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Resumen

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Resumen

Los mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente con Wolbachia se están utilizando en los programas para controlar la propagación de arbovirus como el dengue, el chikungunya y Zika. Wolbachia-mosquitos infectados pueden ser lanzados en el campo o bien reducir el tamaño de la población a través de cruzamientos incompatibles o transformar las poblaciones de mosquitos que son refractarios a la transmisión del virus. Para que estas estrategias tener éxito, los mosquitos liberados en el campo del laboratorio deben ser competitivos con los mosquitos nativos. Sin embargo, mantener los mosquitos en el laboratorio resulta en endogamia, deriva genética y adaptación de laboratorio que puede reducir su aptitud en el campo y puede confundir los resultados de experimentos. Para probar la idoneidad de diferentes infecciones de Wolbachia para el despliegue en el campo, es necesario mantener los mosquitos en un entorno de laboratorio controlado a través de múltiples generaciones. Se describe un protocolo simple para mantener los mosquitos Ae. aegypti en el laboratorio, que es conveniente para ambos Wolbachia-mosquitos infectados y tipo salvaje. Los métodos minimizan la adaptación de laboratorio y aplicación exogamia para aumentar la relevancia de los experimentos a los mosquitos de campo. Además, las colonias se mantienen en condiciones óptimas para maximizar su aptitud para los lanzamientos de campo abierto.

Introducción

Los mosquitos Aedes aegypti son responsables para la transmisión de los arbovirus más importantes del mundo, incluyendo dengue, Zika y chikungunya1. Estos virus se están convirtiendo en una amenaza creciente para la salud global, como la distribución generalizada de Ae. aegypti en las zonas tropicales continúa ampliando2,3,4. Hembra de Ae. aegypti preferentemente se alimentan de sangre humana5 y así tienden a vivir en proximidad cercana a los seres humanos, particularmente en las zonas urbanas donde las poblaciones son más densas. A través de esta asociación cercana con los seres humanos también se han adaptado para reproducirse en ambientes artificiales, como neumáticos, macetas, canaletas y tanques de agua6,7. AE. aegypti también fácilmente adaptarse a entornos de laboratorio donde se puede mantener sin cualquier requisito especial después de ser recogido directamente en el campo, a diferencia de algunas otras especies de Aedes género8, 9,10. Su facilidad de mantenimiento ha visto ampliamente estudiado en el laboratorio en una amplia gama de campos, en última instancia, con el objetivo de controlar los mosquitos de enfermedades puede transmitir.

Tradicionalmente, control por arbovirus depende en gran medida el uso de insecticidas para reducir poblaciones de mosquitos. Sin embargo, hay creciente interés en los enfoques donde los mosquitos modificados son criados en el laboratorio y luego liberados en las poblaciones naturales. Los mosquitos liberados pueden modificarse genéticamente11,12,13, biológicamente14,15, a través de irradiación16, tratamiento químico17,18, o combinación de técnicas19 para suprimir las poblaciones de mosquitos o reemplazarlos con los mosquitos que son refractarios a transmisión arboviral20.

Wolbachia son bacterias que se utilizan actualmente como un agente de control biológico para arbovirus. Varias cepas de Wolbachia se introdujeron recientemente en Ae. aegypti experimentalmente usando microinjection embrionario21,22,23,24. Estas cepas reducen la capacidad de arbovirus a difundir y replicar en el mosquito, disminuyendo su transmisión potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecciones se transmiten de madre a hijos, sin embargo algunas cepas inducen esterilidad cuando los machos infectados aparean con las hembras no infectadas22. Wolbachia-varones infectados por lo tanto pueden ser lanzados en grandes cantidades para suprimir las poblaciones de mosquitos naturales, recientemente demostradas en otras especies de Aedes 15,29. Sin embargo, puesto que Wolbachia también inhiben la transmisión arboviral en Ae. aegypti, mosquitos pueden también lanzar para reemplazar las poblaciones nativas con vectores más pobres. Ae. aegypti infectado experimentalmente con Wolbachia ahora están siendo liberados en el campo en varios países con este último enfoque14,30,31.

Wolbachia-basada en enfoques de control arboviral dependen de una sólida comprensión de las interacciones entre Wolbachia, el mosquito y el medio ambiente. Wolbachia ocurre naturalmente en una amplia gama de insectos, y las tensiones que introducen los mosquitos son diversas en sus efectos32. Como se introducen nuevos tipos de infección por Wolbachia en Ae. aegypti24, es necesario caracterizar cada cepa por sus efectos en la aptitud de mosquito, reproducción y arboviral interferencia en una variedad de condiciones. Experimentación rigurosa en el laboratorio, por tanto, es necesaria para evaluar el potencial de las cepas de Wolbachia tener éxito en el campo.

Notas de campo abierto de Ae. aegypti con Wolbachia infecciones a menudo pueden requerir miles a decenas de miles de mosquitos por la zona de lanzamiento para ser criaban cada semana14,30,31. El éxito de los lanzamientos iniciales puede mejorarse liberando mosquitos de gran tamaño para maximizar su fecundidad33 y acoplamiento éxito34,35. Los mosquitos también deben ser adaptados a las condiciones que se experimentan en el campo, cría de laboratorio sin embargo a largo plazo puede causar cambios en comportamiento y fisiología que podría afectar el campo rendimiento36,37, 38.

Se describe un protocolo simple para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio utilizando equipamiento básico. Este protocolo es conveniente para ambos tipo de salvaje y Wolbachia-infectados por mosquitos, que puede requerir especial atención ya que algunas cepas de Wolbachia tienen efectos sustanciales sobre la historia de la vida rasgos de mosquito39, 40. las condiciones de cría evitar el hacinamiento y la competencia por el alimento producir mosquitos de tamaño constante, que es crítica para la competencia de vector y los experimentos de fitness y asegura que los mosquitos son saludables para el lanzamiento de campo41 . También tomamos precauciones para minimizar la adaptación del laboratorio y la endogamia mediante la reducción de presiones selectivas y asegurándose de que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar. Sin embargo, los entornos de laboratorio son claramente diferentes de las condiciones de campo, y mantenimiento a largo plazo en condiciones relajadas podría reducir la capacidad de los mosquitos al soltar en el campo37,42,43 . Por lo tanto cruzamos las hembras de líneas de laboratorio al campo los hombres periódicamente, dando lugar a colonias que son genéticamente similares comparaciones experimentales y que se adaptan a la meta de población campo39. Los métodos no requieren de ningún equipo especializado y pueden ampliarse a posterior decenas de miles de personas por semana para los lanzamientos de campo. El protocolo también da prioridad a la aptitud de mosquitos dentro y a través de generaciones, una consideración importante para los insectos destinados al establecimiento de las poblaciones naturales. El protocolo es conveniente para la mayoría de los laboratorios que requieren mantenimiento de Ae. aegypti, especialmente para las comparaciones experimentales donde una calidad constante de los mosquitos y relatability al campo son importantes.

Protocolo

Sangre alimentación de los mosquitos en seres humanos fue aprobada por la Universidad de Melbourne Comité de ética humana (aprobación #: 0723847). Todos los voluntarios siempre informaron consentimiento.

1. larvas de crianza

Nota: Los mosquitos se llevan a cabo en 26 ± 0,5 ° C y 50-70% de humedad relativa, con un fotoperiodo de 12:12 h (luz: obscuridad) para este protocolo de mantenimiento de la Colonia. Estas condiciones son similares a las condiciones climáticas promedio en Cairns, Australia y dentro del rango térmico óptimo para la supervivencia de Ae. aegypti y desarrollo44,45,46. Altas temperaturas pueden resultar en la pérdida de colonias de mosquitos Wolbachia infecciones y deben ser evitada47. Mantener a por lo menos 500 individuos por población para minimizar la endogamia; mantenimiento de colonias de un tamaño más pequeño puede tener consecuencias de fitness [Ross et al. no publicado]. Bajo estas condiciones y suponiendo que una nutrición adecuada, el tiempo de generación promedio es de 28 días (ver tabla 1).

  1. Sumergir los huevos en el sustrato en bandejas (figura 1A) que contiene 3 L de agua (agua de ósmosis inversa de agua, generado por dejar agua en bandejas para 24 h antes de su uso), ~ 300 mg de alimento para peces (uno aplastado comprimidos, véase Tabla de materiales) y un pocos granos de levadura seca activa para inducir incubar48.
  2. Un día después de la eclosión, utilice una pipeta de vidrio para transferir aproximadamente 500 larvas a bandejas que contiene 4 L de agua (figura 1B), cuenta con un contador de clicker. Añadir dos tabletas de alimento de pescado picado a cada bandeja. Si es necesario, utilizar recipientes de diferentes tamaños para la cría de las larvas (figura 1A), pero mantener densidades larvales por debajo de 0.5 larvas/mL para evitar el hacinamiento.
  3. Verifique las bandejas diariamente para asegurar que las larvas tengan alimento suficiente; Añadir aproximadamente dos tabletas de alimento a las bandejas cada dos días. Proporciona alimento ad libitum pero asegurar que 0.5 mg/larva/día está disponible durante este período para asegurar desarrollo es sincrónico y tamaño del cuerpo es constante, de lo contrario se pueden confundir los resultados de experimentos (ver resultados de representante).
  4. Tenga cuidado para evitar la sobrealimentación de larvas, particularmente en recipientes más pequeños cría con agua menos volumen y superficie. Si el agua se ve turbio o si existe significativa mortalidad larvaria, reemplazarlo con agua fresca; la mortalidad debe ser despreciable si las larvas se alimentan de forma óptima.

2. adulto aparición

Nota: Larvas empiezan a pupar de cinco días después de la eclosión si bien alimentados y la mayoría debe pupate por siete días después de la eclosión. Adultos comenzará a emerger aproximadamente dos días después de la pupación si mantiene óptimo en 26 º C (ver Resultados de representante). Desarrollo larvario está normalmente afectado por infecciones de Wolbachia cuando se proporciona abundante comida23,39,49.

  1. Siete días después de la eclosión vierta todo el contenido de la bandeja a través de una malla fina (0,4 mm de tamaño de poro). Guardar el agua filtrada de larvas para su uso posterior en ovicups (vea la sección "Alimentación y oviposición de la sangre"). Invierta la malla y sumergirla en un recipiente de plástico con 200 mL de agua para transferir las pupas. Proporcionar alimento adicional si cualquier larvas permanecen.
  2. Suministro de dos tazas de solución de sacarosa al 10% (Figura 1F) y dos tazas de algodón húmedo para evitar la desecación (Figura 1E) para preparar las jaulas de aparición adulta (figura 1).
  3. Si no necesita las pupas clasificar por sexo, coloque los envases con tapa de pupas en la jaula y deje la tapa ligeramente abierta para permitir que los adultos que emergen en la jaula. Como alternativa, colocar un embudo invertido sobre el recipiente para minimizar el ahogamiento. Asegúrese de que todos los adultos han surgido antes de retirar el recipiente de la jaula para evitar la selección contra desarrolladores lento.

3. pupa de sexado para cruzamiento exogámico

  1. Si las pupas tienen que clasificar por sexo (p. ej., para la exogamia), pipetear las pupas de bandejas de larvas y separar los sexos (figura 2) en envases de plástico (figura 1A) con 200 mL de agua cada 24 h hasta el número deseado de cada sexo se ha llegado. Coloque las tapas de los envases y dejarlos cerrados.
  2. Adultos surgirán en los envases; confirmar su sexo antes de soltar en jaulas (figura 2). Retire a cualquier adultos sexuados incorrectamente con un aspirador dentro de 24 h de aparición antes de que alcancen la madurez sexual. Una vez estén confirmados los sexos, liberar a los adultos en jaulas cada 24 h.
  3. Para obtener la Wolbachia-outcross colonias infectadas de un fondo genético similar a un natural de la población, mediante la adición de Wolbachia-infectados hembras de colonias de laboratorio a las jaulas de los machos no infectadas derivados de huevos recogidos por ovitraps en el campo39, manteniendo la densidad prescrita de 500 individuos por población.
    1. Repita la exogamia para que por lo menos tres generaciones consecutivas producir colonias que son similar genéticamente a la población de campo39menos de 87.5%. Crítica: Asegurarse de que los sexos son correctos en esta etapa (ver paso 3.1).
  4. Hembra de Ae. aegypti son generalmente refractarios a otra inseminación dentro de horas del apareamiento50. Cuando exogamia colonias, permitir que las hembras y machos maduran en jaulas separadas durante dos días y luego aspirar las hembras en la jaula del macho proporcionar igualdad de oportunidades a todos los varones.

4. sangre de alimentación y oviposición

  1. Espere por lo menos tres días después de la última hembra surgió antes de sangre alimentación para permitir suficiente tiempo madurar. Sangre alimenta a las hembras dentro de dos semanas de emergencia para prevenir la mortalidad excesiva, particularmente para los mosquitos con infecciones de Wolbachia que afectar longevidad22,24,49. Retirar las tazas de azúcar el día antes de la alimentación para mejorar las tasas de alimentación.
    1. Pedir un voluntario para insertar su antebrazo en la jaula para permitir que los mosquitos femeninos alimentar. Mayoría de las hembras debe alimentar a saciedad dentro de 5 minutos, pero para reducir la selección contra alimentadores lento, dejar el antebrazo en la jaula durante 15 min, o hasta que todas las hembras están visiblemente engorged; un guante de látex para proteger la mano de las mordeduras es opcional pero recomendado.
    2. Dos días después de alimentarse de la sangre, colocar dos vasos de plástico que contiene agua de cría larval y forrado con una tira de papel de lija (figura 1) (o papel de filtro (figura 1 H)) en la jaula de las hembras a desovar. Parcialmente se sumerja la tira de papel de lija en el agua para mantenerlo húmedo. Eliminar otras fuentes de agua para evitar que las hembras pongan sus huevos fuera de la Copa de la oviposición.
      Nota: agua del grifo se puede utilizar en las tazas, pero fomenta la cría de larvas agua oviposición51,52 y las hembras pondrán sus huevos más síncrono.

5. huevo recogida y acondicionamiento

  1. Las hembras desovan en el papel de lija por encima de la línea de agua; recoger y reemplazar las tiras de papel de lija diariamente hasta que no se colocan más huevos. Tenga en cuenta que oviposición puede continuar por hasta una semana.
  2. Tiras de lija parcialmente seca frotando suavemente los sobre una toalla de papel para 30 s, teniendo cuidado de no para desalojar los huevos. Luego, envuelva las tiras en una hoja de toalla de papel y colóquelo en una bolsa de plástico sellable (figura 1I).
  3. Compruebe el estado de los huevos con un microscopio de disección (figura 3). Si tiras el papel de lija está demasiado húmedo, pueden eclosión de los huevos antes de ser sumergida en agua (figura 3B), pero si seca demasiado duramente, huevos pueden colapsar (figura 3).
  4. Los huevos pueden ser rayitas en cualquier momento más allá de la colección después de tres días; eclosionan todos los huevos de cada colonia, recogidos a través de todos los días, en el mismo contenedor de agua para asegurar que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar de los individuos.
  5. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los huevos en un recipiente cerrado a una humedad alta (> 80%) en alrededor de 20 ° C. En estas condiciones, huevos sin Wolbachia pueden almacenarse durante varios meses manteniendo alta Portilla tarifas53,54.
  6. Como algunas infecciones de Wolbachia reducen enormemente la viabilidad de huevos de edad49,55, eclosionan los huevos de Wolbachia-infectados líneas dentro de una semana de la colección para evitar la mortalidad excesiva de los cepas. Sangre alimenta a las hembras otra vez después de una semana si se necesitan huevos.
DíaPaso
0Huevos de Portilla
1Conteo de larvas en las bandejas
7Transferencia de larvas y pupas a jaulas de Colonia
17Alimentación de hembras adultas de la sangre
21Comenzar a colectar huevos
25Final, recolección de huevos
28Huevos de Portilla

Tabla 1: Resumen del programa de mantenimiento de Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. La sincronización de la hembra alimentan de sangre y la eclosión de los huevos es flexible, pero deben evitarse largas duraciones en estas etapas, particularmente para los mosquitos infectados con Wolbachia, con el fin de minimizar la mortalidad. Siguiendo este esquema minimiza la selección contra los mosquitos que son rápidos o lentos para desarrollar y madurar en todas las etapas de la vida, siempre y cuando las larvas se alimentan de óptimo.

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Figura 1: Equipo utilizado para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio. (A) envases de plástico utilizados para huevos para incubar o criar larvas con cantidades de 500, 750 y 5.000 mL (de izquierda a derecha). (B) bandejas usadas para la cría de larvas en una densidad controlada, generalmente de 500 larvas en 4 L de agua. (C) 19.7 L y (D) L 3 jaulas utilizados para los adultos de la vivienda. Una densidad de adultos de 25 o menos por litro debe ser mantenido para proporcionar suficiente espacio. (E) taza de 35 mL con algodón húmedo proporcionado como una fuente de agua para adultos. (F) taza de 35 mL con solución de sacarosa proporcionada a través de un cable o mecha dental como una fuente de azúcar. (G–H) Tazas con agua de cría larval y alineado con un sustrato de oviposición de papel de lija o papel de filtro (G y H, respectivamente). () Cierre de cremallera bolsa para almacenamiento de las tiras de papel de lija o papel de filtro. Puntos negros en la papel de lija son huevos de mosquito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Lateral (A) y dorsales (B) vistas de pupas y adultos Ae. aegypti (C) demostrar su dimorfismo sexual. Los machos se colocan a la izquierda y las hembras a la derecha de cada panel. Cuando se alimenta óptimamente, pupas de machos y hembras se diferencian por tamaño; las hembras son más grandes que los machos (A) y tienen un cefalotórax con bulbo relativamente en comparación con los machos que tienen caras planas (B). Adultos masculinos se distinguen fácilmente de las hembras en todas las condiciones de cría, sobre todo por sus antenas plumosos y largos palpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Cuatro días de edad huevos de Ae. aegypti en condiciones diferentes. Intactos (A) huevos en tiras de papel de lija, mantenidas a una humedad alta (> 80%) pero sin ninguna humedad visible. Tipos de Hatch deben ser sobre el 90% de tipo salvaje Ae. aegypti si mantiene correctamente. (B) huevos que eclosionan antes de ser sumergida en agua (eclosión precoz) se distinguen por una tapa de huevo individual y visible de la larva. Esto indica que la tira de papel de lija se mantiene demasiado húmeda. Huevos (C) que se secan demasiado severamente pueden colapsar y son claramente visibles por su apariencia cóncava. Si la lija se convierte en rígido también indica que los huevos sean demasiado secos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Figura 4 muestra los efectos de la nutrición subóptima en el desarrollo de larvas de Ae. aegypti . Cuando contenedores cuentan con 0,25 mg de alimento por larva por día o menos, aumenta el tiempo de desarrollo para hombres y mujeres, y menos sincrónico que en contenedores cuenta con 0.5 mg de alimento. Si no se proporciona alimentación adecuada durante toda la duración del desarrollo larvario, esto podría tener un impacto adverso en el program...

Discusión

Siguiendo el protocolo que presentamos para el mantenimiento de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deben garantizar que los mosquitos sanos de una calidad constante se producen para los experimentos y abren notas de campo. A diferencia de otros protocolos que prioricen la producción de grandes cantidades de mosquitos (véase la referencia57), los métodos se centran en maximizar su aptitud, tanto dentro de las generaciones mediante la implementación de las condiciones de cría re...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Reconocemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina y Clare Doig por sus contribuciones al desarrollo de nuestros métodos de mantenimiento de la Colonia y Johnson tres revisores anónimos por sus sugerencias que ayudaron a mejorar el manuscrito. Nuestra investigación es apoyada por un programa de subvención y beca de AAH del nacional salud y donación de Consejo de investigación médica y una traducción de la Wellcome Trust. PAR es un recipiente de un australiano gobierno investigación beca programa de formación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Wild type Aedes aegyptiCollected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegyptiProvided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegyptiProvided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegyptiProvided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeastLowanStimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tubQuadrantQ110950Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)Tetra16152Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containersUsed for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipetteUsed for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counterRS Pro710-5212Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing traysGratnellsUsed for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon meshUsed to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
CagesBugDormDP1000Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cupHuhtamakiAA272225Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lidHuhtamakiGB030005Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton woolCutisoft71841-13Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White SugarProvided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
RopeM Recht AccessoriesC323C/WUsed to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large)Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
SandpaperNorton Master PaintersCE015962Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paperWhatman1001-150Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex glovesSemperGuardZ560979Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

Referencias

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