Un metodo di calcolo per quantificare le attività circadiana volare

Riepilogo

Viene presentato un metodo per quantificare le caratteristiche principali di temporale vista in volare ritmi circadiani dell'apparato locomotore. La quantificazione avviene inserendo attività di volare con una forma d'onda modello multi-parametrico. I parametri del modello descrivono la forma e la dimensione della mattina e sera picchi di attività quotidiana.

Abstract

Nella maggior parte dei animali e piante, orologi circadiani orchestrano processi comportamentali e molecolari e sincronizzarli con il ciclo giornaliero di chiaro-scuro. Meccanismi fondamentali che sono alla base di questo controllo temporale sono ampiamente studiati usando il Mosca di frutta melanogaster della drosofila come organismo modello. In mosche, l'orologio è in genere studiato analizzando multiday registrazione dell'apparato locomotore. Una registrazione di tale Mostra un complesso modello bimodale con due picchi di attività: un picco di mattina che accade intorno all'alba con un picco di sera che accade intorno al tramonto. Questi due picchi di forma insieme una forma d'onda che è molto diversa da oscillazioni sinusoidali osservata nei geni dell'orologio, suggerendo che i meccanismi oltre l'orologio hanno effetti profondi nella produzione i modelli osservati in dati comportamentali. Qui forniamo le istruzioni sull'utilizzo di un metodo computazionale sviluppato di recente che descrive matematicamente schemi temporali nell'attività di volare. Il metodo si inserisce dati di attività con una forma d'onda modello che consiste di quattro termini esponenziali e nove parametri indipendenti che descrivono completamente la forma e la dimensione della mattina e sera picchi di attività. I parametri estratti possono contribuire a delucidare i meccanismi cinetici di substrati che sottendono i modelli di attività bimodale comunemente osservata nei ritmi locomotore volare.

Introduzione

L'orologio circadiano è un oscillatore endogeno biochimico con un periodo di circa 24 ore ed è quasi onnipresente in animali e piante di^1,2. L'orologio consente di sincronizzare i processi interni e il comportamento per il ciclo di buio luce esterno di un organismo. La struttura genetica dell'orologio circadiano è stato ampiamente studiata dal 1960 utilizzando il moscerino della frutta, d. melanogaster. In questo insetto, il nucleo dell'orologio circadiano è costituito da quattro proteine: periodo, TIMELESS, orologio e ciclo. Questi componenti di base insieme ad altre molecole formano un ciclo di feedback che produce quasi sinusoidale oscillazioni di geni orologio^3,4. L'orologio circadiano in mosche è ampiamente studiato utilizzando registrazioni locomotore multiday dove volare l'attività viene rilevata con un singolo raggio infrarosso attraversando la metà di un singolo tubo di⁵. Una Mosca tipica registrazione ha un complesso modello bimodale con due picchi ben distinguibili: picco di mattina (M) che inizia alla fine della notte e ha un massimo quando le luci si accendono; e picco di sera (E) che inizia alla fine della giornata e ha un massimo quando le luci sono spente⁶. È interessante notare che, la forma di tale registrazione del comportamento è molto diversa dalle oscillazioni sinusoidali semplice osservate a livello molecolare, suggerendo l'azione di meccanismi aggiuntivi che contribuiscono ai pattern temporale osservato. Per comprendere meglio questi meccanismi nascosti, abbiamo sviluppato uno strumento computazionale che fornisce una descrizione quantitativa degli schemi temporali.

Nel nostro lavoro, ritmi locomotore sono definiti in termini di una forma d'onda che imita il modello di attività di volare. Poiché onde sinusoidali semplice non può essere utilizzate per modellare i cambiamenti ritmici osservati nell'attività, abbiamo testato varie forme di segnale per selezionare quello più semplice che cattura tutte le caratteristiche salienti vista nelle registrazioni. Mosca della frutta circadiano comportamento è controllato dall'attività dei neuroni di orologio che spesso hanno modelli esponenziali di attivazione e disattivazione⁷. La dinamica esponenziale e l'analisi visiva dei dati ci ha motivato a costruire un modello con termini esponenziali che consiste di quattro esponenti con nove parametri indipendenti e molto somiglianti l'attività volare modello⁸. Oltre ai dati dell'apparato locomotore, analizziamo anche il suo spettro di potenza. Spettro di attività tipica di volare Mostra picchi multipli alle armoniche T₀2, T,₀, 3, ecc., oltre il picco fondamentale previsto presso il periodo circadiano T₀. Secondo il teorema di Fourier, solo un'onda sinusoidale pura produce un singolo picco negli spettri di potenza, mentre più complesse forme d'onda mostrano picchi spettrali più alle armoniche del periodo primario (Figura 1). Pertanto, dato il modello temporale non sinusoidale in attività volare⁸, uno spettro di potenza multi-picco dei dati è matematicamente previsto e non implica necessariamente la presenza di più periodi di oscillazione. D'importanza, lo spettro di potenza della forma d'onda di modello proposto Mostra anche picchi presso tutte le armoniche del periodo primario, simile alle registrazioni locomotore volare, sottolineando così l'alta fedeltà con cui il nostro modello descrive dati volare nel tempo e in frequenza.

A risoluzioni di tempo di pochi minuti o meno, volare attività dati appare rumorosi, rendendo difficile per estrarre i parametri direttamente dai dati grezzi. Binning dati in intervalli di tempo più lungo possono diminuire il livello di rumore, ma, possono modificare i dati in modi che possono influenzare la stima dei parametri del modello. Otteniamo quindi i parametri da spettri di potenza delle registrazioni, utilizzando un'espressione analitica per gli spettri di potenza previsto calcolati dalla trasformata di Fourier della funzione modello⁸ (Vedi ulteriore File 1 di riferimento⁸). Questo approccio di ottenere parametri dagli spettri di potenza produce i valori dei parametri precisi senza qualsiasi ulteriori manipolazioni, come binning o filtrare, i dati di attività crudo. Dettagli matematici del modello e delle applicazioni ai dati wild-type e mutanti sono descritti in riferimento⁸. Il protocollo presentato qui si concentra sulle istruzioni dettagliate per utilizzare lo strumento computazionale.

Protocollo

1. misurazione volare locomozione utilizzando Drosophila attività Monitor (diga)

Nota: per maggiori dettagli vedi riferimento ⁵.

1. Preparare singoli tubi con cibo per volare su un'estremità e cotone da altro. Alla fine con il cibo dovrebbe essere sigillata per evitare il cibo si secchi.
   1. Mettere 5-6 g di alimento in un becher da mL 50. Tagliare il cibo in piccoli pezzi in modo che è più facile a sciogliersi it.
   2. 32 collegare tubi di vetro singolo con un elastico.
   3. Sciogliere il cibo nel becher di riscaldamento nel forno a microonde per 10-15 fermata s. forno a microonde ogni 5 s e agitare accuratamente il becher per garantire parità di fusione di cibo.
   4. Mentre il cibo è ancora liquido, mettere i tubi singoli preparati nel becher con il cibo. Spostare su e giù i tubi così sono altrettanto pieni.
   5. Consenti il cibo per raffreddare e solidificare per circa 1 h.
   6. Dopo il cibo è solida, togliere le provette con il cibo dal becher.
   7. Sigillare l'estremità contenente il cibo utilizzando cera. In primo luogo, rimuovere attentamente un filmato utilizzando un tovagliolo di carta, quindi premere il tubo contro la cera. Visivamente verificare la qualità del sigillo e se necessario, ripetere la tenuta ancora.
   8. Chiudere l'altra estremità del tubo con cotone; cotone permetterà aria di passare attraverso mentre mantenendo una Mosca bloccato nel tubo.
2. Inserire un singolo fly in ogni singolo tubo e inserire i tubi nella diga.
Monitor
3. posto in un'incubatrice che mantiene l'umidità e temperatura costante. Basato sull'esperimento, impostare come segue le giuste condizioni di luce/buio.
   1. Per esperimenti di chiaro/scuro tenere le mosche nel ciclo luce/buio per l'intero esperimento. Non utilizzare il primo giorno delle misurazioni nell'analisi.
   2. Per gli esperimenti di buio costante, in primo luogo tenere le mosche per due giorni in condizioni di luce/buio per la sincronizzazione degli orologi e trascinamento e quindi passare alla oscurità costante. Non utilizzare le misurazioni dal primo giorno di buio costante nell'analisi.
4. Raccogliere almeno quattro giorni di dati che possono essere utilizzati nell'analisi.
   Nota: Il sistema DAM emetterà un singolo file con una registrazione di locomozione di tutte le mosche nel monitor.

2. Analisi dei dati

1. Split monitor file di output in più file di singola attività volare; ogni file deve essere una singola colonna '. txt ' file con una misurazione individuale volare locomozione.
2. Run ' ModelFitPS3.m ' funzione in una finestra di comando di Matlab con i seguenti parametri di input:
   1. per samplingrate, impostare l'intervallo di tempo di campionamento dei dati in pochi secondi. Ad esempio, se l'attività è stata misurata ogni minuto, immettere 60 come il samplingrate.
   2. Per bin_interval, impostare l'intervallo di tempo in minuti al quale i dati verranno cestinati per una migliore visualizzazione; l'intervallo consigliato bin è 20-30 min
   3. Per la tendenza, immettere " 1 " se i dati mostrano tendenza iniziale e " 0 " altrimenti; dati con tendenza saranno essere detrended prima di montare un polinomio di secondo ordine e quindi sottraendo i dati.
3. Finestra popup nella quale selezionare un file di singola attività volare.
   Nota: Il primo appezzamento è lo spettro di potenza di dati e non la trama di attività familiare. Dallo spettro della potenza tracciati, determinare il principale periodo T ₀: fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco circadiano, o con il pulsante destro del mouse sulla cima della seconda armonica (intorno T ₀ / 2).
4. Sulla trama di dati aperto, controllare se la mattina e sera cime sono ben visualizzati. In caso contrario, modificare il valore di bin_interval facendo clic destro in un punto qualsiasi del grafico e inserendo il nuovo valore di bin_interval nella finestra di dialogo. Il programma verrà aggiornate i dati con il nuovo valore dell'intervallo. Per accettare il valore di bin_interval, a sinistra fare clic sul grafico.
5. Il programma sarà ridisegnare nuovamente i dati e Visualizza i primi cinque giorni di attività. Su questo terreno, fare clic sul primo picco M che verrà utilizzato nell'analisi (a volte è necessario saltare uno o due giorni).
   Nota: Il programma verrà ridisegnare il grafico a partire dal picco mattina raccolti. Le linee blue e rosse mostrerà la posizione approssimativa della E con successivo giorno M picco, rispettivamente, basato sul periodo determinato nel passaggio 2.4.
6. Sullo stesso grafico, scegliere dati per una vestibilità preliminare dei dati con il modello: fare clic sui seguenti punti (in questo ordine; si noti che la posizione di scatto sarà indicata con una stella rossa sul fondo): picco (i) Top di M; (ii) fine del picco M; (iii) inizio del picco E; (iv) la cima del picco E; (v) fine del picco E; (vi) la cima del picco M del giorno successivo.
7. Si noti che il programma presenta ora lo spettro di potenza.
   Nota: L'asse x è ora dato in frequenza.
   1. Nella finestra aperta con lo spettro di potenza, selezionare punti che verranno utilizzati per il montaggio l'espressione analitica per lo spettro di potenza del modello. Il periodo rilevato nel passaggio 2.4 è segnato con una linea rossa. Per selezionare punti di raccordo, innanzitutto determinare approssimativamente il periodo primario, simile al punto 2.4. Quindi utilizzando il dispositivo di scorrimento, ritocca il periodo primario valore affinché il raccordo punti (indicati con cerchi rossi, apparirà dopo aver spostato il cursore) sono chiusi per i valori di picco.
8. Dopo la selezione di picco visual, fare clic su " Accept " e il programma adatterà punti selezionati con l'espressione analitica per calcolare i parametri di modello.
9. Si noti che i parametri e l'errore di forma spettrale sono salvati nel file " model_fit_parameters.txtŔ il programma salverà inoltre 2 figure con accoppiamenti dei dati dell'apparato locomotore e il suo spettro di potenza.

Risultati

Il metodo presentato qui permette la quantificazione delle caratteristiche principali nel modello di locomozione volare. La quantificazione avviene inserendo i dati di attività con un modello che consiste di quattro termini esponenziali:

Il modello dispone di nove parametri indipendenti che descrivono i...

Discussione

Questo lavoro presenta le istruzioni per l'utilizzo di uno strumento computazionale che fornisce una descrizione quantitativa del pattern di locomozione volare. Lo strumento si inserisce dati di locomozione con un modello matematico che consiste di quattro termini esponenziali che descrivono la forma e le dimensioni delle cime M ed E. I valori finali per i parametri di modello sono ottenuti da montaggio gli spettri di potenza dei dati, dove l'uso dei dati grezzi può evitare effetti artefactual che dati binning o filtrag...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Measures fly locootion using single infrared beam
MatLab	Mathworks		Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(wild type)	Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period