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Resumen

Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.

Resumen

Disfunción de los nervios sensoriales colónicas ha sido implicada en la fisiopatología de varias condiciones comunes, incluyendo la diabetes y las enfermedades de intestino inflamatorias y funcional. Aquí, describimos un protocolo para la caracterización en vitro de las propiedades electrofisiológicas de los aferentes de colon en ratas. El colon, con el ganglio pélvico intacto (PG) adjuntado, se retira de la rata; sobrefundido con carbogenated solución de Krebs en la sala de grabación; y canulado en los extremos orales y anales para permitir la distensión. Se identifica un paquete del nervio fino que emana de la PG, y la actividad reciente del nervio aferente se registra utilizando un electrodo de succión. Distensión del segmento colónico provoca aumentos graduales en descarga multiunit. Se realiza un análisis de componentes principales para diferenciar el bajo umbral, el umbral alto y las fibras aferentes de rango dinámico ancho. Sensibilidad química de los aferentes colónicos puede ser estudiada a través de la administración baño o intramural de prueba compuestos. Este protocolo puede modificarse para su aplicación a otras especies, tales como ratones y conejillos de Indias y para estudiar las diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los aferentes hipogástrica/toracolumbar y lumbosacra pélvica del colon descendente en normal y condiciones patológicas.

Introducción

El tracto gastrointestinal (TGI) es ricamente inervado con nervios aferentes extrínsecos que trasmiten las señales sensoriales del intestino al sistema nervioso central y que contribuyen a la interacción del intestino-cerebro. Excitabilidad alterada de estos aferentes extrínsecas, así como procesamiento central alterada de las entradas aferentes, es la base visceral del dolor y otros síntomas de afecciones GI, incluyendo enfermedades de intestinos inflamatoria y funcional1. Información sensorial desde el colon se transmite principalmente a través de toracolumbar/hipogástrico y los nervios sacrolumbares pélvica (PN)2. Ha habido un creciente interés en el estudio de las propiedades electrofisiológicas de estas fibras aferentes primarias en modelos de roedores de la enfermedad. Sin embargo, en vivo grabaciones electrofisiológicas de los aferentes colon en los roedores es un desafío técnico y requiere considerables habilidades quirúrgicas. Además, cambios hemodinámicos, el movimiento de tejido y anestésicos también pueden afectar actividad del nervio y sensibilidad a la prueba estímulos en vivo. Por lo tanto, en los últimos años, un creciente número de estudios ha empleado en vitro (ex vivo) preparados de diferentes especies, incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y los seres humanos, a examinar los mecanismos de transducción sensorial en colon aferentes y la excitabilidad alterada en condiciones de enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

Principalmente se han reportado dos tipos de ex vivo de colon preparación: la preparación de la "hoja plana"5,9,10 y el "tubo" preparación3,4. Un video protocolo para la preparación de colon murino "hoja plana" ha sido previamente publicado11. En el presente Protocolo, el colon de ratón, con el PN) o los nervios esplácnicos lumbares (LSN) Unidos, es cosechada y sobrefundido en una cámara de tejido. El colon es abrir longitudinalmente, y el paquete del nervio que se extiende en un compartimiento de grabación llenado de aceite de parafina. Actividad del nervio es registrada mediante un electrodo monopolar de platino-iridio. El protocolo permite la identificación de los campos receptivos de las fibras aferentes individuales mediante el uso de estimulación eléctrica imparcial. Localiza la aplicación de estímulos químicos, así como la aplicación de paradigmas de estimulación mecánica diferentes (por ejemplo, focal mucosa sondeo y estiramiento circunferencial), a las terminaciones nerviosas aferentes. Debido a que el nervio debe ampliarse a una cámara separada de la cámara de tejido, es crítico para mantener el nervio conectado relativamente largo; la disección exitosa de los nervios plantea un desafío a los nuevos a esta metodología. Más recientemente, Nullens et al. publicó un protocolo de vídeo para la grabación en vitro de los aferentes mesentéricas yeyunal murino y segmentos colónicos12. En la preparación de este "tubo", el segmento de intestino con el mesenterio Unido se mantiene intacto, lo que permite la distensión gradual y la administración intra y extra luminal de diferentes productos químicos. Puesto que el nervio del mesenterio se registra utilizando un electrodo de succión, que puede colocarse cerca del tejido, se puede grabar actividad aferente a pesar de que el nervio del mesenterio es relativamente corto. Sin embargo, el nervio de mesenterio consiste en poblaciones mixtas de fibras aferentes vagales y espinales que inervan el yeyuno o toracolumbar hipogástrica. Lumbosacra pélvicos aferentes inervan el colon, que no puede ser discriminado en el presente Protocolo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el registro electrofisiológico de aferentes colon de rata mediante la preparación de colon "tubo" con un PG intacto Este método puede permitir la caracterización de las propiedades funcionales de lumbar esplácnico (hipogástrica) y aferentes pélvico lumbosacra.

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Protocolo

el protocolo experimental divulgado aquí ha sido aprobado por el Animal ético Comité de Shangai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la disección del colon con intacto ganglio y el nervio tronco tiene un mínimo de 15 minutos para una persona de bastante experiencia en esta técnica. Por lo tanto es necesario mantener el animal vivo pero bajo anestesia profunda y realizar disecciones, para asegurar la viabilidad del tejido para posterior grabación electrofisiológica.

1. preparación de la solución de perfusión y compuestos de prueba

  1. preparar 5 L de solución de Krebs: 113 mM NaCl, KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgSO 4, de 5,9 mM 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 y 11,5 mM de glucosa. Saturar la solución con un 95% O 2 + 5% CO 2 gas mezcla. Pre-enfriar ~ 500 mL de oxigenada Krebs en la nevera.
  2. Preparar alícuotas de stock prueba compuestos (capsaicina de 1 mM en etanol y 10 mM 5-hidroxitriptamina (5-HT) en solución salina) según sea necesario. Diluir el caldo en Krebs (para aplicación de baño) y en solución salina (para administración intraluminal) a la concentración final justo antes del uso.

2. Preparación del electrodo de grabación

  1. tire el electrodo de vidrio estándar de grabación tubos sin filamentos internos (1,5 mm de diámetro externo) utilizando un extractor de electrodo convencional. Ajustar la configuración del extractor de calor y tirar de modo que la caña de los electrodos tirados es entre 20 y 25 mm.

3. Colección de tejido

  1. anestesie la rata profundamente utilizando pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p.).
  2. Garantizando esterilidad, exponer la cavidad abdominal al realizar una incisión de línea media de la pared abdominal usando un bisturí. Tire el mesentery y otros tejidos a un lado para exponer la colon.
  3. Colocar el animal con el microscopio de disección. Mediante disección cuidadosa, localice la izquierda PG e identifique el PN y el LSN lo a. Cortar estos nervios unos milímetros de la pág.
    Nota: El PG se encuentra cerca de la Unión colon. Por lo general, 3-4 PN de la médula lumbosacra y un proyecto LSN a PG ( figura 1).
  4. Cortar el hueso sínfisis para exponer el recto. Eliminar los tejidos (es decir, vejiga urinaria, etc.) sobre el colon; Tenga cuidado de dejar intacta la PG.
  5. Sacrificio de la rata por la inyección intravenosa de una sobredosis de pentobarbital. Transecto de colon unos 3 cm por encima de la PG y quitar el colon del animal usando fórceps.
  6. Transferir el colon a una placa de Petri con solución de Krebs previamente enfriado. Eliminar las heces enjuagándolo suavemente el colon. Quitar la vejiga remanente y otros tejidos cuidadosamente, sin comprometer la pág.

4. Disección de los nervios aferentes colon

  1. el colon en una cámara de grabación (20 mL) y perfusión del tejido continuamente con carbogenated solución de Krebs. Ajustar la velocidad de perfusión en 15 mL/min
  2. Canule el colon en los extremos orales y anales. Comience la infusión intraluminal del colon con solución salina a razón de 10 mL por hora en oral anal dirección.
  3. Localizar la PG principal bajo el microscopio de disección. Utilizar insectos pasadores para exponer el ganglio. Con disección cuidadosa, encontrar una fina rama del nervio que emana desde el ganglio y corriendo hacia el colon ( figura 1). Cortar el nervio cerca del ganglio.
    Nota: La figura 1 muestra una grabación de una rama del nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de fibras aferentes esplácnicos pélvicas y lumbares. Alternativamente, se puede hacer una grabación de la PN o el LSN proximal a la pág.
  4. A su vez en el baño de calor y caliente la solución de Krebs para mantener la temperatura de la cámara 34 ± 0.5 ° C.

5. Preparación del electrodo de succión

  1. tomar una pipeta de vidrio pre-tirado (paso 2) y examine bajo el microscopio de disección. Romper la punta del electrodo con un par de pinzas para que sea de un tamaño compatible con el diámetro del nervio a grabarse.
  2. La punta en bisel colocando cerca de una encendedor de la llamarada.

6. Grabación electrofisiológica

  1. Conecte el electrodo del electrodo al portaelectrodo biselado. Conecte una jeringa de 10 mL al puerto lateral en el soporte para aplicar presión positiva o negativa al electrodo de.
  2. Conecte el soporte a la headstage de la bioamplifier y montar el headstage en un manipulador de.
  3. Mover el electrodo hasta el baño del tejido y llenar el electrodo con la solución de Krebs aplicando una succión suave, hasta que toque el alambre de plata del titular. Coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aplicar presión negativa para succionar el nervio en el electrodo. Aplicar presión más negativa para que ~ 1 mm del nervio se tira en el electrodo y forma un sello apretado.
  4. Vuelta en el bioamplifier y el filtro de 300-3.000 Hz. monitorizar la señal en el osciloscopio y graba la señal del nervio (frecuencia de muestreo de 20 kHz) y la señal de presión intraluminal (frecuencia de muestreo de 100 Hz) utilizando un ordenador con un procesamiento de datos de punto software.

7. Determinar la sensibilidad aferente colon

  1. aplicar distensión de rampa del colon por cerrar el grifo de tres vías en la cánula de salida al mismo tiempo continuamente intraluminally. Monitorear la presión intramural hasta 60 mmHg, momento en el que abrir el grifo de tres vías en la cánula de drenaje.
  2. Repetir este procedimiento cada 15 minutos aplicar medicamentos adicionales o intraluminally para probar la sensibilidad química de los nervios aferentes.

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Resultados

La figura 1 es la ilustración esquemática de la disposición experimental para la preparación de colon ex vivo "tubo", con un representante de la grabación de un nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de aferentes esplácnicos pélvicos y lumbares. En preparaciones de ratas normales, los nervios aferentes colon suelen tienen un bajo nivel de actividad espontánea irregular. Distensión de la rampa del colon provoca un a...

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Discusión

El protocolo presentado aquí es un método experimental relativamente sencillo para determinar las propiedades electrofisiológicas de las aferentes colon de ratas. El protocolo (de disección del tejido para configurar la grabación de nervio) generalmente toma aproximadamente 2 horas para completar. Tejido (paso 3) y preparación de la toma de aspiración (paso 5) son los pasos críticos. Es crucial para poder localizar el PG, el LSN y el PN y tenga cuidado de no para dañar el ganglio y nervios durante la disección ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este protocolo fue apoyado por becas de investigación de la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (#31171066, #81270464) y el centro de Ciencias de China-alemán (GZ919).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium PentobarbitalShanghai Westang Bio-TechB558
CapsaicinSigmaM2028
Electrode pullerMicroData Instrument IncPMP107
Neurolog System (Bioamplifier)Digitimer, LtdNeurolog System
A/D converterCambridge Electronic DesignMicro1401
Data processing softwareCambridge Electronic DesignSpike2 version 6
Silver wireWorld Precision InstrumentsEP12
Glass tubesWorld Precision Instruments1B150-4
Electrode holderWorld Precision InstrumentsMEH3SBW
Heating bathGrantGR150
Dissecting microscopeLeicaZoom2000
Dissecting microscopeWorld Precision InstrumentsPZMIII-BS
Cigarette lighteranyNA
Surgical toolsWorld Precision InstrumentsNA
Insect pinshome-made from 0.1 mm stainless steel wireNA
Three way manipulatorWorld Precision InstrumentsKITF-R
RatsAnyNAAny strain/sex can be used.

Referencias

  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
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  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

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