בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

Summary

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

Abstract

הקרטינוציטים (KC) הוא סוג התא השולט באפידרמיס, השכבה החיצונית ביותר של העור. לקרני אפידרמיס תפקיד קריטי במתן הגנה על העור על ידי יצירת מחסום עור שלם נגד עלבונות סביבתיים, כגון קרינה UVB או פתוגנים, וכן על ידי ייזום תגובה דלקתית על עלבונות אלה. כאן אנו מתארים שיטות לבודד KCs מעכבר העכבר הילוד ומבוגר העור זנב העכבר. כמו כן, אנו מתארים תנאים מתרבים באמצעות תוספי תזונה מוגדרים (dGS) בהשוואה לסרום של שור עוברית (cFBS). באופן פונקציונלי, אנו מראים כי הן Kons ניאונטליים ומבוגר הם מגיבים מאוד להבדיל גבוהה סידן המושרה מסוף, הצומת הצומת הדוק ריבוד. בנוסף, KCs מבוגר תרבותי רגישים למוות התא מופעלת UVB והוא יכול לשחרר כמויות גדולות של TNF על קרינה UVB. יחד, השיטות המתוארות כאן יהיה שימושי לחוקרים עבור ההתקנה של מודל במבחנהS ללמוד ביולוגיה האפידרמיס בעכבר הילוד ו / או העכבר הבוגר.

Introduction

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף עם האפידרמיס כמו השכבה החיצונית ביותר. האפידרמיס משחק תפקיד קריטי ביצירת מחסום אפידרמיס שלם כדי להפריד את הגוף מן הסביבה, ובכך מונע אובדן מים ומספק הגנה מפני עלבונות סביבתיים, כגון אלרגנים, פתוגנים וחשיפה UVB. האפידרמיס מתפתח משכבה אחת של קרטינוציטים בסיסיים לא מובחנים (KC) לתוך שכבת ביצה מרובת שכבות המורכבת משכבה בסיסית, ואחריה שכבה ספינית, שכבה גרגרנית ושכבת שכבה. KCs Basal, המורכב משני תאי גזע האפידרמיס ותאי הגברה טרנזיט, הם שגשוג ולא מובחן. כמו KCs בסיסית לצאת מחזור התא, התאים להתחייב להבחנה בהדרגה נודדים לעבר פני השטח של האפידרמיס, מלווה התבגרות של תאים סלולריים צמתים ויצירת מחסום חדירות epidermal (EPB). KCs על שכבת spinous להביע מוקדם differiatיונים כגון קראטין 10 (K10); כמו KCs נודדים לשכבה פרטנית, התאים להביע סמנים הבחנה מאוחר כגון Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) ו Involucrin (INV). בשכבת הקרנית, ה- KC הופכים לקרניאוציות מובחנות סופיות, אשר בסופו של דבר לשפוך באמצעות desquamation כמו תאים חדשים להחליף אותם.

סידן נחשב סוכן פיזיולוגי ביותר האפידרמיס ומפעיל differiation במבחנה in vivo באופן דומה. ב עור רגיל אפידרמיס, יוני סידן טופס אופייני "ריכוז שיפוע", הגדלת הריכוז לעבר פני העור ^{1 , 2 , 3} . ריכוז הסידן עולה מרמות נמוכות בשכבות המשנה התחתונות (שכבות בסיסיות וספיןיות) לשיא בשכבה הגרעינית העליונה ולאחר מכן יורד לרמות זניחות בשכבה השטחית ביותר (שכבת הקרנית). הסידן שיפוע גם מפתחת מקריות עם הופעתה של מחסום חדירות רכיב, אשר תומך כי סידן איתות משחק תפקיד קריטי של בידול KC. במבחנה , סידן נמוך (0.02-0.1 מ"מ) שומר על התפשטות של KCs בסיסי כמו monolayer, ואילו סידן גבוהה (> 0.1 מ"מ) גורם למחויבות מהירה בלתי הפיך של התאים לבידול הטרמינל כפי שהוכח על ידי הצומת הצומת הדוק אינדוקציה של LOR ו INV על טיפול סידן גבוהה על בסיס KCs ^{4 , 5} .

בנוסף היווצרות המכשול, KCs האפידרמיס הם גם מרכיב חשוב של מערכת החיסון המולדת של העור. בתגובה לפתוגנים או לדפוסים מולקולאריים פגומים (DAMP) שפורסמו על קרינה UVB או פגיעה, KCs יכול לייצר כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNFα, IL6 ו IFNβ, המוביל ההפעלה המערכת החיסונית> 6 ^{, 7 , 8 , 9} . למרות איתות דלקתיות נכון מ KCs נדרש פינוי הפתוגן, תגובה דלקתית בלתי מבוקרת עלולה לגרום להתפתחות של מחלות עור דלקתיות אוטומטי, כגון פסוריאזיס ו רוזצצה ^{6 , 8} .

בסך הכל, KCs לשחק תפקיד חיוני בשמירה על מחסום עור שלם ויזום תגובה חיסונית על פלישה הפתוגן או עלבונות סביבתיים. לכן, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס היא טכניקה שימושית ללמוד ביולוגיה אפיתל, בידול KC, כמו גם KC- מגורה תגובות החיסון המולדת. הבידוד והתרבות של KCs האפידרמיס העכבר הראשוני יכול להיות תהליך מאתגר בשל רגישות של KC ורגישות גירויים חיצוניים שונים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד KCs תרבות מעכבר העכבר neonatal אועכבר מבוגר זנב עור. עבור בידוד KC מבוגר, אנחנו לא משתמשים בעור הגב של העכבר כי בידוד כמויות מספיקות של קייסי קיימא מ רקמה זו יכולה להיות קשה מהסיבות הבאות: ראשית, העור הגבי בוגר בשלב המנוחה של מחזור השיער (טלוגן) מורכב רזה עם רק 1-2 שכבות של תאים, המוביל תשואה תא נמוך הפרדה יעילה של האפידרמיס מן הדרמיס, המהווה את השלב הקריטי לבידוד KC מוצלח. שנית, צפיפות זקיקי השיער הגבוהה הקיימת על עור הגב הבוגר תורמת עוד יותר לקושי בהפרדת האפידרמיס מהדרמיס. במקום זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי בעור הזנב כמקור למקלטי עכבר בוגרים כמו אפיתל זה הוא עבה עם 3-5 שכבות של KCs האפידרמיס. כמו כן, יש צפיפות זקיקי השיער התחתונה, אשר אינו מפריע ההפרדה האפידרמיס, ובכך המאפשר בידוד KC מכל זנב העכבר העכבר הבוגר ללא קשר לגיל ואת שלב רכיבה על השיער של העכבר. הניאונה המבודדתKCs טל הם seeded כדי מנות מצופה ג 'לטין תרבות, ואילו קולגן מצופה מנות משמשים זרע מבוגר KCs מבוגר בשל יכולת לקויה של התאים הבוגרים לדבוק לעומת עמיתים הילודים שלהם. לתרבית KS של עכבר תרבותית, בינוני נמוך של סידן בסלמי הוא בתוספת dGS, המכיל גורם לגדילה באפידרמיס (EGF), העברת שור, גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGF1), פרוסטגלנדין E2 (PGE2), אלבומין בסרום של שורש (BSA) והידרוקורטיזון. בין 2-4 ימים לאחר ציפוי הראשוני, רוב KCs מובחן ניתן לשטוף משם במהלך שינויים יומיים יומיים, ואת התאים חסיד הנותרים להראות מורפולוגיה מרוצף טיפוסי ⁴ , הם מתרבים, ואינם מבטאים את סמן K10 מוקדם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים מאושרים על ידי UCSD מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. עכבר ראשי KC בידוד ותרבות מ עור ניאונטלי

1. להקריב את היום שלאחר הלידה 0-2 הילודים מן זן העכבר C57B / 6 wildtype ידי עריפת ראש באמצעות מספריים. חותכים את הגפיים רק מעל מפרק כף היד ו מפרקי, ואז לחתוך את הזנב לחלוטין, משאיר חור קטן.
2. כדי לקלף את העור כולו, תחילה להוסיף מספריים חדים דרך החור בזנב לחתוך את העור לאורך קו האמצע הגבי של הגוף לפתיחה על הצוואר. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים אחת כדי לתפוס את הגוף חשוף ואת מלקחיים אחרים לתפוס את העור, בעדינות לקלף את העור כולו מעל הגוף על גדם רגל עם תנועה אחת רציפה.
   1. לקלף את העור כמו חתיכה אחת שלם ולהיזהר לא לשבור את העור לחתיכות כמו זה יוביל הפסד התא במהלך שלב dispase.
3. לשטוף את העור קלופים עם 15 מ"ל של PBS סטרילית בצלחת 10 ס"מ פטרי, ואז למקם את העור מכל גור לתוך צינור 2 מ"ל מלא קר חיץ קר dispase חיץ, אשר מכיל 4 מ"ג / מ"ל ​​dispase במדיום צמיחה KC (בינוני בסיס KC יש 0.06 מ"מ CaCl ₂ , dGS, אנטיביוטיקה / antimycotics).
   הערה: מספר בודדים העור יכול להיות משולב מודגרות בצינור 15 מ"ל אחד (עד 5 עורות לכל צינור) המכיל 12 מ"ל של פתרון dispase. דגירה צינור העור לילה במקרר 4 מעלות צלזיוס על rotator.
   1. ודא כי העור אינו מקופל בצינור כמו זה יגרום החשיפה מספיק של האזור מקופל לפתרון dispase.
4. ביום הבא (לאחר 12-18 שעות ב dispase), להעביר את העור יחד עם פתרון dispase לתוך צלחת פטרי. מעבירים כל פיסת רקמה צלחת פטרי חדש עם 15 מ"ל סטרילי PBS לשטוף משם dispes עודף.
5. באמצעות שני זוגות מלקחיים, לתפוס את העור מ PBS,להרים את העור, ולהעביר לצלחת פטרי חדשה עם הצד האפידרמי למטה ואת הצד dermis למעלה. בזהירות למתוח את העור מתקפל כך שהוא המורחבת במלואה על צלחת פטרי.
6. מקום 500 μL של פתרון העיכול מבוסס טריפסין לכל העור בצלחת פטרי חדש. בעזרת מלקחיים, לאט להרים את הדרמיס למעלה מן האפידרמיס, תוך החזקת האפידרמיס למטה. להשליך את הדרמיס כחומר biohazardous. מעבירים את האפידרמיס מופרדים לצוף על כל טיפה של פתרון טריפסין עם השכבה הבסיסית כלפי מטה.
   1. אם האפידרמיס מקופל על הפתרון טריפסין, להסיר את כל הקפלים באמצעות מלקחיים כדי להבטיח עיכול יעיל של KCs הבסיסית מן האפיתל.
7. דגירה את העור על צלחת פטרי פתרון טריפסין בטמפרטורת החדר (עם מכסה מכוסה) על שייקר אופקי עם תסיסה עדינה במשך 20 דקות.
8. הוסף 2 מ"ל של תוספת KC בינוני צמיחה לכל האפידרמיס (כ 1 אינץ 'מרובע בגודל לכלהאפידרמיס) לצלחת פטרי. לתפוס את האפידרמיס באמצעות מלקחיים, ולשפשף במרץ את האפידרמיס קדימה ואחורה כדי לשחרר תאים בודדים מהגיליון אפידרמיס.
   1. צפה בינוני להפוך יותר ויותר עכירות כמו תאים מנותקים האפידרמיס. להטות את צלחת פטרי לאסוף ולהעביר את ההשעיה תא לצינור חדש עוזב את גיליון האפידרמיס הנותרים על המנה.
9. חזור על שתי פעמים יותר את שפשוף של גיליון האפידרמיס לאחר הוספת 2 מ"ל KC בינוני צמיחה, ולשלב את המתלים התא באותה צינור.
10. Pipet הפתרון התא מעלה ומטה בעדינות כמה פעמים כדי לשבור את כל גושי התא באמצעות פיפטה סרולוגית המתאימים, ולאחר מכן להעביר אותו דרך מסנן 100 מיקרומטר לצינור צנטריפוגות חדש 50 מ"ל.
11. צנטריפוגה תאים מסוננים במשך 5 דקות ב 180 x גרם.
12. לשאוב את supernatant ו resuspend בעדינות גלולה תא 1 מ"ל קר KC בינוני צמיחה / האפידרמיס.
13. ספירת התאים על ידי hemocytometer.
    הערה: KCs יכול להבדיל באופן ספונטני ההשעיה, ולכן התאים צריכים להיות מצופה בהקדם האפשרי לאחר בידוד כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של התאים. אנו ממליצים למקם את התאים על הקרח תוך ספירה כמו זה יקטין את קצב ההתמיינות הספונטנית KC.
14. זרע את התאים בצפיפות של 5 x 10 ⁴ / cm ² במדיום צמיחה KC בצלחות תרבות מראש מצופה מטריקס תאיים (ECM) מוצר המקדם מצורף התא.
    הערה: אנו משתמשים מסחרי זמין (למשל גורם מצורף, שהוא חומר ציפוי ג 'לטין מבוסס (ראה טבלה של חומרים לפרטים) תאים היו מתורבת בחממה humidified עם 5% CO ₂ ב 37 ° C, בינוני טרי היו מתחדשת מדי יום ביומו.
    1. עבור ציפוי, מעיל את מנות תרבות עם תא מצורף ציפוי חומר מחומם לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עד 2 שעות לפני זריעת התא. הסר את הגורם המצורף ממש לפניהוספת ההשעיה התא.
15. שנה את המדיום 24 שעות לאחר ציפוי הראשוני כדי להסיר תאים ללא התערבות, ולשנות את המדיום היומי עד לתאים להגיע confluency הרצוי לפני הניסוי.

2. עכבר ראשי KC בידוד מבוגר זנב העור

1. להקריב עכבר C57BL מבוגר / 6 (רצוי בין 6-15 שבועות של גיל, או זכר או נקבה) על פי תקנות מתקן בעלי חיים. חותכים את הזנב את הגוף מן הבסיס הזנב, לחתוך ~ 2 מ"מ של קצה הזנב, כך יש חור גלוי בקצה.
2. כדי לקלף את הזנב העור, תחילה להשתמש להב חד לחתוך לאורך הזנב העור מהבסיס אל קצה הזנב. לאחר מכן, השתמש אחד מלקחיים לתפוס את עצם הזנב חשוף ואת מלקחיים אחרים לתפוס את העור, בעדינות לקלף את העור הזנב את העצם עם תנועה אחת רציפה. חותכים את העור מקולף מאמצע השורה, כך שכל פיסת הוא פחות מ 2-3 ס"מ.
3. שוטפים את שנינות העור המקולףשעה 15 מ"ל של PBS סטרילית בצלחת פטרי 10 ס"מ, ואז למקם את העור מכל זנב לתוך צינור 2 מ"ל מלא קר חיץ קר dispase חיץ (dispes 4 מ"ג / מ"ל ​​במדיום צמיחה KC).
   הערה: מספר חתיכות העור יכול גם להיות משולב מודגרת בצינור 15 מ"ל אחד (עד 5 זנבות לכל צינור) המכיל 12 מ"ל של פתרון dispase.
   1. דגירה צינור העור לילה במקרר 4 מעלות צלזיוס על rotator.
4. בצע צעדים 1.4 עד 1.13 לבודד את ההשעיה תא בודד מן האפידרמיס הזנב.
5. זרע את התאים הבוגרים בצפיפות של 10 x 10 ⁴ / cm ² (נספר על ידי hematocytometer) במדיום צמיחה KC במאכלים תרבות מראש מצופה קולגן.
   הערה: אנו משתמשים זמין מסחרית קולגן מבוסס ציפוי ציפוי (ראה טבלה של חומרים לפרטים). תאים היו מתורבת בחממה humidified עם 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס, בינוני טרי היו מתחדשים כל יום אחר. ככלל, גמנות ulture צריך להיות מצופה קולגן במשך 30 דקות עד 1 שעות לפני זריעת התא. אנו רואים כי יש שיפור משמעותי של מצורף KC מבוגר לצלחת כאשר מצופה קולגן לעומת גורם ההתקשרות, שהוא חומר ציפוי ג 'לטין מבוסס.
6. שנה את המדיום 24 שעות לאחר ציפוי הראשוני כדי להסיר תאים ללא התערבות, ולשנות את המדיום היומי עד לתאים להגיע confluency הרצוי לפני הניסוי.

3. ב מבחנה vitroiation של KCs על ידי סידן גבוהה

1. כדי לעודד בידול מסוף, להוסיף CaCl ₂ ל 0.2 מ"מ במדיום התרבות.
2. לחלופין, להרעיב את KCs מתורבת בן לילה ללא תוספת תוספי תזונה בינוני סידן נמוך KC בסל לפני תוספת של סידן גבוהה.
   הערה: גורם רעב הצמיחה יגביר את מחויבות התא להבדל מוקדם ואת אינדוקציה של סמנים בידול מוקדם, כגון K10 ⁵

4. UVB קרינה מתווך תאים מוות TNFα שחרור מ KCs

1. תרבות KCs העכבר במדיום צמיחה KC (ב חממה humidified עם 5% CO ₂ ב 37 ° C) עם שינוי בינוני היומי עד התאים להגיע confluency. מיד לפני הקרנה UVB, להסיר את המדיום הצמיחה ולהחליף 500 μL של PBS. ואז הנושא את התאים 25 mJ / cm ² UVB או מדומה שליטה (לא UVB).
   הערה: הקרנה UVB מבוצעת באמצעות מנורות UVB כף יד עם שתי נורות 8 W (312 ננומטר) כפי שתואר לעיל ¹⁰ . לאחר הקרנה UVB, PBS הוא aspirated בינוני טרי נוסף.
2. למדוד לכמת את הכדאיות התא על ידי assay חיית מחמד CCK-8 ב 6, 8, ו 24 שעות שלאחר טיפול UVB בעקבות ההוראה של היצרן ¹¹ .
3. איסוף בינוני מותנה מן KCs שטופלו UVB בנקודות הזמן הרצוי למדוד את TNFα שוחררב בינוני מותנה על ידי TNF עכבר (מונו / מונו) ELISA Kit בעקבות הוראות היצרן של ^{7 , 12} .

תוצאות

סידן גבוהה המושרה בידול מסויים של KCs ילודים ומבוגרים. העכבר העיקרי KCs העור אפידר מצופה ומתוחזק ב 0.06 מ"מ CaCl ₂ גדל כמו monolayer, תאים בודדים היו צורה מצולע עם שטח בין תאיים שונים, מראה מראה מרובעת כאשר confluent ( איור 1 א ו

Discussion

האפידרמיס העור משמש כמכשול קריטי להפריד ולהגן על הגוף מפני הסביבה החיצונית ופגיעה מאובדן מים, פתוגנים, חום וקרינה אולטרה סגולה. KCs הם השושלת התא השלטת של האפידרמיס, התרבות העיקרית של KCs האפידרמיס הוא כלי שימושי ללמוד ולהבין את התהליכים הביולוגיים של היווצרות המכשול ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 neonates or adult wildtype mice	Jackson Laboratory	000664	Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.
KC basal medium (EpiLife)	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2
Defined Growth Supplement (dGS)	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	defined growth supplements for culture medium
Dispase powder	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	enzyme to dissociate the epidermis from dermis
Attachment Factor	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	gelatin-based coating material
Coating Matrix	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	Collagen-based coating material
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet
100 μm Cell Strainer Nylon mesh	Corning	352360
CCK-8 cell viability Kit	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
Corded Hand-Held UV Lamps	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8-watt UV tubes	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
Light Inverted Microscope for cell culture	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
Fluorescent Microscope	Olympus	BX41