Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

Резюме

Эпидермальные кератиноциты образуют функциональный кожный барьер и расположены на передней линии защиты хозяина от внешних экологических оскорблений. Здесь мы описываем методы выделения и первичной культуры эпидермальных кератиноцитов из кожи новорожденных и взрослых мышей, а также индукцию терминальной дифференцировки и вызванного УВБ воспалительного ответа от кератиноцитов.

Аннотация

Кератиноцит (KC) является преобладающим типом клеток в эпидермисе, внешнем слое кожи. Эпидермальные КС играют решающую роль в обеспечении защиты кожи путем формирования неповрежденного кожного барьера против экологических оскорблений, таких как облучение UVB или патогенов, а также путем инициирования воспалительного ответа на эти оскорбления. Здесь мы описываем методы выделения КС из неонатальной кожи мыши и кожи взрослого мышиного хвоста. Мы также описываем условия культивирования с использованием определенных добавок роста (dGS) по сравнению с челюстной фетальной бычьей сывороткой (cFBS). Функционально мы показываем, что как новорожденные, так и взрослые KC очень чувствительны к терминальной дифференцировке с высоким кальцием, плотному образованию соединения и расслоению. Кроме того, культивируемые взрослые КС чувствительны к гибели клеток, вызванной UVB, и могут выделять большие количества TNF при облучении UVB. Вместе описанные здесь методы будут полезны исследователям для установки модели in vitroС для изучения эпидермальной биологии у неонатальной мыши и / или взрослого мыши.

Введение

Кожа - самый большой орган в организме с эпидермисом как внешний слой. Эпидермис играет важную роль в формировании неповрежденного эпидермального барьера для отделения организма от окружающей среды и, таким образом, предотвращает потерю воды и обеспечивает защиту от экологических оскорблений, таких как аллергены, патогены и воздействие UVB. Эпидермис развивается из одного слоя недифференцированных базальных кератиноцитов (КС) в многослойный стратифицированный эпителий, состоящий из базального слоя с последующим остистым слоем, гранулированным слоем и роговым слоем. Базальные КС, состоящие как из эпидермальных стволовых клеток, так и транзиторно-амплифицирующих клеток, являются пролиферативными и недифференцированными. Поскольку базальные КЦ выходят из клеточного цикла, клетки совершают дифференцировку и постепенно мигрируют к поверхности эпидермиса, сопровождаясь созреванием переходов клеток-клеток и образованием барьера эпидермальной проницаемости (EPB). KCs на остистом слое экспрессируют ранние дифференцированныеИонные маркеры, такие как кератин 10 (K10); Когда КЦ мигрируют в гранулированный слой, клетки выражают маркеры поздней дифференцировки, такие как Филагрин (ФЛГ), Лорикрин (ЛОР) и Involucrin (INV). На роговом слое КС становятся терминально дифференцированными корнеоцитами, которые в конечном итоге исчезают через десквамацию, когда новые клетки заменяют их.

Кальций считается наиболее физиологическим агентом в эпидермисе и вызывает дифференцировку in vitro и in vivo аналогичным образом. В нормальном эпидермисе кожи ионы кальция образуют характерный «градиент концентрации», увеличиваясь в концентрации до поверхности кожи ^{1 , 2 , 3} . Концентрация кальция повышается с низких уровней в нижних подслоях (базальные и остистые слои) до пика в верхнем зернистом слое, а затем падает до незначительных уровней в самом поверхностном слое (роговой слой). Градиент кальция также развивается по совпадению с возникновением барьера компонентной проницаемости, который подтверждает, что сигнализация кальция играет критически важную роль дифференциации КЦ. In vitro низкий уровень кальция (0,02-0,1 мМ) поддерживает пролиферацию базальных КС в виде монослоя, тогда как высокий кальций (> 0,1 мМ) индуцирует быстрое и необратимое обязательство клеток к терминальной дифференцировке, что подтверждается образованием плотных соединений и индукцией LOR и INV при высокой обработке кальцием к базальным KC ^{4 , 5} .

Помимо образования барьеров, эпидермальные КС также являются важным компонентом врожденной иммунной системы кожи. В ответ на патогены или связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP), высвобождаемые при облучении или повреждении UVB, KC могут продуцировать большое количество воспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL6 и IFNβ, что приводит к активации иммунной системы> 6 ^{, 7 , 8 , 9} . Несмотря на то, собственно воспалительные сигнализации от KCS требуется для оформления патогена, неконтролируемая воспалительная реакция может вызвать развитие авто-воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз и розацеа ^{6, 8.}

В целом, КЦ играют жизненно важную роль в поддержании неповрежденного кожного барьера и инициировании иммунного ответа на инвазию патогенов или экологических оскорблений. Поэтому первичная культура эпидермальных КЦ является полезной методикой для изучения эпителиальной биологии, дифференцировки КЦ, а также стимулированных КК врожденных иммунных реакций. Изоляция и культура первичных эпидермальных КЦ мышей могут быть сложным процессом из-за восприимчивости KC и чувствительности к различным внешним стимуляторам. Здесь мы описываем метод выделения и культивирования КС из кожи неонатальной мыши илиВзрослая кожа хвоста мыши. Для изоляции взрослых KC мы не используем дорсальную кожу мышей, так как выделение достаточного количества жизнеспособных КС из этой ткани может быть затруднено по следующим причинам: во-первых, взрослая спинная кожа на фазе покоя цикла волос (telogen) состоит из Тонкий эпидермис с только 1-2 слоями клеток, что приводит к низкому выходу клеток и неэффективному отделению эпидермиса от дермы, что является критическим шагом для успешной изоляции KC. Во-вторых, высокая плотность фолликулов волоса, которая присутствует на дорсальной коже взрослого, также способствует затруднению отделения эпидермиса от дермы. Вместо этого мы обычно используем кожу хвоста как источник для взрослых мышей KC, так как этот эпителий толще с 3-5 слоями эпидермальных КС. Он также имеет меньшую плотность фолликула волоса, который не мешает эпидермальному разделению, тем самым позволяя изолировать KC от любой взрослого мышечного хвоста кожи независимо от стадии развития век и волос мыши. Изолированная неонаТаль KC высевают в чашки с культивированным желатином, тогда как чашки с коллагеновым покрытием используются для высевания изолированных взрослых KC из-за нарушения способности взрослых клеток к адгезии по сравнению с их неонатальными аналогами. В культуральную мышь KC низкую кальциевую среду дополняют dGS, которая содержит эпидермальный фактор роста (EGF), бычий трансферрин, инсулиноподобный фактор ростаc1 (IGF1), простагландин E2 (PGE2), бычий сывороточный альбумин (BSA) и гидрокортизон. Через 2-4 дня после первоначального осаждения большинство дифференцированных KC можно смыть при ежедневных изменениях среды, а оставшиеся адгезивные клетки показывают типичную морфологию ⁴ булыжника, размножаются и не экспрессируют ранний дифференцировочный маркер K10.

протокол

Все эксперименты на животных одобрены Комитетом по удержанию и использованию животных UCSD.

1. Выделение и культура основной мышей KC из неонатальной кожи

1. Жертвоприношение послеродового дня 0-2 новорожденных от штамма мыши C57B / 6 дикого типа путем обезглавливания с использованием ножниц. Отрежьте конечности чуть выше запястья и суставов голеностопного сустава, затем полностью отрежьте хвост, оставив небольшое отверстие.
2. Чтобы очистить всю кожу, сначала вставьте острые ножницы через отверстие в хвост и разрежьте кожу вдоль спинной средней линии тела до отверстия на шее. Затем используйте один щипчик, чтобы схватить открытое тело и другие щипцы, чтобы схватить кожу, и аккуратно очистить всю кожу от тела и над ногами пнями одним непрерывным движением.
   1. Очистите кожу как одну неповрежденную кусочку и будьте осторожны, чтобы не сломать кожу на кусочки, так как это приведет к потере клеток во время этапа дозирования.
3. Промойте очищенную кожу 15 мл стерильного PBS в чашке Петри 10 см, затем поместите кожу от каждого щенка в 2-млную пробирку, заполненную буфером для вываривания ледяного холода, который содержит дозирование 4 мг / мл в среде для роста KC (Базальная среда KC имеет 0,06 мМ CaCl ₂ , dGS и антибиотики / противогрибковые средства).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Несколько изолятов кожи можно комбинировать и инкубировать в одной пробирке объемом 15 мл (до 5 шкур на пробирку), содержащей 12 мл раствора для дозирования. Инкубируйте кожуру в течение ночи в холодильнике 4 ° C на ротаторе.
   1. Удостоверьтесь, что кожа не сгибается в трубке, так как это приведет к недостаточному воздействию сложенной области на раствор для дозирования.
4. На следующий день (после 12-18 часов в раздаче) переместите кожу вместе с раствором для дозирования в чашку Петри. Перенесите каждую кусочек ткани в новую чашку Петри с 15 мл стерильной PBS, чтобы смыть излишки.
5. Используя две пары щипцов, возьмите кожу из PBS,Поднять кожу и перенести на новую чашку Петри с эпидермальной стороной вниз и стороной дермы вверх. Осторожно растяните складки кожи так, чтобы она полностью растянулась на чашке Петри.
6. Поместите 500 мкл раствора для расщепления на трипсине для каждой кожи в новой чашке Петри. Используя щипцы, медленно поднимайте дерму вверх и от эпидермиса, удерживая эпидермис. Утилизируйте дерму как биологически опасный материал. Перенесите отделенный эпидермис и поплавок на каждую каплю раствора трипсина с базальным слоем вниз.
   1. Если эпидермис складывается на раствор трипсина, удалите все складки с помощью щипцов, чтобы обеспечить эффективное переваривание базальных КС из эпителия.
7. Инкубируйте кожу на чашке Петри в растворе трипсина при комнатной температуре (с закрытой крышкой) на горизонтальном шейкере с мягким перемешиванием в течение 20 мин.
8. Добавьте 2 мл добавленной KC-среды для роста на один эпидермис (около 1 кв. ДюймЭпидермис) к чашке Петри. Возьмитесь за эпидермис с помощью щипцов и энергично втирайте эпидермис назад и вперед, чтобы освободить отдельные клетки из эпидермального листа.
   1. Следите за тем, чтобы средний оборот становился все более мутным, когда клетки были отделены от эпидермиса. Наклоните чашку Петри, чтобы собрать и перенести клеточную суспензию на новую трубку, оставляя оставшийся лист эпидермиса на блюде.
9. Повторите еще два раза потирание эпидермального листа после добавления 2 мл среды для роста KC и объедините суспензии клеток в той же самой трубе.
10. Регулярно пипетируйте раствор ячейки несколько раз, чтобы сломать любые клеточные глыбы, используя соответствующую серологическую пипетку, затем пропустите ее через фильтр 100 мкм к новой 50-миллиметровой центрифужной пробирке.
11. Центрифугируют отфильтрованные клетки в течение 5 мин при 180 × g.
12. Аспирируйте супернатант и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл холодной среды для роста KC / эпидермиса.
13. Подсчитайте клетки гемоцитометром.
    ПРИМЕЧАНИЕ. KC могут спонтанно дифференцироваться в суспензии, поэтому клетки должны быть покрыты как можно быстрее после изоляции, чтобы обеспечить оптимальную работу клеток. Мы рекомендуем размещать клетки на льду при подсчете, так как это уменьшит скорость спонтанной дифференцировки KC.
14. Выделите клетки с плотностью 5 × 10 ⁴ / см ² в среде роста KC в чашках для культуры, предварительно покрытых продуктом внеклеточного матрикса (ECM), который способствует прикреплению клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем коммерчески доступный (например, коэффициент прикрепления, который представляет собой материал для покрытия на основе желатина (подробности см. В таблице материалов). Клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% СО ₂ при 37 ° С, а свежую среду Пополняется через день.
    1. Для покрытия нанесите культуральные чашки клеящим материалом для покрытия клеток, нагретым до комнатной температуры в течение 10 мин до 2 ч перед посевом клеток. Удалите коэффициент вложения непосредственно передДобавляя клеточную суспензию.
15. Измените среду через 24 часа после первоначального нанесения покрытия, чтобы удалить неприкрепленные клетки, и ежедневно меняйте среду, пока клетки не достигнут желаемого слияния до эксперимента.

2. Первичная мышь. Изоляция KC из кожи для взрослых.

1. Пожертвуйте взрослую мышь C57BL / 6 (предпочтительно в возрасте от 6 до 15 недель, либо мужскую, либо женскую) в соответствии с правилами животного объекта. Отрежьте хвост от тела от хвостового основания и отрежьте ~ 2 мм хвостового наконечника так, чтобы на кончике было видимое отверстие.
2. Чтобы очистить кожу хвоста, сначала используйте острое лезвие, чтобы срезать хвостовую оболочку от основания до хвостового наконечника. Затем используйте один щипчик, чтобы схватить открытую хвостовую кость и другие щипцы, чтобы схватить кожу, и осторожно очистить кожу хвоста от кости одним непрерывным движением. Отрежьте очищенную кожу от средней линии так, чтобы каждая часть была меньше 2-3 см в длину.
3. Промойте очищенный кожуH 15 мл стерильного PBS в чашке Петри 10 см, затем поместите кожу из каждого хвоста в 2-млную пробирку, заполненную буфером для отваривания ледяным холодом (дозирование 4 мг / мл в среде для роста KC).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Несколько кусочков кожи также можно комбинировать и инкубировать в одной пробирке объемом 15 мл (до 5 хвостов на пробирку), содержащей 12 мл раствора для дозирования.
   1. Инкубируйте кожуру в течение ночи в холодильнике 4 ° C на ротаторе.
4. Выполните шаги с 1.4 по 1.13, чтобы изолировать суспензию одной клетки от эпидермиса хвоста.
5. Выделите взрослые клетки с плотностью 10 × 10 ⁴ / см ² (подсчитанные гематоцитометром) в среде роста KC в чашках культуры, предварительно покрытых коллагеном.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем коммерчески доступный набор для покрытия на основе коллагена (подробнее см. Таблицу материалов ). Клетки культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% СО ₂ при 37 ° С, и свежую среду пополняли через день. В общем случае cНаверху следует наносить коллаген на 30 минут до 1 часа перед посевом клеток. Мы наблюдаем, что существует значительное усиление прикрепления взрослых KC к тарелке при покрытии коллагеном по сравнению с коэффициентом прикрепления, который является материалом покрытия на основе желатина.
6. Измените среду через 24 часа после первоначального нанесения покрытия, чтобы удалить неприкрепленные клетки, и ежедневно меняйте среду, пока клетки не достигнут желаемого слияния до эксперимента.

3. Дифференцирование VC in vitro высоким содержанием кальция

1. Чтобы вызвать терминальную дифференцировку, добавьте CaCl ₂ до 0,2 мМ в культуральную среду.
2. В качестве альтернативы, голодайте культивированные КС в течение ночи без добавления добавок роста в базальной среде с низким содержанием кальция до добавления высокого кальция.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Голодание фактора роста повышает приверженность клеток ранней дифференцировке и индукцию ранних маркеров дифференцировки, таких как K10 ⁵ .

4. Облучение UVB-опосредованной клеточной смертью и высвобождение TNFα из KC

1. Культуру мышь KC в среде роста KC (в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C) с ежедневным изменением среды до тех пор, пока клетки не достигнут слияния. Непосредственно перед облучением UVB удалите среду для роста и замените 500 мкл PBS. Затем подвергайте клетки воздействию 25 мДж / см ² UVB или макету контроля (без UVB).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Облучение UVB осуществляется с использованием карманных ламп UVB с двумя лампами мощностью 8 Вт (312 нм), как описано выше ¹⁰ . После облучения UVB PBS отсасывается и добавляется свежая среда.
2. Измерьте и количественно оценивайте жизнеспособность клеток с помощью анализа жизнеспособности клеток CCK-8 через 6, 8 и 24 часа после УФ-луча по инструкции изготовителя ¹¹ .
3. Собирают кондиционированную среду из КЦ, обработанных UVB, в нужные моменты времени и измеряют высвобождаемую TNFαВ кондиционированной среде с помощью набора ELISA Mouse TNF (Mono / Mono) согласно инструкциям производителя ^{7 , 12} .

Результаты

Высокое содержание кальция в терминальной дифференцировке новорожденных и взрослых КС. Первичные мышиные эпидермальные КЦ, покрытые и поддерживаемые при 0,06 мМ CaCl _2, росли как монослой, а отдельные клетки имели многоугольную форму с четким межклеточным...

Обсуждение

Эпидермис кожи функционирует как критический барьер для отделения и защиты организма от внешней среды и повреждения от потери воды, патогенов, тепла и ультрафиолетового излучения. КЦ являются преобладающей клеточной линией эпидермиса, а первичная культура эпидермальных КС является ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 neonates or adult wildtype mice	Jackson Laboratory	000664	Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.
KC basal medium (EpiLife)	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2
Defined Growth Supplement (dGS)	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	defined growth supplements for culture medium
Dispase powder	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	enzyme to dissociate the epidermis from dermis
Attachment Factor	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	gelatin-based coating material
Coating Matrix	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	Collagen-based coating material
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet
100 μm Cell Strainer Nylon mesh	Corning	352360
CCK-8 cell viability Kit	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
Corded Hand-Held UV Lamps	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8-watt UV tubes	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
Light Inverted Microscope for cell culture	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
Fluorescent Microscope	Olympus	BX41