Um método computacional para quantificar a atividade Circadian voar

Resumo

É apresentado um método para quantificar as principais características temporais vistas na moscas circadianos ritmos locomotoras. A quantificação é alcançada por encaixe atividade voar com uma forma de onda do modelo multi paramétrico. Os parâmetros do modelo descrevem a forma e o tamanho da manhã e noite picos de atividade diária.

Resumo

Na maioria dos animais e plantas, pulsos de disparo circadianos orquestram processos comportamentais e moleculares em sincronizá-los para o ciclo diário de claro-escuro. Mecanismos fundamentais subjacentes a este controle temporal são amplamente estudados usando a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um organismo modelo. Nas moscas, o relógio é tipicamente estudado analisando multiday gravação locomotor. Tal gravação mostra um complexo padrão bimodal com dois picos de atividade: um pico de manhã que acontece ao amanhecer e um pico de noite que acontece ao redor de Crepúsculo. Estes dois picos formam uma forma de onda que é muito diferente de sinusoidais oscilações observada nos genes do relógio, sugerindo que os mecanismos além do relógio têm efeitos profundos em produzir os padrões observados em dados comportamentais. Aqui nós fornecemos instruções sobre o uso de um método computacional desenvolvido recentemente que descreve matematicamente padrões temporais na atividade de voar. O método combina dados de atividade com uma forma de onda de modelo que consiste de quatro termos exponenciais e nove parâmetros independentes que descrevem completamente a forma e o tamanho da manhã e noite picos de atividade. Os parâmetros extraídos podem ajudar a elucidar os mecanismos cinéticos de substratos que sustentam os padrões de atividade bimodal comumente observados em ritmos locomotoras voar.

Introdução

O relógio circadiano é um oscilador bioquímico endógeno com um período de aproximadamente 24 horas e é quase onipresente nos animais e plantas^1,2. O relógio ajuda a sincronizar processos internos do organismo e o comportamento para o ciclo escuro luz externo. A estrutura genética do relógio circadiano tem sido amplamente estudada desde a década de 1960 usando a mosca de fruta, d. melanogaster. Neste inseto, o núcleo do relógio circadiano consiste de quatro proteínas: período, TIMELESS, CLOCK e ciclo. Estes componentes de núcleo juntamente com outras moléculas formam um laço de realimentação que produz quase sinusoidais oscilações de relógio genes^3,4. O relógio circadiano em moscas é amplamente estudado usando multiday locomotoras gravações onde forem detectadas atividades de voar com um único feixe infravermelho cruzando no meio de um tubo individual⁵. Uma mosca típica de gravação tem um complexo padrão bimodal com dois picos bem distinguíveis: pico de manhã (M) que começa no final da noite e tem um máximo quando liga as luzes; e o pico de noite (E) que começa no final do dia e tem um máximo quando luzes desliguem⁶. Curiosamente, a forma de tal gravação comportamental é muito diferente de simples sinusoidais oscilações observadas a nível molecular, sugerindo a ação de mecanismos adicionais, contribuindo para os padrões observados temporais. Para entender melhor estes mecanismos ocultos, nós desenvolvemos uma ferramenta computacional que fornece uma descrição quantitativa dos padrões temporais.

Em nosso trabalho, ritmos de locomoção são definidos em termos de uma forma de onda que imita o padrão de atividade de voar. Desde simples ondas senoidais não pode ser usadas para modelar as mudanças observadas rítmicas em atividade, testamos várias formas de sinal para selecionar o mais simples que captura todas as características salientes vistas nas gravações. Mosca da fruta circadian comportamento é controlada pela atividade de neurônios de relógio que muitas vezes têm padrões exponenciais de ativação e desativação de⁷. A dinâmica exponencial e a análise visual dos dados motivaram-na construir um modelo com termos exponenciais, consistindo de quatro expoentes com nove parâmetros independentes e muito parecidas com o padrão de atividade voar⁸. Além dos dados do aparelho locomotoras, analisamos também seu espectro de energia. Espectro de atividade típica de mosca mostra vários picos em harmônicos T₀2, T₀3, etc., além do esperado pico fundamental no período circadiano T₀. De acordo com o teorema de Fourier, apenas uma onda senoidal pura produz um único pico no espectro de energia, enquanto as mais complexas formas de onda mostram vários picos espectrais em harmônicos do período primário (Figura 1). Portanto, tendo em conta o padrão temporal não-sinusoidal em atividade voar⁸, um espectro de potência multi-pico dos dados matematicamente é esperado e não implica necessariamente a presença de vários períodos de oscilação. Importante, o espectro de potência da onda modelo proposto também mostra picos em todos os harmônicos do período primário, semelhante às gravações locomotoras voar, reforçando assim a alta fidelidade com a qual nosso modelo descreve dados voar no tempo e na frequência.

Em resoluções de tempo de alguns minutos ou menos, mosca atividade dados aparecem barulhentos, tornando-se difícil extrair parâmetros directamente a partir dos dados brutos. Binning dados em intervalos de tempo mais longos podem diminuir o nível de ruído, mas podem alterar os dados de maneiras que podem afetar a estimativa dos parâmetros do modelo. Portanto, obtemos os parâmetros de espectros de potência das gravações, usando uma expressão analítica para os espectros de potência esperado calculados a partir da transformada de Fourier do modelo função⁸ (veja arquivo adicional 1 de referência⁸). Esta abordagem de obter parâmetros de espectros de potência produz valores de parâmetros precisos sem quaisquer manipulações adicionais, tais como binning ou filtragem, dos dados brutos de atividade. Detalhes matemáticos do modelo e dos aplicativos de dados tipo selvagem e mutantes são descritos na referência⁸. O protocolo apresentado aqui centra-se sobre as instruções passo a passo para usar a ferramenta computacional.

Protocolo

1. medindo voar locomoção usando Drosophila atividade Monitor (DAM)

Nota: para mais detalhes veja referência ⁵.

1. Preparar individual voar tubos com comida em uma extremidade e algodão do outro. Final com alimentos deve ser selado para evitar que os alimentos sequem.
   1. Coloque 5-6 g de comida de mosca num copo de 50 mL. Corte os alimentos em pedaços pequenos, para que seja fácil de derretê-la
   2. Tubos de vidro individuais 32 conectar com um elástico.
   3. Derreter o alimento no copo por aquecimento em um forno de microondas por 10-15 s. pare o microondas cada 5 s e agitar cuidadosamente o copo para garantir fusão igual de alimentos.
   4. Enquanto a comida é ainda líquida, colocar os tubos individuais preparados no copo com comida. Mover os tubos acima e para baixo assim que eles são igualmente preenchidos.
   5. Permitir a comida arrefecer e solidificar por aproximadamente 1 h.
   6. Depois que o alimento é sólido, retirar os tubos com a comida do copo.
   7. Selo final contendo a comida usando cera. Primeiro, cuidadosamente limpo um tubo usando uma toalha de papel, em seguida, pressione o tubo contra a cera. Visualmente a verificar a qualidade do selo e se necessário, repetir a selagem novamente.
   8. Fecha a outra extremidade do tubo com algodão, algodão permitirá a passar enquanto manter uma mosca bloqueado no tubo de ar.
2. Coloque uma única mosca em cada tubo individual e coloque os tubos na barragem.
3. Lugar de monitores em uma incubadora que mantém a umidade e a temperatura constante. Com base na experiência, defina as condições apropriadas de claro/escuro como segue.
   1. Para experimentos de claro/escuro espantar as moscas em ciclo claro/escuro para todo o experimento. Não utilize o primeiro dia de medições na análise.
   2. Para experimentos de escuridão constante, primeiro, manter as moscas durante dois dias em condições de luz/escuro de arrastamento e sincronização dos pulsos de disparo e alterne para escuridão constante. Não utilize as medições desde o primeiro dia de escuridão constante na análise.
4. Coletar pelo menos quatro dias de dados que podem ser usados na análise.
   Nota: O sistema de DAM imprimirá um único arquivo com uma gravação de locomoção de todas as moscas no monitor.

2. Análise de dados

1. dividir arquivo de saída do monitor em vários arquivos de única atividade mosca; cada arquivo deve ser uma única coluna '. txt ' arquivo com uma medição individual de locomoção mosca.
2. Run ' ModelFitPS3.m ' função em uma janela de comando do Matlab com os seguintes parâmetros de entrada:
   1. para Taxa amostragem, definir o intervalo de tempo de amostragem de dados em segundos. Por exemplo, se a atividade foi medida a cada minuto, digite 60 como o Taxa amostragem.
   2. Para bin_interval, defina o intervalo de tempo em minutos, para que dados vão ser guardados para melhor visualização; o intervalo recomendado bin é 20-30 min.
   3. Para a tendência, digite " 1 " se os dados mostram tendência de base e " 0 " contrário; dados com tendência vão ser detrended primeiro pelo encaixe de um polinômio de segunda ordem e em seguida subtraindo-lo a partir dos dados.
3. Na janela pop-up, selecione um arquivo de única atividade mosca.
   Nota: A primeira parcela é espectro de potência de dados e não o enredo de atividade familiar. A partir do espectro de potência plotados, determinar o período primário T ₀: clique com o botão esquerdo do mouse sobre o pico circadiano, ou com o botão direito do mouse sobre o segundo pico harmônico (em torno de T ₀ / 2).
4. Sobre a trama de dados aberto, verifique se a manhã e a noite picos são bem visualizados. Se não, altere o valor de bin_interval pelo botão direito do mouse em qualquer lugar no gráfico e introduzir o novo valor de bin_interval na caixa de diálogo. O programa irá redesenhar os dados com o novo valor do intervalo. Para aceitar o valor de bin_interval, clique esquerdo em qualquer lugar no gráfico.
5. o programa irá redesenhar os dados novamente e mostrar os primeiros cinco dias de atividade. Sobre esta trama, clique sobre o primeiro pico de M que será usado na análise (às vezes é preciso pular um ou dois dias).
   Nota: O programa irá redesenhar o gráfico a partir do pico de manhã peguei. As linhas azuis e vermelhas mostrará a posição aproximada do pico E e próximo pico dia M, respectivamente, com base no período determinado na etapa 2.4.
6. No mesmo gráfico, escolha dados para um ajuste preliminar dos dados com o modelo: clique sobre os pontos seguintes (nesta ordem; Observe que o local do clique será indicado com uma estrela vermelha na parte inferior): pico de (i) topo de M; (ii) fim do pico M; (iii) início do pico E; (iv) o topo do pico E; (v) fim do pico E; (vi) topo do pico do dia seguinte, M.
7. Observe que o programa agora apresenta o espectro de poder.
   Nota: O eixo x é dada agora na frequência.
   1. Na janela aberta com o espectro de potência, escolher pontos que serão usados para a montagem da expressão analítica para o espectro de potência do modelo. O período detectado na etapa 2.4 é marcado com uma linha vermelha. Para escolher os pontos de fixação, primeiro determine aproximadamente o período primário, semelhante ao passo 2.4. Em seguida, usando o controle deslizante, ajuste o período primário valor para que o encaixe pontos (mostrada com círculos vermelhos, aparecerá depois de mover o controle deslizante) estão fechados para valores de pico.
8. Após a seleção de pico visual, clique " aceitar " e o programa vai caber pontos selecionados com a expressão analítica para calcular os parâmetros modelo.
9. Observe que os parâmetros e o erro de forma espectral são salvas no arquivo " model_fit_parameters.txtŔ o programa salvará adicionalmente 2 figuras com ataques de dados os aparelho locomotoras e seu espectro de energia.

Resultados

O método apresentado aqui permite a quantificação das principais características no padrão de locomoção voar. A quantificação é alcançada por encaixe os dados de atividade com um modelo que consiste de quatro termos exponenciais:

O modelo possui nove parâmetros independentes que descrevem o p...

Discussão

Este trabalho apresenta as instruções para o uso de uma ferramenta computacional que fornece uma descrição quantitativa do padrão de locomoção voar. A ferramenta combina dados de locomoção com um modelo matemático que consiste de quatro termos exponenciais que juntos, descrevem a forma e o tamanho dos picos M e E. Os valores finais para os parâmetros do modelo são obtidos de encaixe os espectros de potência dos dados, onde o uso dos dados brutos pode evitar efeitos artefactual que dados binning ou filtragem ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Measures fly locootion using single infrared beam
MatLab	Mathworks		Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(wild type)	Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period