In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos

Resumo

Função sensorial anormal subjacente a dor visceral e outros sintomas de doenças inflamatórias e funcionais do intestino. Um protocolo para a gravação eletrofisiológica dos nervos aferentes do cólon em uma preparação de colorectum de rato ex vivo é apresentado aqui.

Resumo

Disfunção dos nervos sensoriais do cólon tem sido implicada na fisiopatologia de várias condições comuns, incluindo diabetes e doenças inflamatórias e funcionais do intestino. Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização em vitro das propriedades eletrofisiológicas de afferents Colônica em ratos. O colorectum, com o gânglio pélvico intacto (PG), anexado, é removido o rato; superfused com carbogenated solução de Krebs na câmara de gravação; e canulado nas extremidades para permitir a distensão orais e anais. Um feixe de nervos bem emana o PG é identificado, e a atividade do nervo aferente multiunit é gravada usando um eletrodo de sucção. Distensão do segmento do cólon provoca aumentos graduais na descarga multiunit. Uma análise de componentes principais é realizada para diferenciar o baixo limiar, o limite de alta e as fibras aferentes de alcance dinâmico largo. Sensibilidade química de afferents do cólon pode ser estudada através da administração de banho ou intraluminal de compostos de teste. Este protocolo pode ser modificado para aplicação a outras espécies, como ratos e cobaias e para estudar as diferenças nas propriedades eletrofisiológicas de afferents toracolombar/hipogástrica e lombossacral/pélvica do cólon descendente no normal e condições patológicas.

Introdução

O trato gastrointestinal (GIT) é ricamente inervado com nervos aferentes extrínsecos que transmitem sinais sensoriais do intestino para o sistema nervoso central e que contribuem para a interação do intestino-cérebro. Excitabilidade alterada destas afferents extrínseca, bem como alterado processamento central das entradas aferentes, subjaz dor visceral e outros sintomas de condições de GI, incluindo de doenças intestinais inflamatórias e funcionais¹. Informações sensoriais do colorectum são transmitidas principalmente pela toracolombar/hipogástrica e os nervos pélvicos/lombossacral (PN)². Tem havido um aumento do interesse em estudar as propriedades eletrofisiológicas destas fibras aferente primário em modelos de roedores doença. No entanto, na vivo eletrofisiológicos gravações das afferents Colônica em roedores é um desafio técnico e exige consideráveis habilidades cirúrgicas. Além disso, alterações hemodinâmicas, movimento de tecido e anestésicos também afetam atividade do nervo e sensibilidade para testar estímulos na vivo. Portanto, nos últimos anos, um número crescente de estudos têm utilizado em vitro (ex vivo) preparações de diferentes espécies, incluindo ratos, ratos, cobaias e seres humanos, para examinar os mecanismos de transdução sensorial no cólon afferents e a excitabilidade alterada em condições de doença. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}

Foram relatados principalmente dois tipos de ex vivo Colônica preparação: a preparação do "plano-folha"^5,9,10 e a preparação de "tubo"^3,4. Um protocolo de vídeo para a preparação de murino colorectum "da liso-folha" tem sido previamente publicado¹¹. Neste protocolo, o colorectum do mouse, com o PN) ou esplâncnico nervos lombares (LSN) anexados, é colhido e superfused em uma câmara de tecido. O colorectum é aberto no sentido longitudinal, e o feixe de nervos é estendido em um compartimento de gravação com óleo de parafina. Atividade do nervo é gravada usando um eletrodo de platina-irídio monopolar. O protocolo permite a identificação dos campos receptivos de fibras aferentes individuais usando estimulação elétrica não-polarizada. Ele localiza a aplicação de estímulos químicos, bem como a aplicação dos paradigmas diferentes estimulação mecânica (por exemplo, focal da mucosa de sondagem e circunferencial stretch), para as terminações nervosas aferentes. Porque o nervo deve ser estendido a uma câmara separada da câmara de tecido, é fundamental para manter o nervo anexado relativamente longo; a dissecação bem sucedida dos nervos representa um desafio para aqueles novos para esta metodologia. Mais recentemente, Nullens et al publicou um protocolo de vídeo para a gravação em vitro o afferents mesentérica murino jejunal e segmentos do cólon¹². Esta preparação de "tubo", o segmento de intestino com o mesentério anexado é mantido intacto, permitindo assim distensão gradual e a administração intrae extra-luminal de diferentes produtos químicos. Desde que o nervo do mesentério é gravado usando um eletrodo de sucção, que pode ser posicionado perto do tecido, atividade aferente pode ser gravada, mesmo que o nervo do mesentério é relativamente curto. No entanto, o nervo do mesentério consiste de populações mistas de fibras aferentes vagais e espinhais que inervam o jejuno ou toracolombar hipogástrica. Lombossacral pélvicas afferents inervam o colorectum, que não pode ser discriminado no presente protocolo. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a gravação eletrofisiológica do rato Colônica afferents usando a preparação de colorectum de "tubo" com um PG. intacta Este método permite a caracterização das propriedades funcionais da lombar esplâncnico (hipogástrica) e lombossacral afferents pélvica.

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Protocolo

o protocolo experimental relatado aqui foi aprovado pelo Animal ético Comité de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). A dissecção do colorectum com gânglio intacto e nervo porta-malas leva no mínimo 15 minutos para uma pessoa muito experiente nesta técnica. É, portanto, necessário manter o animal vivo, mas sob anestesia profunda enquanto executando as dissecções, para garantir a viabilidade do tecido para posterior gravação eletrofisiológica.

1. preparação da solução de perfusão e compostos de teste

1. preparar 5 L da solução de Krebs: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO ₄, 1,2 mM de MgSO ₄, 25mm NaHCO ₃, 1,2 mM CaCl ₂ e 11,5 mM glicose. Sature a solução com um 95% O ₂ + 5% CO ₂ mistura de gases. Pre-cool ~ 500 mL de Krebs oxigenado na geladeira.
2. Preparar alíquotas de estoque testar compostos (capsaicina 1 mM em etanol e 10 mM 5-hidroxitriptamina (5-HT) em solução salina) conforme necessário. Diluir o estoque em Krebs (para aplicação de banho) e em solução salina (para administração intraluminal) para a concentração final antes do uso.

2. Preparação do eletrodo gravação

1. puxar o eletrodo gravação de vidro padrão tubos sem filamentos internos (1,5 mm de diâmetro externo) usando um extrator de eletrodo convencional. Ajustar as configurações de extrator de calor e puxar para que a haste dos eléctrodos puxados é entre 20 e 25 mm.

3. Coleção de tecido

1. Anaesthetize o rato usando profundamente pentobarbital de sódio (80 mg/kg, i.p.).
2. Assegurando esterilidade, expor na cavidade abdominal através da realização de uma incisão na parede abdominal, usando um bisturi. Puxe o mesentério e outros tecidos lado para expor o colorectum.
3. Colocar o animal sob o microscópio de dissecação. Através de dissecção cuidadosa, localizar o PG esquerdo e identificar o PN e o LSN se unir a eles. Cortar estes nervos alguns milímetros longe o PG.
   Nota: O PG situa-se perto da junção do colo-rectal. Normalmente, de 3-4 PN da medula espinal lombossacral e um projeto do LSN para o PG ( Figura 1).
4. Cortar o osso da sínfise púbica para expor o reto. Remover os tecidos (ou seja, bexiga urinária, etc.) acima da colorectum; Tome cuidado para deixar intacta a PG.
5. Sacrificar o rato pela injeção intravenosa de uma dose letal de pentobarbital. Transecto cólon cerca de 3 cm acima do PG e remover o colorectum do animal usando fórceps.
6. Transferir o colorectum para uma placa de Petri preenchida com solução de Krebs pre-cooled. Remova as fezes suavemente, nivelando o cólon. Remover a bexiga urinária remanescente e outros tecidos cuidadosamente, sem comprometer a pág.

4. Dissecação do nervo aferente do cólon

1. Coloque os dois pontos em uma câmara de gravação (20 mL) e perfundir o tecido continuamente com carbogenated solução de Krebs. Definir a taxa de perfusão em 15 mL/min.
2. Canule o colorectum em ambas as extremidades, orais e anais. Começar a infusão intraluminal do cólon com soro fisiológico na proporção de 10 mL/h em direção anal oral.
3. Localizar o PG principal sob o microscópio de dissecação. Use pinos de insetos para expor o gânglio. Com dissecção cuidadosa, encontre um ramo fino do nervo emanando do gânglio e correndo em direção ao cólon ( Figura 1). Cortou o nervo perto do gânglio.
   Nota: A Figura 1 ilustra uma gravação de um ramo do nervo distal para o PG. O nervo presumivelmente contém uma mistura de lombares e pélvicas esplâncnico fibras aferentes. Alternativamente, uma gravação pode ser feita de PN e/ou o LSN proximal para o PG.
4. Ligue o banho de aquecimento e aquecer a solução de Krebs para manter a temperatura da câmara 34 ± 0,5 ° C.

5. Preparação do eletrodo sucção

1. tomar uma pipeta de vidro pré-puxada (passo 2) e inspecioná-lo sob o microscópio de dissecação. Quebrar a ponta do eletrodo com um par de pinças para que ele seja de um tamanho compatível com o diâmetro do nervo a ser gravado.
2. a ponta em bisel, colocando-o perto de uma chama de isqueiro.

6. Gravação eletrofisiológica

1. conectar o eletrodo chanfrado para o eléctrodo. Conecte uma seringa de 10 mL à porta lateral no suporte para aplicar pressão positiva ou negativa para o eletrodo.
2. Conectar o titular para o headstage do bioamplifier e montar o headstage para um manipulador.
3. Mover o eletrodo para o banho de tecido e encha o eletrodo com a solução de Krebs aplicando sucção suave até que ele entra em contato com o fio de prata do titular. Coloque a ponta do eletrodo, perto do corte final do nervo e aplique pressão negativa para sugar o nervo para o eletrodo. Aplique pressão mais negativa para que ~ 1 mm do nervo é puxada para o eletrodo e dá forma a um selo apertado.
4. Vez o bioamplifier e o conjunto do filtro para 300-3.000 Hz. o sinal no osciloscópio de monitorar e grava o sinal do nervo (taxa de amostragem de 20 kHz) e o sinal da pressão intraluminal (taxa de amostragem de 100 Hz) usando um computador com um pico de processamento de dados software.

7. Testar a sensibilidade aferente do cólon

1. aplicar distensão de rampa do cólon, fechando a torneira de três vias na cânula de tomada enquanto infundindo continuamente intraluminally. Monitorar a pressão intraluminal até atingir 60 mmHg, momento em que abrir a torneira de três vias na cânula de drenagem.
2. Repita este procedimento a intervalos regulares de 15 min. aplicar medicamentos extraou intraluminally para testar a sensibilidade química dos nervos aferentes.

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Resultados

A Figura 1 é a ilustração esquemática da instalação experimental para a preparação de colorectum ex vivo "tubo", com um representante do nervo distal de gravação para o PG. O nervo presumivelmente continha uma mistura de afferents esplâncnico pélvico e lombar. Em preparações de ratos normais, os nervos aferentes do cólon normalmente têm um baixo nível de atividade espontânea irregular. Distensão de rampa do cólon induz a um aument...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado é um método relativamente simples experimental para avaliar as propriedades eletrofisiológicas das afferents Colônica de ratos. O protocolo (a partir de dissecção de tecidos para configurar a gravação de nervo) normalmente leva cerca de 2 h para completar. Coleção de tecido (passo 3) e preparação do eletrodo sucção (etapa 5) são os passos críticos. É fundamental ser capaz de localizar o PG, o LSN e o PN e tome cuidado para não danificar o gânglio e nervos durante a dissecç...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital	Shanghai Westang Bio-Tech	B558
Capsaicin	Sigma	M2028
Electrode puller	MicroData Instrument Inc	PMP107
Neurolog System (Bioamplifier)	Digitimer, Ltd	Neurolog System
A/D converter	Cambridge Electronic Design	Micro1401
Data processing software	Cambridge Electronic Design	Spike2 version 6
Silver wire	World Precision Instruments	EP12
Glass tubes	World Precision Instruments	1B150-4
Electrode holder	World Precision Instruments	MEH3SBW
Heating bath	Grant	GR150
Dissecting microscope	Leica	Zoom2000
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Cigarette lighter	any	NA
Surgical tools	World Precision Instruments	NA
Insect pins	home-made from 0.1 mm stainless steel wire	NA
Three way manipulator	World Precision Instruments	KITF-R
Rats	Any	NA	Any strain/sex can be used.