Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

Resumen

Los queratinocitos epidérmicos forman una barrera cutánea funcional y se sitúan en la línea de frente de la defensa del huésped contra insultos ambientales externos. Aquí se describen métodos de aislamiento y cultivo primario de queratinocitos epidérmicos de piel de ratón neonatal y adulto, e inducción de diferenciación terminal y respuesta inflamatoria desencadenada por UVB a partir de queratinocitos.

Resumen

El queratinocito (KC) es el tipo celular predominante en la epidermis, la capa más externa de la piel. Los KC epidérmicos juegan un papel crítico en la provisión de la defensa de la piel formando una barrera cutánea intacta frente a insultos medioambientales, tales como irradiación con UVB o patógenos, y también iniciando una respuesta inflamatoria sobre dichos insultos. Aquí se describen métodos para aislar KCs de la piel del ratón neonatal y de la piel de la cola de ratón de adultos. También describimos las condiciones de cultivo utilizando suplementos de crecimiento definidos (dGS) en comparación con el suero bovino fetal chelexed (cFBS). Funcionalmente, mostramos que los KC neonatales y adultos son altamente sensibles a la alta diferenciación terminal inducida por calcio, a la formación de juntas estrechas ya la estratificación. Además, los KC adultos cultivados son susceptibles a la muerte celular desencadenada por UVB y pueden liberar grandes cantidades de TNF tras la irradiación con UVB. En conjunto, los métodos descritos aquí serán útiles para los investigadores para la configuración del modelo in vitroS para estudiar la biología epidérmica en el ratón neonatal y / o en el ratón adulto.

Introducción

La piel es el órgano más grande del cuerpo con la epidermis como la capa externa más. La epidermis juega un papel crítico en la formación de una barrera epidérmica intacta para separar el cuerpo del medio ambiente y, por lo tanto, previene la pérdida de agua y protege contra insultos medioambientales, como alergenos, patógenos y exposición a UVB. La epidermis se desarrolla a partir de una sola capa de queratinocitos basales no diferenciados (KCs) en un epitelio estratificado multicapa que consiste en una capa basal, seguida de una capa espinosa, capa granular y estrato córneo. Los KCs basales, que consisten en células madre epidérmicas y células que amplifican el tránsito, son proliferativos e indiferenciados. A medida que los KC basales abandonan el ciclo celular, las células se comprometen con la diferenciación y migran gradualmente hacia la superficie de la epidermis, acompañadas por la maduración de las uniones célula-célula y la formación de una barrera de permeabilidad epidérmica (EPB). Los KCs en la capa espinosa expresan diferenciación tempranaMarcadores de iones tales como queratina 10 (K10); A medida que los KC migran a la capa granular, las células expresan marcadores de diferenciación tardía tales como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). En el estrato córneo, los KCs se convierten en corneocitos terminalmente diferenciados, los cuales son finalmente eliminados a través de la descamación a medida que las nuevas células los reemplazan.

El calcio es considerado el agente más fisiológico en la epidermis y desencadena la diferenciación in vitro e in vivo de una manera similar. En la epidermis de piel normal, los iones de calcio forman un "gradiente de concentración" característico, aumentando su concentración hacia la superficie de la piel ^{1 , 2 , 3} . La concentración de calcio se eleva desde niveles bajos en las subcapas más bajas (capas basales y espinosas) hasta un pico en la capa granular superior y luego cae a niveles insignificantes en la capa más superficial (estrato córneo). El gradiente de calcio también se desarrolla de forma coincidente con la aparición de una barrera de permeabilidad de componentes, lo que apoya que la señalización del calcio juega un papel crítico de la diferenciación de KC. In vitro , el bajo contenido de calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferación de KC basales como una monocapa, mientras que el alto contenido de calcio (> 0,1 mM) induce un compromiso rápido e irreversible de las células a la diferenciación terminal como lo demuestra la formación e inducción de juntas estrechas De LOR e INV sobre el tratamiento de alto calcio a los KC basales ^{4 , 5} .

Además de la formación de barreras, los KC epidérmicos son también un componente importante del sistema inmune innato de la piel. En respuesta a patógenos o patrones moleculares asociados a daños (DAMPs) liberados por irradiación UVB o lesión, los KC pueden producir grandes cantidades de citoquinas inflamatorias, tales como TNFα, IL6 e IFNβ, lo que conduce a la activación del sistema inmune> 6 ^{, 7 , 8 , 9} . Aunque la señalización inflamatoria adecuada de KCs se requiere para el aclaramiento de patógenos, la respuesta inflamatoria no controlada puede desencadenar el desarrollo de enfermedades de la piel auto-inflamatorias, como la psoriasis y la rosácea [ ^{6 , 8]} .

En general, KC juegan un papel vital en el mantenimiento de la barrera de la piel intacta y el inicio de una respuesta inmune en la invasión de patógenos o insultos medioambientales. Por lo tanto, el cultivo primario de KCs epidérmicos es una técnica útil para estudiar la biología epitelial, la diferenciación de KC, así como las respuestas inmunes innatas estimuladas por KC. El aislamiento y cultivo de KCs epidérmicas de ratón primario puede ser un proceso desafiante debido a la susceptibilidad de KC y sensibilidad a diversos estimulantes externos. Aquí describimos un método para aislar y cultivar KC de piel de ratón neonatal oPiel de la cola del ratón adulto. Para el aislamiento adulto de KC, no usamos piel dorsal de ratón porque aislar cantidades suficientes de KC viables de este tejido puede ser difícil por las siguientes razones: Primero, la piel dorsal adulta en la fase de reposo del ciclo del cabello (telógeno) consiste en una Con sólo 1-2 capas de células, lo que conduce a un rendimiento celular bajo y la separación ineficiente de la epidermis de la dermis, que es el paso crítico para el aislamiento de KC con éxito. En segundo lugar, la alta densidad del folículo piloso que está presente en la piel dorsal adulta contribuye a la dificultad de separar la epidermis de la dermis. En cambio, usamos rutinariamente la piel de la cola como la fuente para KCs de ratón adulto ya que este epitelio es más grueso con 3-5 capas de KCs epidérmicos. También tiene una menor densidad de folículos pilosos, que no interfiere con la separación epidérmica, permitiendo así el aislamiento de KC de cualquier cola de cola de ratón adulto independientemente de la edad y la etapa de ciclo del cabello del ratón. El neona aisladoTal KCs se sembraron a las placas de cultivo recubiertas de gelatina, mientras que los platos recubiertos de colágeno se utilizan para sembrar KCs adultos aislados debido a la capacidad disminuida de las células adultas para adherirse en comparación con sus contrapartes neonatales. Para cultivar KCs de ratón, el medio basal de calcio bajo se complementa con dGS, que contiene factor de crecimiento epidérmico (EGF), transferrina bovina, factor de crecimiento insulina-likec1 (IGF1), prostaglandina E2 (PGE2), seroalbúmina bovina (BSA) e hidrocortisona. Entre 2-4 dıas después de la plaqueta inicial, la mayorıa de los KC diferenciados pueden ser lavados durante los cambios diarios de medio, y las restantes células adherentes muestran una morfologıa tıpica de adoquın ⁴ , proliferan y no expresan el marcador de diferenciación temprana K10.

Protocolo

Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCSD.

1. Aislamiento y cultivo de KC primarios de la piel neonatal

1. Sacrificar el día post-natal 0-2 neonatos de la cepa C57B / 6 wildtype ratón por decapitación con tijeras. Cortar las extremidades justo por encima de las articulaciones de la muñeca y el tobillo, luego cortar la cola por completo, dejando un pequeño agujero.
2. Para despegar la piel entera, primero inserte tijeras afiladas a través del agujero en la cola y corte la piel a lo largo de la línea media dorsal del cuerpo a la abertura en el cuello. A continuación, utilice una pinza para agarrar el cuerpo expuesto y las otras pinzas para agarrar la piel, y suavemente pelar toda la piel del cuerpo y sobre los tocones de las piernas con un movimiento continuo.
   1. Pele fuera de la piel como una pieza intacta y tenga cuidado de no romper la piel en pedazos ya que esto dará lugar a la pérdida de células durante el paso dispase.
3. Enjuague la piel pelada con 15 mL de PBS estéril en una placa de Petri de 10 cm, luego coloque la piel de cada cachorro en un tubo de 2 mL lleno con tampón de digestión de dispase que contiene 4 mg / mL de medio de crecimiento KC (Medio basal KC tiene CaCl _ { ₂ } 0,06 mM, dG, y antibióticos / antimicóticos).
   NOTA: Se pueden combinar múltiples aislamientos de piel y se pueden incubar en un tubo de 15 mL (hasta 5 pieles por tubo) que contenga 12 mL de solución dispasa. Incubar el tubo de la piel durante la noche en un refrigerador de 4 ° C en un rotador.
   1. Asegúrese de que la piel no se pliega en el tubo, ya que esto dará como resultado una exposición insuficiente de la región plegada a la solución dispasa.
4. Al día siguiente (después de 12-18 h en dispase), transfiera la piel junto con la disolución de dispase en una placa de Petri. Transferir cada pieza de tejido a una nueva placa de Petri con 15 ml de PBS estéril para lavar el exceso de dispase.
5. Usando dos pares de fórceps, agarre la piel de PBS,Levantar la piel, y transferir a una nueva placa de Petri con el lado epidérmico hacia abajo y la dermis hacia arriba. Cuidadosamente estirar los pliegues de la piel para que esté completamente extendido en la placa de Petri.
6. Coloque 500 μl de una solución de digestión basada en tripsina para cada piel en una nueva placa de Petri. Usando fórceps, levante lentamente la dermis hacia arriba y lejos de la epidermis, mientras mantiene la epidermis hacia abajo. Deseche la dermis como material biológico peligroso. Transferir la epidermis separada y flotar en cada gota de solución de tripsina con la capa basal hacia abajo.
   1. Si la epidermis se pliega sobre la solución de tripsina, retire los pliegues usando fórceps para asegurar una digestión eficiente de los KC basales del epitelio.
7. Incubar la piel en una placa de Petri en solución de tripsina a temperatura ambiente (con la tapa cubierta) en un agitador horizontal con agitación suave durante 20 min.
8. Añadir 2 ml de medio de crecimiento KC suplementado por epidermis (aproximadamente 1 pulgada cuadrada de tamaño porEpidermis) a la placa de Petri. Agarre la epidermis con fórceps y frote vigorosamente la epidermis hacia adelante y hacia atrás para liberar las células individuales de la lámina epidérmica.
   1. Observe cómo el giro medio se vuelve cada vez más turbio a medida que las células se separan de la epidermis. Incline la placa de Petri para recoger y transferir la suspensión celular a un nuevo tubo dejando la hoja epidérmica restante en el plato.
9. Repetir dos veces más el frotamiento de la lámina epidérmica después de añadir 2 ml de medio de crecimiento KC, y combinar las suspensiones celulares en el mismo tubo.
10. Pipetar la solución de la célula hacia arriba y hacia abajo suavemente unas cuantas veces para romper cualquier grupo celular usando la pipeta serológica apropiada, luego pasarla a través de un filtro de 100 μm a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
11. Centrifugar las células filtradas durante 5 min a 180 x g.
12. Se aspira el sobrenadante y se resuspende suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de crecimiento KC frío / epidermis.
13. Contar las células con un hemocitómetro.
14. Semilla las células a una densidad de 5 x 10 ⁴ / cm ² en KC medio de crecimiento en placas de cultivo previamente recubierta con un producto de la matriz extracelular (ECM) que promueve la unión celular.
    Las células se cultivaron en incubadora humidificada con CO ₂ al 5% a 37 ° C, y se cultivaron medios frescos en una incubadora humidificada Repuesto cada dos días.
    1. Para el recubrimiento, cubra las placas de cultivo con el material de revestimiento de fijación celular calentado a temperatura ambiente durante 10 min a 2 h antes de la siembra de células. Eliminar el factor de inserción justo antesAñadiendo la suspensión celular.
15. Cambiar el medio 24 h después del recubrimiento inicial para eliminar las células no unidas y cambiar el medio diariamente hasta que las células alcancen la confluencia deseada antes del experimento.

2. Aislamiento primario del ratón KC de la piel de la cola del adulto

1. Sacrificar un ratón adulto C57BL / 6 (preferiblemente entre 6-15 semanas de edad, ya sea hombre o mujer) de acuerdo con las regulaciones de la instalación de animales. Cortar la cola del cuerpo de la base de la cola, y cortar ~ 2 mm de la punta de la cola de modo que haya un agujero visible en la punta.
2. Para pelar la piel de la cola, primero use una cuchilla afilada para cortar la piel de la cola desde la base hasta la punta de la cola. A continuación, use una pinza para agarrar el hueso de la cola expuesto y las otras pinzas para agarrar la piel, y pelar suavemente la piel de la cola del hueso con un movimiento continuo. Corte la piel pelada de la línea media de manera que cada pieza tenga menos de 2-3 cm de largo.
3. Enjuague la piel pelada ingenioH 15 mL de PBS estéril en una placa de Petri de 10 cm, luego coloque la piel de cada cola en un tubo de 2 mL lleno con tampón de digestión de dispase helado (4 mg / mL dispase en medio de crecimiento KC).
   NOTA: Múltiples piezas de piel también se pueden combinar e incubar en un tubo de 15 ml (hasta 5 colas por tubo) que contenga 12 ml de solución dispasa.
   1. Incubar el tubo de la piel durante la noche en un refrigerador de 4 ° C en un rotador.
4. Realizar los pasos 1.4 a 1.13 para aislar la suspensión de células individuales de la epidermis de la cola.
5. Sembrar la células adultas a una densidad de 10 x 10 ⁴ / cm ² (contados por un hematocitómetro) en medio de crecimiento KC en placas de cultivo pre-recubiertas con colágeno.
   NOTA: Utilizamos un kit de revestimiento basado en colágeno comercialmente disponible (vea la Tabla de Materiales para más detalles). Las células se cultivaron en incubadora humidificada con CO _ { _2} al 5% a 37ºC, y el medio fresco se reponía cada dos días. En general, el cLos platos ulteriores deben recubrirse con colágeno durante 30 min a 1 h antes de la siembra celular. Se observa que existe una mejora significativa de la unión de KC adulto al plato cuando se recubre con colágeno en comparación con el factor de unión, que es un material de revestimiento a base de gelatina.
6. Cambiar el medio 24 h después del recubrimiento inicial para eliminar las células no unidas y cambiar el medio diariamente hasta que las células alcancen la confluencia deseada antes del experimento.

3. Diferenciación In Vitro de KCs por Alto Calcio

1. Para inducir la diferenciación terminal, añadir _CaCl2 para 0,2 mM en el medio de cultivo.
2. Alternativamente, se mueren de hambre los KC cultivados durante la noche sin añadir suplementos de crecimiento en medio basal de calcio bajo KC antes de la adición de calcio alto.
   NOTA: El hambre por factor de crecimiento aumentará el compromiso celular con la diferenciación temprana y la inducción de marcadores de diferenciación temprana, como K10 ⁵

4. Muerte celular mediada por radiación UVB y liberación de TNFα de KCs

1. Se cultivan los KCs de ratón en medio de crecimiento KC (en incubadora humidificada con 5% de CO ₂ a 37ºC) con un cambio medio diario hasta que las células alcanzan la confluencia. Inmediatamente antes de la irradiación UVB, retirar el medio de crecimiento y reemplazarlo con 500 μl de PBS. A continuación, someter las células a 25 mJ / cm ² UVB o control simulado (sin UVB).
   NOTA: La irradiación UVB se realiza utilizando lámparas UVB de mano con dos bulbos de 8 W (312 nm) como se describió anteriormente ¹⁰ . Después de la irradiación con UVB, se aspira PBS y se añade medio fresco.
2. Medir y cuantificar la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular CCK-8 a las 6, 8 y 24 h post-UVB tratamiento siguiendo las instrucciones del fabricante [ ^11] .
3. Recoger el medio acondicionado de los KC tratados con UVB en los puntos de tiempo deseados y medir el TNF α liberadoEn el medio acondicionado mediante el kit de ELISA de ratón TNF (Mono / Mono) siguiendo las instrucciones del fabricante ^{7 , 12} .

Resultados

Alta diferenciación terminal inducida por calcio de KC neonatal y adulto. Los KCs epidérmicos de ratón primario colocados y mantenidos a CaCl _ { ₂ } 0,06 mM crecieron como una monocapa y las células individuales tenían una forma poligonal con un espacio intercelular distinto, mostrando una apariencia de adoquín cuando eran confluentes ( Figura 1A y Figura 2A ). La elevación de la _CaCl2

Discusión

La epidermis de la piel funciona como una barrera crítica para separar y proteger el cuerpo del ambiente exterior y el daño de la pérdida del agua, de los agentes patógenos, del calor y de la irradiación ULTRAVIOLETA. Los KC son el linaje celular predominante de la epidermis y el cultivo primario de KCs epidérmicos es una herramienta útil para estudiar y comprender los procesos biológicos de formación de barreras y la respuesta de KCs a insultos ambientales in vitro .

Aquí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 neonates or adult wildtype mice	Jackson Laboratory	000664	Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.
KC basal medium (EpiLife)	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2
Defined Growth Supplement (dGS)	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	defined growth supplements for culture medium
Dispase powder	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	enzyme to dissociate the epidermis from dermis
Attachment Factor	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	gelatin-based coating material
Coating Matrix	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	Collagen-based coating material
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet
100 μm Cell Strainer Nylon mesh	Corning	352360
CCK-8 cell viability Kit	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
Corded Hand-Held UV Lamps	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8-watt UV tubes	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
Light Inverted Microscope for cell culture	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
Fluorescent Microscope	Olympus	BX41