생체 외에서 쥐에 있는 저 승 구심 성 섬유의 Electrophysiological 속성의 특성

요약

비정상적인 감각 기능 내장 고통 및 다른 증상 기능 및 염증 성 대 장 질환의 기초. 프로토콜에는 비보 전 쥐 colorectum 저 승 구심 성 신경의 electrophysiological 녹음에 대 한 여기에 제공 됩니다.

초록

저 승 감각 신경의 기능 장애 이상 기능 및 염증 성 대 장 질환과 당뇨병을 포함 하 여 몇 가지 일반적인 조건에 연루 되었습니다. 여기, 우리가 쥐에 있는 저 승 afferents의 electrophysiological 속성 생체 외에서 특성에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그대로 골반 신경 절 (PG),와 함께 colorectum; 쥐에서 제거 carbogenated 녹음 실;에서 Krebs 솔루션으로 superfused 그리고 팽창 수 있도록 구강과 항문 끝 cannulated. PG에서 나오는 미세 신경 번들을 식별 하 고 multiunit 구심 성 신경 활동 흡입 전극을 사용 하 여 기록 됩니다. 저 승 세그먼트의 팽창 multiunit에 점진적 증가 elicits. 주성분 분석은 낮은 임계값, 높은 임계값 및 넓은 동적 범위 구심 섬유 차별화 위해 수행 됩니다. 저 승 afferents의 화학 감도 시험 화합물의 목욕 또는 intraluminal 관리를 통해 공부 될 수 있다. 이 프로토콜은 다른 종, 쥐, 기니 피그, 등과 정상에서 하강 콜론의 thoracolumbar/하복 및 lumbosacral/골반 afferents의 electrophysiological 속성의 차이 연구 하는 응용 프로그램에 대 한 수정할 수 및 병 적인 조건입니다.

서문

위장 지역 (GIT) 풍부한 외부 구심 성 신경 중앙 신 경계를 용기에서 감각 신호를 전달 하 고 창 자-두뇌 상호 작용에 기여 innervated입니다. 이러한 외부 afferents의 변경 된 흥분 뿐만 아니라 구심 성 입력의 변경 된 중앙 처리 기본 내장 고통 및 다른 증상 기를 포함 한 조건 기능과 염증 성 장 질환¹. 감각 정보는 colorectum에서 주로 thoracolumbar/하복과 lumbosacral/골반 신경 (PN)²를 통해 전달 됩니다. 공부 하는 설치류 질병 모델에서 이러한 기본 구심 성 섬유의 electrophysiological 속성에 대 한 관심 증가 되었습니다. 그러나, 설치류에 저 승 afferents의 비보에 electrophysiological 녹음 기술 도전 이며 상당한 수술 기술이 필요 합니다. 또한, hemodynamic 변화, 조직 운동, 그리고 마 취약 떨어질 수 있습니다 또한 신경 활동과 감도 비보에자극 테스트를. 따라서, 최근 몇 년 동안, 연구의 증가 고용 체 외에서 (ex vivo) 준비의 다른 종, 포함 쥐, 쥐, 기니 피그, 및 인간, 저 승에서 감각 전달의 메커니즘을 검토 하 afferents와 질병 상태에서 변경 된 흥분입니다. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}

두 가지 유형의 저 승 준비 비보 전 주로 보고 되었습니다: "플랫 시트" 준비^5,,910 고 "튜브" 준비^3,4. "플랫 시트" murine colorectum 준비를 위한 비디오 프로토콜¹¹이전에 게시 되었습니다. 이 프로토콜은 PN과 마우스 colorectum), 요 추 splanchnic 신경 (LSN) 조직 챔버에 수확 하 고 superfused 또는. colorectum 경도, 오픈 절단 그리고 신경 번들 파라핀 기름을 가득 녹음 구획으로 확장 됩니다. 신경 활동 monopolar 백 금-이리듐 전극을 사용 하 여 기록 됩니다. 프로토콜 편견된 전기 자극을 사용 하 여 개별 구심 성 섬유의 수용 필드의 식별에 대 한 수 있습니다. 그것은 localizes 화학 자극의 응용 프로그램 뿐만 아니라 다른 기계적 자극 패러다임의 응용 프로그램 (예를 들어, 초점 점 막 프로 빙 및 원주 스트레치), 구심 신경 엔딩. 그것은 비교적 긴; 연결 된 신경 유지 하는 중요 한 신경 조직 약 실에서 별도 챔버를 확장 해야 합니다, 때문에 신경의 성공적인 절 개 그 도전이이 방법론에 새로운 포즈. 더 최근에, Nullens 그 외 여러분 murine jejunal에 저 승 세그먼트¹²mesenteric afferents의 생체 외에서 녹화를 위한 비디오 프로토콜을 출판. 이 "튜브" 준비에 연결 된 mesentery와 창 자 세그먼트 등급된 팽창 및 다른 화학 제품의 내부 및 추가 luminal 관리 되므로 그대로 유지 됩니다. Mesentery 신경 조직 가까이 배치 될 수 있습니다, 흡입 전극을 사용 하 여 기록 됩니다 이후 mesentery 신경은 상대적으로 짧은 하더라도 성의 활동을 기록할 수 있습니다. 그러나, mesentery 신경 자극 공장 vagal 및 척수 구심 섬유의 혼합된 인구 구성 또는 thoracolumbar 하복. Lumbosacral 골반 afferents 자극이 프로토콜에 차별 수 없습니다 colorectum. 여기, 선물이 electrophysiological 쥐 저 승 afferents "튜브" colorectum 준비는 그대로 페이지와 함께 사용 하 여 녹음에 대 한 자세한 프로토콜 이 방법은 splanchnic 요 추의 기능 특성의 특성에 대 한 수 있습니다 (하복) 및 lumbosacral 골반 afferents.

프로토콜

여기에서 보고 된 실험 프로토콜은 동물 윤리 위원회의 상하이 교통 대학의과 대학 (# SYXK2013-0050)에 의해 승인 되었습니다. 그대로 신경 절 및 신경 colorectum의 해 부 트렁크는이 기술에 아주 경험 있는 사람에 대 한 최소 15 분 걸립니다. 그것은 깊은 마 취 동물 살아 있지만 해 electrophysiological 기록에 대 한 조직의 생존을 보장 하기 위해 수행 하는 동안 유지 하는 데 필요한 따라서.

1. 관류 솔루션의 준비 및 시험 화합물

1. 준비 5 L 크레브스 솔루션의: 113 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 1.2 m m NaH ₂ 포 ₄, 1.2 m m MgSO ₄, 25 m m NaHCO ₃, 1.2 m m CaCl ₂ , 및 11.5 m m 포도 당. 95% O ₂ + 5% CO ₂ 가스 혼합 솔루션을 포화. 미리 냉장고에 산소 Krebs의 ~ 500 mL를 냉각.
2. 준비 aliquots 재고의 필요에 따라 화합물 (에탄올과 10 m m 5-hydroxytryptamine (5-HT) 염 분에에서 1 mM capsaicin)를 테스트 합니다. 그냥 사용 하기 전에 최종 농도에 Krebs (목욕 용)와 염 분 (intraluminal 관리)에 대 한 재고 희석.

2. 기록 전극의 준비

1. 표준 유리에서 기록 전극 없이 기존의 전극 끌어당기는 사람을 사용 하 여 내부 필 (1.5 m m 외부 직경) 튜브 풀. 열에 대 한 끌어당기는 설정을 조정 하 고 당기는 가져온된 전극의 칼 20 사이 25 m m.

3. 조직 컬렉션

1. Anaesthetize 나트륨 pentobarbital (80 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 깊이 쥐.
2. 무 균을 보장 하면서 메스를 사용 하 여 복 부 벽에 midline 절 개를 수행 하 여 복 부 구멍을 노출. mesentery 및 옆으로 colorectum를 폭로 다른 조직.
3. 해 현미경 동물을 배치합니다. 조심 해 부를 통해 왼쪽된 PG 찾아서는 PN과 합류 하는 LSN을 식별 합니다. 이 신경은 페이지 멀리 몇 밀리미터 잘라
   참고: PG 장 교차점에 가까운 속 인 다. 일반적으로 3-4 PN lumbosacral 척수 및 LSN 프로젝트에서 PG ( 그림 1)를.
4. 항문 노출 관절 뼈를 잘라. Colorectum; 위의 조직 (즉, 오 줌 방광, 등) 제거 PG를 그대로 조심.
5. 는 Pentobarbital의 과다 복용의 정 맥 주입 하 여 쥐를 희생. 콜론 세 위에 약 3cm transect 고 집게를 사용 하 여 동물에서 제거 하는 colorectum.
6. 사전 냉각된 Krebs 솔루션으로 가득 페 트리 접시에는 colorectum를 전송 합니다. 부드럽게 콜론을 플러시하는 배설물을 제거 합니다. 남은 오 줌 방광 및 다른 조직에 페이지를 손상 없이 신중 하 게, 제거

4. 저 승 구심 성 신경의 해 부

1. 콜론 녹음 챔버 (20 mL)로 놓고 perfuse carbogenated Krebs 솔루션을 지속적으로 조직. 15 mL/분에서 관류 속도 설정
2. 구강과 항문 끝에 colorectum cannulate. 염 분에서 항문 방향으로 구두 10 mL/h의 속도로 콜론의 intraluminal 주입 시작.
3. 해 현미경 주요 PG를 찾습니다. 곤충 핀을 사용 하 여 노출 된 신경 절. 조심 해 부, 신경은 신경 절에서 유출 하 고 콜론 ( 그림 1)으로 실행의 좋은 지점을 찾을. 가까이 신경 절의 신경 절단.
   참고: 그림 1에 나와 있는 페이지에 말 초 신경 지점에서 녹음 신경은 골반과 요 추 splanchnic 구심 성 섬유의 혼합물을 아마도 포함 되어 있습니다. 또는, 녹음은 PN 및 LSN 인접 하는 페이지에서 만들어질 수 있다
4. 난방 목욕과 따뜻한 34 ± 0.5 ° c.에 챔버 온도 유지에 Krebs 솔루션 설정

5. 흡입 전극의 준비

1. 미리 가져온된 유리 피 펫 (2 단계) 하 고 해 현미경 검사. 그것은 호환 기록 신경의 직경 크기의 집게의 쌍 전극의 팁을 부.
2. 라이터 플레어 가까이 배치 하 여 팁을 경사.

6. Electrophysiological 녹음

1. 연결 전극 홀더를 경사진된 전극. 측면 포트 전극에 부정적 또는 긍정적인 압력을 적용 하려면 소유자에 10 mL 주사기를 연결.
2. 소유자는 bioamplifier의 headstage에 연결 하 고 조작자에 headstage를 탑재.
3. 조직 목욕 전극 이동한 소유자의 실버 와이어 연결 될 때까지 부드러운 흡입을 적용 하 여 전극 Krebs 솔루션을 작성 합니다. 신경의 절단된 끝 가까이 전극 팁 놓고 신경 전극으로 빨 아 부정적인 압력을 적용 합니다. ~ 1 m m는 신경의 전극으로 당겨 하 고 단단한 물개를 형성 더 부정적인 압력을 적용.
4. 회전 설정 필터 300 3000 Hz. 하 고 bioamplifier에 오실로스코프에 신호를 모니터링 하 고 기록 신경 신호 (20 kHz 샘플링 속도) 및 스파이크 데이터 처리와 컴퓨터를 사용 하 여 intraluminal 압력 신호 (100 Hz 샘플링 속도) 소프트웨어.

7. 저 승 성의 감도 테스트

지속적으로 intraluminally를 일으키는 동안 콘센트 정에 3 방향 탭을 닫아서 콜론의

1. 적용 램프 팽창. 그것에 도달할 때까지 60 mmHg, 오픈 시간에 배출 정에 3 방향 탭 intraluminal 압력 모니터링.
2. 15 분 적용 약물 추가-또는 intraluminally의 구심 성 신경 화학 감도 테스트를 정기적으로이 절차를 반복.

결과

그림 1 은 비보 전 "튜브" colorectum 준비는 페이지에 말 초 신경에서 기록 하는 대표에 대 한 실험적인 체제의 구조 그림 신경은 아마도 골반과 요 추 splanchnic afferents의 혼합물을 포함. 정상 쥐에서 준비, 저 승 구심 성 신경은 일반적으로 불규칙 한 자발적인 활동의 저수준이 있다. 콜론의 램프 팽창 발사 속도 (그림 1B)에 있...

토론

여기에 제시 된 프로토콜 쥐의 저 승 afferents의 electrophysiological 속성을 평가 하기 위해 비교적 간단한 실험 방법입니다. (신경 녹음을 설정 하 고 조직 해 부)에서 프로토콜 일반적으로 완료 하는 데 약 2 시간 걸립니다. 조직 컬렉션 (3 단계) 및 흡입 전극 (5 단계)의 준비는 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 PG, LSN와 PN 주의 하지 신경 절 및 신경 조직의 해 부 동안에 손상 수 있을 중요 합니다. 유리 피...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital	Shanghai Westang Bio-Tech	B558
Capsaicin	Sigma	M2028
Electrode puller	MicroData Instrument Inc	PMP107
Neurolog System (Bioamplifier)	Digitimer, Ltd	Neurolog System
A/D converter	Cambridge Electronic Design	Micro1401
Data processing software	Cambridge Electronic Design	Spike2 version 6
Silver wire	World Precision Instruments	EP12
Glass tubes	World Precision Instruments	1B150-4
Electrode holder	World Precision Instruments	MEH3SBW
Heating bath	Grant	GR150
Dissecting microscope	Leica	Zoom2000
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Cigarette lighter	any	NA
Surgical tools	World Precision Instruments	NA
Insect pins	home-made from 0.1 mm stainless steel wire	NA
Three way manipulator	World Precision Instruments	KITF-R
Rats	Any	NA	Any strain/sex can be used.