Un método computacional para cuantificar la actividad circadiana mosca

Resumen

Se presenta un método para cuantificar las principales características temporales vistas en mosca los ritmos locomotores. La cuantificación se logra encajando actividad mosca con una forma de onda multi-paramétrico del modelo. Los parámetros del modelo describen la forma y el tamaño de la mañana y noche picos de actividad diaria.

Resumen

En la mayoría de los animales y plantas, relojes circadianos orquestan procesos conductuales y moleculares y sincronización en el ciclo diario de luz-oscuridad. Los mecanismos fundamentales que subyacen a este control temporal se estudian ampliamente con la mosca de la fruta Drosophila melanogaster como organismo modelo. En moscas, el reloj se estudia típicamente analizando grabación locomotor varios días. Tal grabación muestra un complejo patrón bimodal con dos picos de actividad: un pico de la mañana que sucede alrededor de amanecer y un pico de la tarde que ocurre al atardecer. Estos dos picos forman una forma de onda que es muy diferente de oscilaciones sinusoidales observado en los genes del reloj, que sugieren que mecanismos además el reloj tienen profundos efectos en la producción de los patrones observados en datos conductuales. Aquí proporcionan instrucciones sobre el uso de un método computacional desarrollado recientemente que matemáticamente describe patrones temporales en la actividad de la mosca. El método ajusta a los datos de actividad con una forma de onda de modelo que consta de cuatro términos exponenciales y nueve parámetros independientes que describen completamente la forma y el tamaño de la mañana y noche picos de actividad. Los parámetros extraídos pueden ayudar a elucidar los mecanismos cinéticos de sustratos subyacentes a los patrones de actividad bimodal comúnmente observados en los ritmos locomotores mosca.

Introducción

El reloj circadiano es un oscilador bioquímico endógeno con un período de aproximadamente 24 horas y es casi ubicuo en animales y plantas de^1,2. El reloj ayuda a sincronizar los procesos internos de un organismo y el comportamiento para el ciclo oscuro de luz externo. La estructura genética del reloj circadiano ha sido ampliamente estudiada desde la década de 1960 con la mosca de la fruta D. melanogaster. En este insecto, el núcleo del reloj circadiano consiste en cuatro proteínas: período, atemporal, reloj y ciclo. Estos componentes del núcleo junto con otras moléculas forman un bucle de retroalimentación que produce casi sinusoidales oscilaciones de reloj genes^3,4. El reloj circadiano en moscas es ampliamente estudiada usando grabaciones locomotoras varios días donde se detecte actividad mosca con un rayo infrarrojo solo cruzando la mitad de un tubo individual⁵. Una mosca típica grabación tiene un complejo patrón bimodal con dos picos bien distinguibles: punta de la mañana (M) que se inicia al final de la noche y tiene un máximo cuando se enciende; y pico de la tarde (E) que se inicia al final del día y tiene un máximo cuando las luces se apagan⁶. Curiosamente, la forma de tal grabación de comportamiento es muy diferente de las oscilaciones sinusoidales simples observadas a nivel molecular, lo que sugiere la acción de mecanismos adicionales que contribuyen a los patrones observados de temporales. Para entender mejor estos mecanismos ocultos, hemos desarrollado una herramienta computacional que proporciona una descripción cuantitativa de los patrones temporales.

En nuestro trabajo, los ritmos locomotores se definen en términos de forma de onda que imita el patrón de la mosca de la actividad. Desde simples ondas sinusoidales no puede utilizarse para modelar los cambios rítmicos observados en la actividad, hemos probado varias formas de señal para seleccionar la más simple que captura todas las características en las grabaciones. Comportamiento circadiano de la mosca de la fruta es controlada por la actividad de las neuronas reloj que a menudo tienen exponenciales patrones de activación y desactivación⁷. La dinámica exponencial y análisis visual de los datos nos motivaron a construir un modelo con términos exponenciales que consta de cuatro exponentes con nueve parámetros independientes y muy parecidas a la mosca actividad patrón⁸. Además de los datos del aparato locomotoras, también analizamos su espectro de energía. Espectro de actividad típica mosca muestra varios picos en armónicos T₀2 T₀3, etc., además el pico fundamental previsto en el período circadiano T₀. Según el teorema de Fourier, sólo una onda senoidal pura produce un solo pico en espectros de energía, mientras que las más complejas formas de onda muestran varios picos espectrales en armónicos del período primario (figura 1). Por lo tanto, dada el no-sinusoidal patrón temporal de actividad mosca⁸, matemáticamente se espera y no implica necesariamente la presencia de múltiples períodos de oscilación de un espectro de energía multi-pico de los datos. Lo importante es el espectro de energía de la onda modelo propuesto muestra picos en los armónicos de la época primaria, similar a las grabaciones locomotoras mosca, subrayando así la alta fidelidad con que nuestro modelo describe mosca datos tanto en tiempo como en frecuencia.

En resoluciones de tiempo de unos pocos minutos o menos, mosca actividad datos aparecen ruidos, lo que hace difícil extraer parámetros directamente los datos en bruto. Datos binning en intervalos más largos de tiempo pueden disminuir el nivel de ruido, pero pueden modificar los datos de maneras que pueden afectar la estimación de parámetros del modelo. Por lo tanto obtenemos los parámetros de espectros de potencia de las grabaciones, usando una expresión analítica para los espectros de energía esperados calculados a partir de la transformada de Fourier de la función modelo⁸ (véase la archivo adicional 1 de referencia⁸). Este enfoque de obtención de parámetros de los espectros de energía produce valores de parámetro exacto sin cualquier manipulación adicional, como binning o filtrado de los datos crudos de la actividad. Detalles matemáticos del modelo y las aplicaciones a los datos de tipo salvaje y mutantes se describen en la referencia⁸. El protocolo aquí presentado se centra en las instrucciones paso a paso para utilizar la herramienta computacional.

Protocolo

1. medición de volar locomoción usando Drosophila actividad Monitor (DAM)

Nota: para más detalles véase referencia ⁵.

1. Preparación individual volar tubos con el alimento en un extremo y el algodón en el otro. Al final con el alimento debe sellarse para evitar que los alimentos se sequen.
   1. Pone 5-6 g de comida de mosca en un vaso de precipitados de 50 mL. Corte los alimentos en trozos pequeños para que sea más fácil derretir lo
   2. Tubos de vidrio individuales 32 Conecte con una banda elástica.
   3. La comida en el vaso del derretimiento por calentamiento en un horno de microondas para 10-15 s. parar el microondas cada 5 s y agite con cuidado el vaso de precipitados para asegurar igual fusión de alimentos.
   4. Mientras que el alimento esté aún líquido, ponga los tubos individuales preparados en el vaso con los alimentos. Mover arriba y abajo los tubos por lo que igualmente están llenos.
   5. Permitir que el alimento se enfríe y solidifique para aproximadamente 1 h.
   6. Después de que el alimento es sólido, retirar los tubos con el alimento de la taza.
   7. Sellar el extremo que contiene el alimento utilizando cera. En primer lugar, limpiar cuidadosamente un tubo utilizando una toalla de papel, luego presione el tubo contra la cera. Visualmente Compruebe la calidad de la Junta y si es necesario, repetir la Junta otra vez.
   8. Cerrar el otro extremo del tubo con algodón, algodón permitirá mientras que mantener una mosca encerrada en el tubo de aire.
2. Colocar una sola mosca en cada tubo individual y colocar los tubos en la presa de.
Monitores de
3. lugar en una incubadora que mantiene la humedad y temperatura constante. Basado en el experimento, establecidas en las condiciones adecuadas de luz/oscuridad.
   1. Para experimentos de luz/oscuridad mantienen las moscas en el ciclo de luz/oscuridad para el experimento entero. No utilice el primer día de medición en el análisis.
   2. Para experimentos de oscuridad constante, primero mantener las moscas durante dos días en condiciones de luz/oscuridad de arrastre y la sincronización de los relojes y luego a la oscuridad constante. No utilice las mediciones desde el primer día de la oscuridad constante en el análisis.
4. Recoger por lo menos cuatro días de datos que pueden ser utilizados en el análisis.
   Nota: El sistema de la represa generará un único archivo con un registro de locomoción de los moscas en el monitor de.

2. Análisis de datos

1. Split el monitor salida de archivo en múltiples archivos de actividad única mosca, cada archivo debe ser una sola columna ' .txt ' archivo con una medición individual locomoción mosca.
2. Run ' ModelFitPS3.m ' función en una ventana de comandos de Matlab con los siguientes parámetros de entrada:
   1. para samplingrate, establecer el intervalo de tiempo de muestreo de datos en segundos. Por ejemplo, si la actividad se midió cada minuto, 60 como ingresar el samplingrate.
   2. Para bin_interval, establecer el intervalo de tiempo en minutos en que datos se clasifica para mejor visualización; el intervalo bin recomendado es 20-30 min.
   3. Tendencia, introduzca " 1 " si los datos muestran la tendencia de la línea de base y " 0 "; datos con tendencia a detrended primero instalando un polinomio de segundo orden y luego la sustracción de los datos.
3. En la ventana emergente Seleccione un archivo de la actividad de volar solo.
   Nota: La primera parcela es espectro de energía de datos y no la trama de la actividad familiar. Desde el espectro de energía trazada, determinar el período primario T ₀: o bien haga clic con el botón izquierdo del ratón en el pico circadiano, o con botón derecho del ratón en el segundo pico del armónico (alrededor de T ₀ / 2).
4. En la trama de datos abierta, compruebe si se visualizan bien la mañana y noche picos. Si no es así, cambie el valor de bin_interval haciendo clic derecho en cualquier lugar en el gráfico e introducir el nuevo valor de bin_interval en el cuadro de diálogo. El programa se vuelva a tomar los datos con el nuevo valor del intervalo. Para aceptar el valor de bin_interval, haz click en cualquier lugar en el gráfico.
5. El programa volver a dibujar los datos y mostrar los primeros cinco días de actividad. En esta trama, haga clic en el primer pico de M que se utilizarán en el análisis (a veces es necesario saltarse uno o dos días).
   Nota: El programa será volver a dibujar el gráfico a partir de la punta de la mañana escogido. Las líneas azul y roja mostrará la posición aproximada del pico E y siguiente pico del día M, respectivamente, basado en el período determinado en el paso 2.4.
6. En el mismo gráfico, elija un ajuste preliminar de los datos con el modelo de datos: haga clic en los siguientes puntos (en este orden; tenga en cuenta que se indicará la ubicación del clic con una estrella roja en la parte inferior): pico de (i) arriba de M; (ii) el final del pico M; (iii) Inicio del pico E; (iv) la parte superior del pico E; (v) final del pico E; (vi) la parte superior del pico M del día siguiente.
7. En cuenta que el programa ahora presenta el espectro de energía.
   Nota: El eje x se da ahora en la frecuencia.
   1. En la ventana abierta con el espectro de energía, escoger los puntos que se utilizarán para el montaje de la expresión analítica para el espectro de energía del modelo. El periodo detectado en el paso 2.4 está marcado con una línea roja. Para seleccionar puntos, primero determine aproximadamente el período primario, similar al paso 2.4. Luego usando la barra deslizante, afinar el período primario de valor para que la conexión señala (se indica con círculos rojos, aparecerá después de mover el control deslizante) están cerrados a valores máximos.
8. Después de la selección visual máximo, haga clic en " aceptar " y el programa ajusta a puntos seleccionados con la expresión analítica para el cálculo de los parámetros del modelo.
9. Tenga en cuenta que los parámetros y el error de ajuste espectral se guardan en el archivo " model_fit_parameters.txtŔ el programa además ahorrará 2 cifras con ajustes de los datos del aparato locomotoras y su espectro de energía.

Resultados

El método presentado aquí permite la cuantificación de las principales características en el patrón de locomoción mosca. La cuantificación se logra ajustando los datos de actividad con un modelo que consta de cuatro términos exponenciales:

El modelo tiene nueve parámetros independientes que desc...

Discusión

Este trabajo presenta las instrucciones para el uso de una herramienta computacional que proporciona una descripción cuantitativa del patrón de locomoción mosca. La herramienta ajusta a datos de locomoción con un modelo matemático que consta de cuatro términos exponenciales que juntos describen la forma y el tamaño de los picos de M y E. Los valores finales para los parámetros del modelo se obtienen del ajuste de los espectros de energía de los datos, donde el uso de los datos en bruto puede evitar efectos artef...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Measures fly locootion using single infrared beam
MatLab	Mathworks		Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(wild type)	Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period