel dreimal für einen Zeitraum von 30 s bei mittleren bis hohen Amplituden. Kühlen Sie die Proben auf Eis für mindestens 1 Minute zwischen den Zyklen.

5. Trennung der Membran-Fraktion

  1. Zentrifugieren der lysierten Zellproben für 2 h bei 20.000 x g und 4 ° C. Den überstand (ca. 480 µL), Vertretung cytosolischen Proteine in 1,5 mL-Kunststoff-Rohre zu trennen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration dieser Fraktionen verwenden, z. B.der Bradford oder der Bicinchoninic Säure (BCA) Test.
    Hinweis: Die Konzentration des Proteins (ca. 1 mg/mL) der cytosolischen Fraktionen kann die gemessenen Mengen der Gattung angesehenen Sialinsäure Säure später verwandt. Das Pellet Bruchteil der Membran, die in Schritt 6.1 verwendet wird.

6. saure Hydrolyse

Hinweis: Oligo- und Polysaccharide in den Zellmembranen zu Monosacchariden hydrolysiert. Weitere, mögliche O-Änderungen in den Monosacchariden hydrolysiert, sowie. Dies ist notwendig für quantitative HPLC-Analytik, da die überwältigende Mehrheit der Sialinsäure Säuren in den Membran-Fraktionen natürlich in Glykokonjugate fließen und möglicherweise zu O tragen könnten-Acetyl oder O- Lactolyl Änderungen.

  1. Fügen Sie 150 µL 1 M TFA-Lösung für die getrennte Membrane Brüche (Pellet aus Abschnitt 5). Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 80 ° C mit Schütteln bei 200-600 u/min.
  2. Zentrifugieren Sie Proben für ca. 30 min bei 20.000 x g und 21 ° C mit 0,5 mL Filterschläuche mit 3 kDa Ausgrenzung Membranen, bis die obere Phase weniger als 20 µL beträgt.
    Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, höher molekulare Schutt entsorgen.
  3. Die untere Phase enthält kleinere Moleküle, einschließlich der Sialinsäure Säure-Arten in 2 mL-Kunststoff-Rohre zu übertragen. Stechen Sie 2-4 Löcher in das Kappen der Kunststoffrohre mit einer dünnen Nadel. Rapid der Proben mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann lyophilize sie über Nacht.
    Hinweis: Die getrockneten Proben können über mehrere Tage bei RT ersetzen eine Kappe ohne Löcher für eine längere Lagerung gelagert werden.

(7) fluoreszierende Kennzeichnung

  1. Erneut die getrockneten Proben in 10 µL 120 mM TFA Lösung auszusetzen und 50 µL DMB Lösung hinzufügen. Proben in dunklen 1,5 mL Röhrchen zum Schutz vor UV-Licht zu übertragen.
  2. Normen, lösen sich in 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, in Wasser) oder 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, in Wasser) in 10 µL 120 mM TFA Lösung in dunklen 1,5 mL-Tuben. 50 µL DMB Lösung hinzufügen.
  3. Brüten die Zellmembran Proben und die Standards für 1,5 h bei 56 ° C, vor Licht geschützt. Fügen Sie nach der Inkubation 4 µL 400 mM NaOH Lösung jede Probe, die Kennzeichnung Reaktion zu stoppen hinzu.

(8) HPLC-Analytik

Hinweis: Markierte Proben werden analysiert, auf einem HPLC-System, ausgestattet mit einer RP C18-Säule (110 Å, 3 µm Partikelgröße, 4.6 x 150 mm), ein Fluoreszenz-Detektor und Fraktionssammler. Die verwendeten Lösungsmittel sind Methanol, Acetonitril und Wasser. Stellen Sie sicher, alle Lösungsmittel vor den Messungen, Entgasen, fehlt der HPLC-Anlage eine interne Degasser.

  1. Die Temperatur der Spalte auf 40 ° C einstellen und konfigurieren den Fluoreszenz-Detektor mit 373 nm für Anregung und 448 nm bei Emission, beziehungsweise. Injizieren Sie 10 µL Probenvolumen zu und trennen Sie die Sonden für 50 min bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:8:86) als der Eluent. Für die Massenspektrometrie Analyse sammeln Sie die Gipfel von Interesse.
    Hinweis: Neu5Gc Eluat nach 6-8 min, Neu5Ac nach 9-12 min, Neu5Prop nach 17-23 min und Neu5But nach 38-44 min erwartet. Die fraktionierten Proben können mehrere Stunden bei 4 ° C, vor Licht geschützt gelagert werden.
  2. Nach jeder Probe wird gemessen, die Spalte für 7,5 min. bei 1,0 mL/min Durchflussmenge (≈ 1,5 Spalte Bände) mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:25:69) waschen und wieder equilibrate das System für 7,5 min bei 1,0 mL/min Durchflussmenge mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:8:86).
  3. Berechnen Sie für die Quantitative Analyse die Fläche unter der Kurve der Sialinsäure Säure-Gipfel mit der Betriebssoftware der jeweiligen HPLC-System22.
    Hinweis: Gewonnene Daten können die Neu5Ac oder den Neu5Gc-Standard und die gemessenen Proteinkonzentrationen in den cytosolischen Fraktionen (siehe Abschnitt 5.1) bezogen werden.

9. Massenspektrometrie Analyse der Sialinsäure Säure Monosaccharide

Hinweis: HPLC Retention Spitzen von Interesse können weitere massenspektrometrisch Flüssigchromatographie (LC) Elektrospray-Ionisation (ESI-MS), analysiert werden um zu überprüfen, die unnatürliche Sialinsäure Säure-Arten.

  1. Injizieren Sie für die Massenspektrometrie Analyse 20 µL gesammelten Probe in ein LC/Mass selektive Detektor (MSD) System mit 79,9 % Methanol, 20 % Isopropyl-Alkohol und 0,1 % Ameisensäure als Laufmittel, 0,5 mL/min Durchflussmenge, 4 kV Kapillare Spannung und Kapillare Temperatur 350 ° C 22 , 23.
  2. Wählen Sie in der Auswertungs-Software des jeweiligen LC/MSD-Systems den Gipfel des Interesses an der gesamten Ion Chromatogramm. Das Massenspektrum des gelöst Peak anzeigen Das positive Masse/Ladung-Verhältnis zwischen 300 und 700 anzeigen
    Hinweis: DMB Kennzeichnung von Sialinsäure Säuren führt zu einem Anstieg der Molekülmasse von 116,2 g/Mol. Die DMB-Label Sialinsäure Säure-Arten haben die folgenden molekularen Massen: DMB-Neu5Ac = 424,2 g/Mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/Mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/Mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol gemeinsamen Addukte sind Acetonitril, Natrium oder Isopropyl-Alkohol.

10. Western-Blot Analyse der Polysialic Säure in Kelly Neuroblastom-Zellen

  1. Vorbereitung der Zelle lysates
    1. Fügen Sie 1 mL Western-Blot Lyse Puffer auf die Zelle Pellets aus Schritt 3.3 und Vortex. Inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Vortex: alle 5 Minuten. Zentrifugieren Sie Proben für 1,5 h bei 20.000 x g und 4 ° C. Den Überstand enthält die Proteine aus lysierten Zellen zu sammeln.
    2. Die Konzentration des Proteins von der Protein-Fraktionen, z. B., der Bradford oder der BCA-Test zu bestimmen. Verdünnen Sie die Proben zu einer Proteinkonzentration von 1,5 µg/µL in Lyse Puffer.
    3. Die Proben für die SDS-PAGE durch Zugabe von 10 µL Laemmli Probenpuffer zu 90 µL Proteinfraktion (1,5 µg/µL) vorbereiten und Kochen der Probe für 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Verwenden Sie 8 % SDS-Acrylamid Gele mit 20-30 µL Taschen und 0,75 oder 1 mm Dicke. Führen Sie das Gel bei 25 mA für 2 h bei RT
    2. Entfernen Sie vorsichtig die Glasabdeckung aus dem Gel. Ausschneiden und den oberen Teil des Gels mit der Laden-Taschen zu verwerfen. Legen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (0,2 µm), zuvor eingeweicht in Western-Blot-Puffer. Übertragen Sie die Proteine auf Nitrozellulose entsprechend der Empfehlung des Systems (z. B. 250 mA für 1 h bei 4 ° C).
    3. Entfernen Sie die Nitrozellulose-Membran aus dem Blot System. Fleck Fleck mit Ponceau rot, die Proteine zu visualisieren. Übertragen der Nitrozellulose-Membran in eine Kunststoff-Kammer und 10 mL Lösung blockiert. 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.
    4. Dekantieren Sie die blockierende Lösung und fügen Sie monoklonalen Anti-PolySia 735 Antikörper (1 µg/mL) in PBS. Die Membran für 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie nach der Inkubation der Membran mindestens drei Mal für 5 min mit PBS.
    5. Fügen Sie polyklonale Anti-Maus IgG Sekundärantikörper (1 µg/mL) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder eine fluoreszierende Label mit PBS-Puffer gekoppelt. Die Membran für 1 h bei RT inkubieren Waschen Sie nach der Inkubation der Membran mindestens drei Mal für 5 min mit PBS.
    6. Übertragen Sie die Membran auf einen Teller mit einem entsprechenden Imager. Erkennen Sie das Signal entsprechend den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

HPLC-Chromatogramme von Leuchtstofflampen, die mit der Bezeichnung Neu5Ac und die Neu5Gc-Standards sind in Abbildung 2dargestellt. Verwendung der hierin beschriebenen Methode elutes DMB-Label Neu5Gc in der Regel zwischen 7-9 min Elution Zeit und DMB-Neu5Ac zwischen 10-12 min. Einige kleinere Gipfel in das Chromatogramm erscheinen in der Regel zwischen 2-6 min. Diese Spitzen sind nicht umgesetztes DMB und Reaktion Zwischenprodukte25.

Diskussion

Wenn die chemisch synthetisierten ManNAc Derivate, ManNProp und ManNBut per Massenspektrometrie analysiert werden, sollten nur die richtigen Masse Gipfel für beide Proben ermittelt werden. Daher können die Produkte davon ausgegangen, dass eine Reinheit von über 99 %. Kleine Mengen von Neu5Gc, die normalerweise nicht in menschlichen Zellen29gefunden wird, werden in den Membran-Fraktionen der lysierten Zellen erkannt. Dies geschieht wahrscheinlich durch einen Unfall-Weg, der Neu5Gc vom fötalen R...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken L. D. Nguyen für das Manuskript Korrektur und für fruchtbare Diskussionen. Darüber hinaus danken wir J. Dernedde und H. G. Nguyen für uns bereitet dem Videodreh helfen. Die meisten Szenen des Videos wurden in den Labors von R. Tauber erschossen. Wir danken auch das Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung, und uns freien Zugang zu ihren Massenspektrometrie-Anlage. RH wurde von der DFG (ProMoAge) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
CellsSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
75 ml tissue culture flasksGreiner690175
48-well platesCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Protein ladderFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau redRoth5938.2
Milk powderRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membraneMerck-MilliporeUFC500324
15 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plateSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubesSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lungSigma-AldrichA1153-10MGlyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chlorideSigma-Aldrich109614-250G
C18 RP columnPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochlorideSigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt SolutionPAN BiotechP04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
Formic acidSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solutionSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0%, in water
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MethanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acidSigma-AldrichG9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma-AldrichP7626-250MG
Propionyl chlorideSigma-AldrichP51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorlessEppendorf30120086
Sodium bisulfite solutionSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in water
Sodium chlorideSigma-Aldrich746398-500G-D
Sodium hydroxideSigma-Aldrich795429-500G-D
Sodium hydroxide solutionSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in water
Sodium methoxideSigma-Aldrich164992-5G
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris hydrochlorideSigma-AldrichT5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Silica Gel 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
ESI-MSD-SystemAgilent

Referenzen

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