In Vitro Caractérisation des propriétés électrophysiologiques des fibres afférentes du côlon chez le rat

Résumé

Fonction sensorielle anormale sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Un protocole pour l’enregistrement électrophysiologique des nerfs afférents coliques dans une préparation de rectum ex vivo rat est présenté ici.

Résumé

Dysfonction des nerfs sensitifs du côlon a été impliquée dans la pathophysiologie de plusieurs conditions communes, notamment le diabète et les maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation in vitro des propriétés électrophysiologiques des afférences coliques chez le rat. Le rectum, avec le ganglion pelvien intact (PG), attaché, on retire le rat ; superfusés avec carbogenated une solution de Krebs dans la chambre d’enregistrement ; et canulés aux extrémités afin de permettre une distension orale et anales. Un faisceau de nerfs fine émanant de la PG est identifié et l’activité nerveuse afférente principe est enregistrée à l’aide d’une électrode d’aspiration. Distension du segment colique provoque des augmentations progressives en principe décharge. Une analyse en composantes principales est menée pour différencier le bas seuil, le seuil haut et les fibres afférentes de gamme grande dynamique. Sensibilité chimique des afférences du côlon peut être étudiée par l’administration bain / intraluminale des composés d’essai. Ce protocole peut être modifié pour l’application à d’autres espèces, telles que la souris et le cobaye et d’étudier les différences dans les propriétés électrophysiologiques des afférences hypogastrique/thoraco-lombaire et lombo-sacrée/pelvienne du côlon descendant dans des conditions normales et certaines pathologies.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (TGI) est richement innervé par les nerfs afférents extrinsèques qui transmettent des signaux sensoriels de l’intestin vers le système nerveux central et qui contribuent à l’interaction cerveau-intestin. Excitabilité altérée de ces afférences extrinsèques, ainsi qu’altération Centre de traitement des entrées afférentes, sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de GI conditions, y compris fonctionnels et inflammatoires de l’intestin maladies¹. L’information sensorielle de la rectum est véhiculée principalement par le biais de la thoraco-lombaire/hypogastrique et les nerfs lombo-sacrée/pelvienne (PN)². Il y a eu un intérêt accru en étudiant les propriétés électrophysiologiques des ces fibres afférentes primaires dans les modèles de maladies rongeurs. Cependant, in vivo des enregistrements électrophysiologiques des afférences du côlon chez les rongeurs est un défi technique et requiert des compétences chirurgicales considérables. En outre, les modifications hémodynamiques, le mouvement du tissu et anesthésiques peuvent également avoir des répercussions l’activité nerveuse et sensibilité pour tester des stimuli en vivo. Par conséquent, ces dernières années, un nombre croissant d’études ont employé in vitro (ex vivo) préparations de différentes espèces, y compris les souris, rats, cobayes et l’homme, pour étudier les mécanismes de transduction sensorielle en colique afférences et l’excitabilité altérée dans les états pathologiques. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}

Ont principalement deux types d’ex vivo la préparation colique : la préparation de « plat-feuille »^5,9,10 et le « tube » préparation^3,4. Un protocole vidéo pour la préparation de rectum murin « plat-feuille » a été publiée précédemment¹¹. Dans le présent protocole, le rectum de souris, avec le PN) ou des nerfs splanchniques lombaires (LSN) attachés, est récolté et superfusée dans une chambre de tissu. Le rectum est découpé longitudinalement, et le faisceau de nerfs se prolonge dans un compartiment d’enregistrement rempli d’huile de paraffine. L’activité nerveuse est enregistrée à l’aide d’une électrode de platine-iridium monopolaire. Le protocole permet l’identification des champs réceptifs des fibres afférentes individuels en utilisant non biaisée de la stimulation électrique. Elle localise à la demande des stimuli chimiques, ainsi que l’application des paradigmes différents de stimulation mécanique (p. ex., focale muqueuse sonder et circonférentielle stretch), à des terminaisons nerveuses afférentes. Parce que le nerf doit être étendu à une chambre séparée de la chambre de tissu, il est essentiel de garder le nerf ci-joint relativement long ; la dissection réussie des nerfs pose un défi à ceux nouvelle à cette méthodologie. Plus récemment, Nullens et coll. publié un protocole vidéo pour l’enregistrement in vitro des afférences mésentériques murine jéjunale et segments du côlon¹². Dans cette préparation « tube », le segment de l’intestin avec le mésentère attaché est gardé intact, permettant ainsi de distension graduée et l’administration intra - et extra-luminale de différents produits chimiques. Depuis le nerf du mésentère est enregistré à l’aide d’une électrode d’aspiration, qui peut être positionnée à proximité du tissu, activité afférente peut être enregistrée, même si le nerf du mésentère est relativement court. Toutefois, le nerf du mésentère se compose de peuplements mixtes de vagales et la colonne vertébrale des fibres afférentes qui innervent le jéjunum ou thoraco-lombaire hypogastrique. Lombo-sacrée afférences pelviens innervant le rectum, qui ne peuvent pas être distinguée dans le présent protocole. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’enregistrement électrophysiologique des afférences colique de rat à l’aide de la préparation du rectum « tube » avec un PG intact Cette méthode peut permettre la caractérisation des propriétés fonctionnelles des lombaires splanchnique (hypogastrique) et lombo-sacrée afférences pelvienne.

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Protocole

le protocole expérimental rapporté ici a été approuvé par l’Animal éthique Comité de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la dissection du rectum avec ganglion intacte et du système nerveux tronc prend un minimum de 15 minutes pour une personne assez expérimentée dans cette technique. Il est donc nécessaire de garder l’animal vivant, mais sous anesthésie profonde tout en effectuant des dissections, afin d’assurer la viabilité des tissus pour les enregistrement électrophysiologique.

1. préparation de la Solution de Perfusion et des composés d’essai

1. préparer 5 L de solution de Krebs : 113 mM NaCl, KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO ₄, 1,2 mM MgSO ₄, 5,9 mM 25 mM NaHCO ₃, 1,2 mM CaCl ₂ et 11,5 mM de glucose. Saturer la solution avec un 95 % O ₂ + 5 % CO ₂ mélange de gaz. Refroidir préalablement ~ 500 mL de Krebs oxygénée dans le réfrigérateur.
2. Préparer des aliquotes de stock essais composés (capsaïcine de 1 mM dans l’éthanol et 10 mM 5-hydroxytryptamine (5-HT) dans une solution saline) selon les besoins. Diluer le stock dans Krebs (pour application de bain) et dans une solution saline (pour administration intraluminale) à la concentration finale juste avant l’utilisation.

2. Préparation de l’électrode d’enregistrement

1. tirer l’électrode d’enregistrement standard en verre tubes sans filaments internes (diamètre extérieur de 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur classique électrode. Ajuster les paramètres de l’extracteur de chaleur et tirez pour que la tige des électrodes tirés est compris entre 20 et 25 mm.

3. Collection de tissus

1. anesthésier le rat profondément à l’aide de pentobarbital de sodium (80 mg/kg, i.p.).
2. Tout en assurant la stérilité, exposer la cavité abdominale en effectuant une incision médiane sur la paroi abdominale à l’aide d’un scalpel. Tirez le mésentère et autres tissus côté pour exposer le rectum.
3. Placer l’animal sous le microscope à dissection. Par dissection minutieuse, localiser le PG gauche et identifier le PN et affectez le NSE se joindre à elle. Couper ces nerfs de quelques millimètres de la PG.
   Remarque : Le PG se trouve à proximité de la jonction colorectal. En général, 3-4 PN de la moelle lombo-sacrée et un projet LSN à la PG ( Figure 1).
4. Couper l’os de la symphyse pubienne pour exposer le rectum. Enlever les tissus (p. ex., vessie, etc.) au-dessus du rectum ; Veillez à laisser le PG intact.
5. Sacrifier le rat par l’injection intraveineuse d’une dose létale de pentobarbital. Transect le côlon environ 3 cm au-dessus de la PG et enlever le rectum de l’animal à l’aide de forceps.
6. Transférer le rectum dans une boîte de Pétri remplie avec une solution de Krebs refroidie. Enlever les matières fécales en rinçant doucement le côlon. Enlever la vessie reste et autres tissus soigneusement, sans compromettre le p.

4. Dissection des nerfs afférents colique

1. Placer le côlon dans une chambre d’enregistrement (20 mL) et perfuse le tissu en permanence avec carbogenated une solution de Krebs. Fixer le taux de perfusion à 15 mL/min.
2. Canule dans le rectum aux extrémités par voie orale et anales. Commencer la perfusion intraluminale du côlon avec une solution saline à raison de 10 mL/h à l’oral à direction anale.
3. Localiser le grand PG sous le microscope à dissection. Utilisez des broches insectes pour exposer le ganglion. Avec dissection minutieuse, trouver une fine branche du nerf émanant du ganglion et courir vers le côlon ( Figure 1). Couper le nerf à proximité du ganglion.
   Remarque : La Figure 1 illustre un enregistrement d’une branche nerveuse distale à la p. Le nerf contient probablement un mélange de fibres afférentes splanchniques pelviennes et lombaires. Par ailleurs, un enregistrement peut être fait de la PN ou le NSE proximal à la p.
4. Mettez le bain chauffant et chaud la solution de Krebs pour maintenir la température de la chambre à 34 ± 0,5 ° C.

5. Préparation de l’électrode d’aspiration

1. prendre une pipette de verre préalablement tiré (étape 2) et l’examiner sous le microscope à dissection. Briser la pointe de l’électrode avec une paire de pinces pour qu’il soit d’une taille compatible avec le diamètre du nerf à figurer.
2. La pointe du biseau en le plaçant à proximité d’une briquet torche.

6. Enregistrement électrophysiologique

1. connecter l’électrode biseautée sur le porte-électrode. Connecter une seringue de 10 mL à l’orifice latéral sur le support à appliquer une pression négative ou positive à l’électrode de.
2. Connecter le titulaire à la tête de la bioamplifier et monter la tête sur un manipulateur.
3. Déplacer l’électrode à la préparation tissulaire et remplir l’électrode avec la solution de Krebs en appliquant légère succion jusqu'à ce qu’il touche le fil d’argent du titulaire. Placez la pointe de l’électrode à proximité de l’extrémité coupée du nerf et appliquer une pression négative pour aspirer le nerf dans l’électrode. Appliquer une pression plus négative pour que ~ 1 mm du nerf est aspiré dans l’électrode et forme un joint étanche.
4. Tourner le bioamplifier et positionner le filtre à 300-3 000 Hz. surveiller le signal sur l’oscilloscope et d’enregistre le signal nerveux (taux d’échantillonnage de 20 kHz) et le signal de la pression intraluminale (taux d’échantillonnage de 100 Hz) à l’aide d’un ordinateur avec une informatique de pointe logiciel.

7. Tester la sensibilité des afférences colique

1. appliquer une distension rampe du côlon en fermant le robinet trois voies sur la canule de sortie tout en insufflant constamment intraluminales. Surveiller la pression intraluminale jusqu'à ce qu’il atteigne 60 mmHg, moment auquel ouvert le robinet trois voies sur la canule drainant.
2. Répéter cette procédure à intervalles réguliers de drogues d’appliquer 15 min. extra - ou intraluminales pour tester la sensibilité chimique des nerfs afférents.

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Résultats

La figure 1 présente l’illustration schématique de la montage expérimental pour la préparation de rectum ex vivo « tube », avec un représentant d’enregistrement à partir d’un nerf distal à la p. Le nerf contenue vraisemblablement un mélange des afférences splanchniques pelviennes et lombaires. Dans les préparations des rats normaux, les nerfs afférents du côlon ont généralement un faible niveau d’activité spontanée irrégu...

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Discussion

Le protocole présenté ici est une méthode expérimentale relativement simple pour évaluer les propriétés électrophysiologiques des afférences du côlon de rats. Le protocole (à partir de la dissection des tissus à mettre en place l’enregistrement de nerf) dure environ 2 h pour terminer. Prélèvement tissulaire (étape 3) et la préparation de l’électrode d’aspiration (étape 5) sont des opérations critiques. Il est crucial de pouvoir localiser le PG, le NSE et le PN et à prendre soin de ne pas pour en...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital	Shanghai Westang Bio-Tech	B558
Capsaicin	Sigma	M2028
Electrode puller	MicroData Instrument Inc	PMP107
Neurolog System (Bioamplifier)	Digitimer, Ltd	Neurolog System
A/D converter	Cambridge Electronic Design	Micro1401
Data processing software	Cambridge Electronic Design	Spike2 version 6
Silver wire	World Precision Instruments	EP12
Glass tubes	World Precision Instruments	1B150-4
Electrode holder	World Precision Instruments	MEH3SBW
Heating bath	Grant	GR150
Dissecting microscope	Leica	Zoom2000
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Cigarette lighter	any	NA
Surgical tools	World Precision Instruments	NA
Insect pins	home-made from 0.1 mm stainless steel wire	NA
Three way manipulator	World Precision Instruments	KITF-R
Rats	Any	NA	Any strain/sex can be used.