Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Resumo

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Resumo

O queratinócito (KC) é o tipo de célula predominante na epiderme, a camada mais externa da pele. Os KC epidérmicos desempenham um papel crítico no fornecimento de defesa da pele ao formar uma barreira da pele intacta contra insultos ambientais, como a irradiação UVB ou patógenos, e também iniciando uma resposta inflamatória sobre esses insultos. Aqui descrevemos métodos para isolar KCs de pele de rato neonatal e de pele de rabo de rato adulto. Também descrevemos condições de cultura usando suplementos de crescimento definidos (dGS) em comparação com o soro fetal bovino chelexado (cFBS). Funcionalmente, mostramos que os KCs neonatais e adultos são altamente responsivos à alta diferenciação terminal induzida por cálcio, formação de junção apertada e estratificação. Além disso, os KCs adultos cultivados são suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e podem liberar grandes quantidades de TNF após a irradiação UVB. Juntos, os métodos descritos aqui serão úteis aos pesquisadores para a configuração do modelo in vitroS para estudar biologia epidérmica no rato neonatal e / ou no rato adulto.

Introdução

A pele é o maior órgão do corpo com a epiderme como a camada mais externa. A epiderme desempenha um papel crítico na formação de uma barreira epidérmica intacta para separar o corpo do meio ambiente e, assim, evita a perda de água e fornece proteção contra insultos ambientais, como alérgenos, agentes patogênicos e exposição a UVB. A epiderme desenvolve a partir de uma única camada de queratinócitos basais indiferenciados (KCs) em um epitélio estratificado de várias camadas, consistindo de uma camada basal, seguida por uma camada espinhosa, camada granular e estrato córneo. Os KCs basais, que consistem em células-tronco epidérmicas e células amplificadoras de trânsito, são proliferativos e indiferenciados. À medida que os KC basais saem do ciclo celular, as células comprometem-se a se diferenciar e migram gradualmente para a superfície da epiderme, acompanhada pela maturação das junções célula-célula e na formação de uma barreira de permeabilidade epidérmica (EPB). Os KCs na camada espinhosa expressam diferenciais iniciaisMarcadores de iões tais como queratina 10 (K10); À medida que os KCs migram para a camada granular, as células expressam marcadores de diferenciação tardia, como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). No stratum corneum, os KCs se tornam corneócitos terminalmente diferenciados, que eventualmente são lançados através da descamação, à medida que novas células os substituem.

O cálcio é considerado o agente mais fisiológico na epiderme e desencadeia a diferenciação in vitro e in vivo de maneira similar. Na epiderme de pele normal, os íons de cálcio formam um "gradiente de concentração" característico, aumentando a concentração para a superfície da pele ^{1 , 2 , 3} . A concentração de cálcio aumenta de níveis baixos nas subcamadas mais baixas (camadas basais e espinhosas) até um pico na camada granular superior e depois cai para níveis insignificantes na camada mais superficial (estrato córneo). O gradiente de cálcio também se desenvolve coincidentemente com o surgimento de uma barreira de permeabilidade de componentes, que apóia que a sinalização de cálcio desempenha um papel crítico na diferenciação de KC. In vitro , baixo teor de cálcio (0,02-0,1 mM) mantém a proliferação de KCs basais como monocamada, enquanto que o alto teor de cálcio (> 0,1 mM) induz um comprometimento rápido e irreversível das células para a diferenciação terminal, como demonstrado pela formação e indução da junção apertada De LOR e INV após alto tratamento de cálcio com os KC basais ^{4 , 5} .

Além da formação de barreiras, os KC epidérmicos também são um componente importante do sistema imune inato da pele. Em resposta a patógenos ou padrões moleculares associados danificados (DAMPs) liberados após irradiação UVB ou lesões, os KCs podem produzir grandes quantidades de citocinas inflamatórias, como TNFα, IL6 e IFNβ, levando a ativação do sistema imunológico> 6 ^{, 7 , 8 , 9} . Embora seja necessária uma sinalização inflamatória adequada de KCs para a depuração de patógenos, a resposta inflamatória descontrolada pode desencadear o desenvolvimento de doenças de pele auto-inflamatórias, como psoríase e rosácea ^{6 , 8} .

Em geral, os KCs desempenham um papel vital na manutenção da barreira da pele intacta e no início de uma resposta imune após invasão de patógenos ou insultos ambientais. Portanto, a cultura primária de KCs epidérmicos é uma técnica útil para estudar a biologia epitelial, a diferenciação de KC, bem como as respostas imunes inatas estimuladas por KC. O isolamento e a cultura dos KCs epidérmicos de ratos primários podem ser um processo desafiador devido à susceptibilidade e sensibilidade de KC a vários estimulantes externos. Aqui descrevemos um método para isolar e cultura KCs de pele neonatal de mouse ouPele de cauda de rato adulto. Para o isolamento KC adulto, não usamos a pele dorsal do mouse porque o isolamento de quantidades suficientes de KC viáveis ​​deste tecido pode ser difícil pelas seguintes razões: Primeiro, a pele dorsal adulta na fase de repouso do ciclo do cabelo (telógeno) consiste em um Epiderme fina com apenas 1-2 camadas de células, levando a um baixo rendimento celular e a uma separação ineficiente da epiderme da derme, que é o passo crítico para o sucesso do isolamento de KC. Em segundo lugar, a alta densidade folicular do cabelo que está presente na pele dorsal adulta contribui ainda mais para a dificuldade em separar a epiderme da derme. Em vez disso, usamos rotineiramente a pele da cauda como fonte de KCs para ratos adultos, pois esse epitélio é mais espesso com 3-5 camadas de KC epidérmico. Também possui uma menor densidade do folículo capilar, o que não interfere na separação epidérmica, permitindo o isolamento KC de qualquer pele de rabo de rato adulto, independentemente da idade e do estágio de ciclismo do mouse. A neona isoladaKCs são semeados para pratos de cultura revestidos com gelatina, enquanto que os pratos revestidos com colágeno são utilizados para semente KC adultos isolados devido à capacidade prejudicada das células adultas para aderir em comparação com as suas contrapartes neonatais. Para cultivar KCs de ratinho, o meio basal de baixo cálcio é suplementado com dGS, que contém o fator de crescimento epidérmico (EGF), a transferrina bovina, o fator de crescimento insulino-tipo1 (IGF1), a prostaglandina E2 (PGE2), a albumina de soro bovino (BSA) e a hidrocortisona. Entre 2-4 dias após o chapeamento inicial, a maioria dos KCs diferenciados podem ser lavados durante as mudanças diárias do meio, e as células aderentes restantes apresentam morfologia típica em paralelepípedos ⁴ , estão proliferando e não expressam o marcador de diferenciação inicial K10.

Protocolo

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSD.

1. Isolamento primário e cultura de KC do mouse por pele neonatal

1. Sacrifique o nascimento pós-natal de 0 a 2 neonatos da cepa do mouse tipo selvagem C57B / 6 por decapitação usando tesoura. Corte os membros logo acima das articulações do pulso e do tornozelo, depois corte a cauda completamente, deixando um pequeno orifício.
2. Para descascar a pele inteira, primeiro inserir tesoura afiada através do buraco na cauda e cortar a pele ao longo da linha dorsal do meio do corpo até a abertura no pescoço. Em seguida, use uma pinça para agarrar o corpo exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele inteira do corpo e sobre os tocos da perna com um movimento contínuo.
   1. Retire a pele como uma peça intacta e tenha cuidado para não quebrar a pele em pedaços, pois isso irá resultar em perda de células durante a etapa de dispase.
3. Enxágue a pele descascada com 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm e, em seguida, coloque a pele de cada cachorrinho em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada, que contém 4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC (KC meio basal tem 0,06 mM _{de CaCl2,} DG, e antibióticos / antimicóticos).
   NOTA: vários isolados de pele podem ser combinados e incubados em um tubo de 15 mL (até 5 peles por tubo) contendo 12 mL de solução de dispase. Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador.
   1. Certifique-se de que a pele não está dobrada no tubo, pois isso irá resultar em exposição insuficiente da região dobrada à solução dispase.
4. No dia seguinte (após 12-18 h em dispase), transfira a pele juntamente com a solução de dispersão para uma placa de Petri. Transfira cada peça de tecido para uma nova placa de Petri com 15 ml de PBS estéril para lavar o excesso de dispase.
5. Usando dois pares de pinças, segure a pele do PBS,Levante a pele e transfira para uma nova placa de Petri com o lado epidérmico para baixo e a derme para cima. Estique cuidadosamente as dobras da pele de modo a que ela seja totalmente estendida na placa de Petri.
6. Coloque 500 μL de uma solução de digestão à base de tripsina para cada pele em uma nova placa de Petri. Usando fórceps, levante lentamente a derme para cima e afastar-se da epiderme, enquanto mantém pressionada a epiderme. Descarte a derme como material biológico perigoso. Transfira a epiderme separada e flutue em cada gota de solução de tripsina com a camada basal para baixo.
   1. Se a epiderme é dobrada na solução de tripsina, remova as dobras usando fórceps para garantir uma digestão eficiente de KCs basais do epitélio.
7. Incube a pele em uma placa de Petri em solução de tripsina à temperatura ambiente (com a tampa coberta) em um agitador horizontal com agitação suave durante 20 min.
8. Adicione 2 mL de meio de crescimento de KC suplementado por epiderme (cerca de 1 polegada quadrada de tamanho porEpiderme) para a placa de Petri. Segure a epiderme usando fórceps e esfregue vigorosamente a epiderme para trás e para trás para liberar células únicas da folha epidérmica.
   1. Observe que o meio se torna cada vez mais turvo à medida que as células são separadas da epiderme. Incline a placa Petri para recolher e transferir a suspensão celular para um novo tubo, deixando a folha epidérmica restante no prato.
9. Repita mais duas vezes o esfregamento da folha epidérmica após a adição de 2 mL de meio de crescimento KC e combine as suspensões celulares no mesmo tubo.
10. Pipetar a solução celular de forma ascendente e descendente suavemente algumas vezes para quebrar qualquer aglomerado celular usando a pipeta serológica apropriada e passá-lo através de um filtro de 100 μm para um novo tubo de centrífuga de 50 mL.
11. Centrifugar as células filtradas durante 5 min a 180 x g.
12. Aspirar o sobrenadante e ressuspender gentilmente o sedimento celular em 1 mL de meio de crescimento KC frio / epiderme.
13. Conte as células por um hemocitômetro.
    NOTA: Os KCs podem se diferenciar espontaneamente em suspensão, de modo que as células devem ser banhadas o mais rápido possível após o isolamento para garantir o melhor desempenho das células. Recomendamos colocar as células no gelo enquanto conta, pois isso reduzirá a taxa de diferenciação espontânea de KC.
14. Semear as células a uma densidade de 5 x 10 ⁴ / cm ² em meio de crescimento KC em placas de cultura pré-revestida com um produto de matriz extracelular (ECM) que promove a fixação das células.
    NOTA: Usamos um comercial disponível (por exemplo, fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina (veja a Tabela de Materiais para detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C e meio fresco Reabastecido todos os dias.
    1. Para o revestimento, revestir os pratos de cultura com o material de revestimento de fixação celular aquecido até a temperatura ambiente durante 10 min a 2 h antes da semeadura celular. Remova o fator de anexo imediatamente antesAdicionando a suspensão celular.
15. Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência.

2. Isolamento primário KC do mouse da pele de cauda adulta

1. Sacrifique um mouse adulto C57BL / 6 (de preferência entre 6-15 semanas de idade, masculino ou feminino) de acordo com os regulamentos da instalação animal. Corte a cauda do corpo da base da cauda e corte ~ 2 mm da ponta da cauda para que haja um orifício visível na ponta.
2. Para descascar a pele da cauda, ​​primeiro use uma lâmina afiada para cortar a pele da cauda da base até a ponta da cauda. Em seguida, use uma pinça para agarrar o osso da cauda exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele da cauda do osso com um movimento contínuo. Corte a pele descascada da linha média para que cada peça tenha menos de 2-3 cm de comprimento.
3. Enxágüe a pele de pele sagacidadeH 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm, em seguida coloque a pele de cada cauda em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada (4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC).
   NOTA: várias peças de pele também podem ser combinadas e incubadas em um tubo de 15 mL (até 5 caudas por tubo) contendo 12 mL de solução de dispersão.
   1. Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador.
4. Execute os passos 1.4 a 1.13 para isolar a suspensão de célula única da epiderme da cauda.
5. Semente as células adultas com uma densidade de 10 x 10 ⁴ / cm ² (contada por um hematocitômetro) em meio de crescimento KC em pratos de cultura pré-revestidos com colágeno.
   NOTA: Utilizamos um kit de revestimento baseado em colágeno comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C, e o meio fresco foi reabastecido todos os dias. Em geral, o cOs pratos ulture devem ser revestidos com colágeno durante 30 min a 1 h antes da semeadura celular. Observamos que há um aprimoramento significativo da aderência KC adulta ao prato quando revestido com colágeno em comparação com o fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina.
6. Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência.

3. Diferenciação in vitro de KCs por alto cálcio

1. Para induzir a diferenciação terminal, adicionar CaCl _2-0,2 mM no meio de cultura.
2. Alternativamente, fome os KCs cultivados durante a noite sem suplementos de crescimento adicionados em meio basal de baixo teor de cálcio KC antes da adição de alto teor de cálcio.
   NOTA: A fome do fator de crescimento aumentará o comprometimento celular para a diferenciação precoce e a indução de marcadores de diferenciação precoce, como o K10 ⁵ .

4. Mortalidade celular mediada por irradiação UVB e liberação de TNFα de KCs

1. Cultive os KCs do mouse no meio de crescimento KC (em incubadora humidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C) com mudança média diária até as células chegarem à confluência. Imediatamente antes da irradiação UVB, remova o meio de crescimento e substitua-o por 500 μL de PBS. Em seguida, submeta as células a 25 mJ / cm ² UVB ou controle de simulação (não UVB).
   NOTA: A irradiação UVB é realizada usando lâmpadas UVB portáteis com duas lâmpadas de 8 W (312 nm) como descrito anteriormente ¹⁰ . Após a irradiação UVB, o PBS é aspirado e o meio fresco é adicionado.
2. Medir e quantificar a viabilidade celular pelo teste de viabilidade CCK-8 a 6, 8 e 24 h após o tratamento com UVB seguindo as instruções do fabricante ¹¹ .
3. Recolher o meio condicionado dos KCs tratados com UVB nos pontos de tempo desejados e medir o TNFα liberadoNo meio condicionado pelo kit ELISA do TNF (Mono / Mono), seguindo as instruções ^{7 , 12} do fabricante.

Resultados

Alta diferenciação terminal induzida por cálcio de KC neonatal e adulto. O primário epidérmico do rato KCs plaqueadas e mantidas a 0,06 mM _{de CaCl2} cresceu como uma monocamada, e as células individuais tinham uma forma poligonal com espaço intercelular distintas, que mostra o aspecto de paralelepípedos quando confluentes (Figura 1A e Figura 2A). Elevando o CaCl _2-0,2 mM induziu uma ...

Discussão

A epiderme da pele funciona como uma barreira crítica para separar e proteger o corpo do ambiente externo e danos causados ​​pela perda de água, patógenos, calor e radiação UV. Os KCs são a linhagem celular predominante da epiderme e a cultura primária de KC epidérmicas é uma ferramenta útil para estudar e compreender os processos biológicos de formação de barreiras e a resposta de KCs a insultos ambientais in vitro .

Aqui descrevemos métodos para isolar e cultivar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 neonates or adult wildtype mice	Jackson Laboratory	000664	Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.
KC basal medium (EpiLife)	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2
Defined Growth Supplement (dGS)	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	defined growth supplements for culture medium
Dispase powder	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	enzyme to dissociate the epidermis from dermis
Attachment Factor	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	gelatin-based coating material
Coating Matrix	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	Collagen-based coating material
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet
100 μm Cell Strainer Nylon mesh	Corning	352360
CCK-8 cell viability Kit	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
Corded Hand-Held UV Lamps	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8-watt UV tubes	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
Light Inverted Microscope for cell culture	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
Fluorescent Microscope	Olympus	BX41