שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Summary

Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia שוחררו לאוכלוסיות טבעי לדכא את השידור של arboviruses. אנו מתארים שיטות האחורי Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia במעבדה ניסויים ולשחרר שדה, נקיטת אמצעי זהירות כדי למזער את עיבוד מעבדה ובחירה.

Abstract

Aedes aegypti יתושים נגועים השפעול Wolbachia מנוצל ב תוכניות כדי לשלוט על התפשטות arboviruses כגון קדחת דנגה, chikungunya Zika. Wolbachia-יתושים נגועים יכול להשתחרר לתוך השדה גם להפחית את אוכלוסיית גדלים באמצעות matings לא תואמת או להפוך אוכלוסיות עם יתושים המהווים עקשן וירוס שידור. אסטרטגיות אלו להצליח, היתושים שוחרר לתוך השדה מהמעבדה חייב להיות תחרותי עם יתושים מקורית. עם זאת, שמירה על יתושים במעבדה יכול לגרום נישואי קרובים, סחף גנטי, עיבוד מעבדה אשר יכול להפחית את הכושר שלהם בתחום עשויים לבלבל את התוצאות של ניסויים. כדי לבדוק את התאמתו של זיהומים שונים Wolbachia לפריסה בשטח, זה הכרחי לשמור על יתושים בסביבה מעבדתית מבוקרת על פני דורות רבים. אנו מתארים פרוטוקול פשוטים לשמירה על יתושים Ae. aegypti במעבדה, אשר מתאים הן Wolbachia-יתושים נגועים ופראי-סוג. השיטות למזער מעבדה הסתגלות וליישם outcrossing כדי להגביר את הרלוונטיות של ניסויים כדי שדה יתושים. בנוסף, מושבות נשמרים בתנאים אופטימליים כדי למקסם את הכושר שלהם עבור מהדורות בשטח פתוח.

Introduction

Aedes aegypti יתושים אחראים להעברת חלק arboviruses החשוב ביותר בעולם, לרבות קדחת דנגה, Zika ו- chikungunya¹. וירוסים אלה הופכים איום גובר על הבריאות העולמי ההתפלגות הנפוצה של Ae. aegypti באזורים הטרופיים ממשיך להרחיב את^2,3,4. נקבה Ae. aegypti מעדיפים ניזונים דם אנושי⁵ , ולכן נוטים בקרבה לבני אדם, במיוחד באזורים עירוניים איפה אוכלוסיות הצפופים ביותר. באמצעות הקשר הזה קרוב עם בני אדם הם הסתגלו גם להתרבות בבתי גידול מלאכותיים, כולל צמיגים, סירים, מרזבים מים טנקים^6,7. Aegypti Ae. גם ברצון להתאים לסביבות מעבדה שבה הם יכול להישמר ללא כל דרישות מיוחדות לאחר איסוף ישירות מהשדה, בניגוד כמה מינים אחרים סוג אאדס ^{8, 9,10}. שלהם קלות התחזוקה ראה אותם למד נרחב במעבדה במגוון רחב של תחומים, בסופו של דבר במטרה לשלוט היתושים מחלות יכולה לשדר.

באופן מסורתי, arboviral שליטה מתבסס בעיקר על שימוש חומרי הדברה כדי להפחית אוכלוסיות יתוש. עם זאת, יש עניין גובר על גישות בהם יתושים ששונה גדלו במעבדה, ואז שוחרר לאוכלוסיות טבעי. היתושים שפורסמו עשוי להיות שונה גנטית^11,12,13, ביולוגית^14,15, דרך הקרנה¹⁶, טיפול כימי^17,18, או עם בשילוב טכניקות¹⁹ לדכא אוכלוסיות של יתושים או להחליף אותם עם יתושים כי הם דברים מעוותים שידור arboviral²⁰.

Wolbachia הם חיידקים כיום בשימוש כסוכן הדברה ביולוגית של arboviruses. זנים שונים של Wolbachia שהוכנסו לאחרונה Ae. aegypti השפעול באמצעות עובריים microinjection^21,22,23,24. זנים אלו להפחית את היכולת של arboviruses להפיץ, לשכפל, היתוש, הולכת ופוחתת שלהם שידור פוטנציאליים^{23,25,26,27,28} . זיהומים Wolbachia מועברים מאמא לצאצאים, אולם זנים מסוימים לגרום עקרות כאשר נגוע זכרים להזדווג עם נקבות נגוע²². Wolbachia-זכרים הנגוע ולכן יכול להיות משוחרר בכמויות גדולות כדי לדכא אוכלוסיות יתושים טבעי, הפגין לאחרונה^15,מינים אחרים אאדס ²⁹. עם זאת, מאז Wolbachia לעכב גם שידור arboviral ב Ae. aegypti, יתושים יכולים גם להשתחרר כדי להחליף את אוכלוסיות מקומיות וקטורים עניים. Ae. aegypti השפעול נגוע Wolbachia עכשיו שוחררו בתוך השדה במספר מדינות באמצעות זה הצגנו^14,30,31.

Wolbachia-גישות מבוססות עבור פקד arboviral להסתמך על הבנה צליל של האינטראקציות בין Wolbachia, היתוש ואיכות הסביבה. Wolbachia להתרחש באופן טבעי במגוון רחב של חרקים, זנים מוחדרים יתושים מגוונים ב שלהם אפקטים³². כמו סוגים חדשים של זיהום Wolbachia הם מוחדרים Ae. aegypti²⁴, זה הכרחי לאפיין כל אסנן והשפעותיהם על כושר יתושים, רבייה, הפרעה arboviral תחת מגוון תנאים. ניסויים קפדניות במעבדה ולכן נדרש להעריך את פוטנציאל Wolbachia זנים להצליח בתחום.

שדה פתוח מהדורות של Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia יכול לעיתים קרובות דורשים אלפי עד עשרות אלפי יתושים לפי אזור שחרור להיות גדלו כל שבוע^14,30,31. ניתן לשפר את ההצלחה של מהדורות הראשונית על ידי שחרור יתושים בגודל גדול להגדיל את פוריות³³ ,^34,הצלחה³⁵ההזדווגות שלהם. היתושים צריך גם להתאים את התנאים שהם יחוו בשטח, אולם לטווח ארוך מעבדה לגידול עלולה לגרום לשינויים בהתנהגות, פיזיולוגיה אשר יכול להשפיע על שדה ביצועים^{36,37, 38}.

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לגידול Ae. aegypti במעבדה בעזרת ציוד בסיסי. פרוטוקול זה מתאים הן פראי-סוג של Wolbachia-נגוע היתושים, שהאחרון שבהם תוכל לדרוש תשומת לב מיוחדת כמו כמה זנים Wolbachia יש השפעות משמעותי על יתושים חיים-היסטוריה תכונות^{39, 40}. התנאים rearing למנוע צפיפות יתר ותחרות לאוכל לייצר יתושים בגודל אחיד, אשר הוא קריטי עבור וקטור כשירות וניסויים כושר, והוא מבטיח היתושים יהיו בריאים לשחרור שדה⁴¹ . אנחנו גם לוקחים אמצעי הזהירות האפשריים כדי למזער את עיבוד מעבדה ואת נישואי קרובים על-ידי הפחתת לחצים בררניים, להבטיח כי הדור הבא נדגמים מתוך מאגר גדול, אקראי. עם זאת, סביבות מעבדה הן שונה במובהק מתנאי שדה, תחזוקה לטווח הארוך בתנאים רגועים יכול להפחית את הכושר של יתושים עם שחרורם לתוך שדה^37,42,43 . לכן נחצה נקבות משורות מעבדה זכרים שנאספו שדה מעת לעת, וכתוצאה מכך המושבות אשר דומים גנטי להשוואות ניסיוני, שהם להתאים יעד אוכלוסייה של שדה³⁹. השיטות אינן דורשות שום ציוד מיוחד, וניתן לשנותם האחורי עשרות אלפים של אנשים בכל שבוע עבור שדה לעיתונות. הפרוטוקול קובע סדר עדיפויות של גם בחדר הכושר של יתושים בתוך ועל -פני דורות, שיקול חשוב עבור חרקים המיועדים הממסד באוכלוסיות טבעיות. הפרוטוקול מתאים ברוב מעבדות הדורשים תחזוקה של Ae. aegypti, במיוחד להשוואות ניסיוני איפה חשובים איכות עקבית של יתושים, relatability לשדה.

Protocol

דם האכלה של יתושים בנושאים האנושית אושרה על ידי אוניברסיטת מלבורן ועדת האתיקה האנושית (אישור #: 0723847). כולם מתנדבים בתנאי הודיע הסכמה בכתב.

1. זחל לגידול

הערה: יתושים נערכים 26 ± 0.5 ° C ו- 50-70% לחות יחסית, עם photoperiod h (בהירה: כהה) 12:12 עבור פרוטוקול תחזוקה זה המושבה. תנאים אלה דומים הממוצע לתנאי האקלים באוסטרליה, קיירנס, בטווח תרמי מיטבי עבור Ae. aegypti הישרדות, פיתוח^44,45,46. טמפרטורות גבוהות יכול לגרום לאובדן של זיהומים Wolbachia מן המושבות נגד יתושים, נמנעה⁴⁷. אנו מקפידים על יחידים לפחות 500 לכל האוכלוסייה כדי למזער את נישואי קרובים; שמירה על מושבות של גודל קטן יותר יכולות להיות השלכות כושר [רוס. et al. לא פורסם]. תחת תנאים אלו בהנחה תזונה נאותה, הזמן הדור הממוצע הוא 28 ימים (ראה טבלה 1).

1. להטביע את הביצים על המצע במגשים (איור 1 א') המכיל 3 לליטר מים (מים אוסמוזה הפוכה או מי ברז בגילאי, שנוצר על ידי השארת ברז במגשים עבור 24 שעות לפני השימוש), ~ 300 מ"ג מזון דגים (אחד כתוש לוח, ראה טבלה של חומרים) ו- a כמה גרגרי שמרים יבשים פעילים לזירוז הבקיעה⁴⁸.
2. יום אחד לאחר הבקיעה, להשתמש פיפטה מזכוכית כדי להעביר כ 500 הזחלים המגשים המכילים 4 ליטרים של מים (איור 1B), נחשב באמצעות מונה השלט. להוסיף שתי טבליות מזון דגים כתוש בכל מגש. אם יש צורך, להשתמש מיכלים בגדלים שונים לגידול הזחלים (איור 1 א'), אך לשמור על צפיפות זחל מתחת הזחלים 0.5/mL כדי למנוע צפיפות יתר.
3. בדוק את המגשים מדי יום כדי לוודא הזחלים אין די מזון; להוסיף כ שתי טבליות מזון המגשים בכל יומיים. לספק מזון ad libitum אך להבטיח 0.5 מ"ג ליום/זחל הינו זמין במהלך תקופה זו כדי להבטיח פיתוח באופן סינכרוני ועל גוף בגודל מתאים, אחרת עלול להיות מבולבל את התוצאות של הניסויים (ראה תוצאות נציג).
4. לטפל כדי למנוע את overfeeding של הזחלים, במיוחד בתוך מכולות גידול קטן יותר עם פחות מים פני השטח והנפח. אם המים נראה מעונן או אם יש תמותה זחל משמעותית, להחליף אותו עם מים מתוקים; התמותה צריך להיות זניחה אם הזחלים ניזונים בצורה אופטימלית.

2. הבוגרים

הערה: הזחלים יתחיל pupate של חמישה ימים לאחר הבקיעה אם שתאכל היטב, הרוב צריך pupate על ידי שבעה ימים לאחר הבקיעה. מבוגרים יתחיל המתעוררים כ יומיים לאחר להתגלמות אם מתוחזק בצורה אופטימלית בטמפרטורה 26 ° C (ראה תוצאות נציג). התפתחות הזחל אינו מושפע בדרך כלל על ידי זיהומים Wolbachia כאשר מזון מסופק^39,23,49.

1. שבעה ימים לאחר הבקיעה שופכים את כל התוכן של המגש דרך רשת קנס (נקבוביות בגודל 0.4 מ מ). לשמור את הזחל מים מסוננים לשימוש מאוחר יותר ovicups (ראו סעיף "דם האכלה, הטלה"). להפוך את רשת השינוי וטובל לתוך מיכל פלסטיק עם 200 מ של מים כדי להעביר את הגלמים. לספק מזון נוסף אם יישארו כל הזחלים.
2. הכינו את הכלובים הבוגרים (איור 1C) על ידי מתן שתי כוסות 10% סוכרוז הפתרון (איור 1F) שתי כוסות צמר גפן לחה כדי למנוע לייבוש (איור 1E).
3. אם הגלמים אין צורך למיין לפי מין, למקם את המכולות מכסה של הגלמים לתוך הכלוב ולא להשאיר את המכסה במקצת כדי לאפשר המבוגרים להסתמן לתוך הכלוב. לחלופין, הצב של משפך מהופך מעל המיכל כדי למזער את טובעת. ודא שכולנו מבוגרים הופיעו לפני הסרת הגורם המכיל מן הכלוב כדי למנוע בחירה נגד המפתחים איטי.

3. הגולמי סקסיייי עבור Outcrossing

1. אם הגלמים צריך להיות ממוין לפי מין (למשל, עבור outcrossing), pipette הגלמים מ מגשים זחל ולהפריד בין המינים (איור 2) לתוך מיכלי פלסטיק (איור 1 א') עם 200 מ של מים בכל 24 שעות עד המספר הרצוי מכל מין הגיעה. במקום המכסים על המכולות ולהשאיר אותן סגורות.
2. מבוגרים יתעוררו לתוך המכולות; לאשר את מינם לפני שחרור לתוך הכלובים (איור 2C). הסר מבוגרים למינים באופן שגוי עם העצמות בתוך 24 שעות של הופעתה לפני שהם מגיעים לבגרות מינית. ברגע המינים אושרו, שחרור המבוגרים לתוך הכלובים כל 24 שעות.
3. להשיג Wolbachia-נגועים מושבות רקע גנטי דומה לאוכלוסייה הטבעית, outcross על-ידי הוספת Wolbachia-נגוע הנקבות מן המושבות מעבדה לכלובים של הזכרים נגוע נגזר מן הביצים שנאספו על ידי ovitraps ב שדה³⁹, שמירה על הצפיפות שנקבעה של יחידים 500 לכל האוכלוסייה.
   1. חזור על outcrossing לפחות שלושה דורות רצופים לייצר מושבות דומה גנטית האוכלוסייה שדה³⁹לפחות 87.5%. קריטית: להבטיח כי המינים נכונים בשלב זה (ראה שלב 3.1).
4. נקבה aegypti Ae. הם בדרך כלל דברים מעוותים הזרעה נוספת בטווח של הזדווגות⁵⁰שעות. כאשר outcrossing מושבות, מאפשרים את נקבות וזכרים בוגרים בכלובים נפרדים במשך יומיים, ואז האחות הנקבות לתוך הכלוב זכר לספק הזדמנות שווה כל הזכרים.

4. דם האכלה, ההטלה

1. המתן לפחות שלושה ימים לאחר שהנקבה האחרונה התפתחה לפני דם האכלה כדי לאפשר מספיק זמן להבשיל. דם להאכיל הנקבות תוך שבועיים של הופעתה כדי למנוע תמותת יתר, במיוחד עבור יתושים עם זיהומים Wolbachia המשפיעים לרעה על אריכות ימים^22,24,49. הסר את כוסות סוכר ביום שלפני האכלה כדי לשפר את שיעורי האכלה.
   1. בקש מתנדבים כדי להוסיף את האמה שלהם לתוך הכלוב כדי לאפשר את היתושים הנשי להאכיל. רוב הנקבות צריך להאכיל כסיגנל בתוך 5 דקות, אבל כדי לצמצם את הבחירה נגד מזיני איטי, להשאיר האמה בכלוב במשך 15 דקות, או עד כל הנשים מתפקעים בעליל; כפפת לייטקס על היד מפני עקיצות הוא אופציונלי אך מומלץ.
   2. יומיים לאחר דם האכלה, מניחים שתי כוסות פלסטיק המכיל הזחל מים לגידול והעמידו עם רצועת נייר זכוכית (איור 1 ג'י) (או נייר סינון (איור 1 H)) לתוך הכלוב לנקבות להטיל ביצים. חלקית להטביע את רצועת נייר זכוכית במים כדי לשמור על לחות. הסר את מקורות אחרים של מים כדי למנוע הנקבות הנחת את ביציהן בחוץ בגביע ההטלה.
      הערה: ניתן להשתמש במי ברז בגביע, אבל חינוך הזחל מים מעודדת ההטלה^51,52 , הנקבות להטיל את ביציהם יותר באופן סינכרוני.

5. ביצה אוסף, מיזוג

1. הנקבות להטיל ביצים על מה בדיוק מעל קו המים; לאסוף ולהחליף את הרצועות של נייר זכוכית מדי יום עד אין יותר הביצים מוטלות. הערה שהטלה הזה עשוי להמשך עד שבוע.
2. סביר להניח שאני חלקית יבש רצועות על ידי בעדינות סופג אותן על מגבת נייר ל 30 s, מטפל לא להוציא את הביצים. לאחר מכן, לעטוף את הרצועות בסדין של מגבת נייר יבש ומניחים אותו לתוך שקית ניילון sealable (איור 1I).
3. בדוק את המצב של הביצים במיקרוסקופ ויבתר (איור 3). אם רצועות נייר זכוכית הם רטובים מדי, ייתכן בוקעות לפני להיות שקוע בתוך המים (איור 3B), אבל אם מיובש בקשיחות, ביצים עשויה לקרוס (איור 3C).
4. הביצים ניתן לתכנון בכל עת מעבר אוסף שלאחר שלושה ימים; יבקעו כל הביצים מהמושבה לכל, שנאספו לרוחב כל הימים, באותה אריזה של מים על מנת להבטיח כי הדור הבא נדגמים מתוך מאגר גדול, אקראית של אנשים.
5. לאחסון לטווח ארוך, לשמור את הביצים בתוך מיכל חתום על לחות גבוהה (> 80 אחוז) בסביבות 20 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה, ניתן לאחסן ביצים ללא Wolbachia במשך מספר חודשים תוך שמירה על הפתח גבוהה המחירים^53,54.
6. כמו כמה זיהומים Wolbachia לצמצם במידה ניכרת את הכדאיות של ביצים עם גיל^49,55, לדגור על הביצים מפני Wolbachia-נגוע קווים בתוך שבוע אחד של אוסף כדי למנוע תמותה מופרז עבור הרלוונטי זנים. דם להאכיל הנקבות שוב אחרי שבוע אם ביצים יותר יש צורך.

היום	שלב
0	הפתח ביצים
1	ספירת הזחלים במגשים
7	להעביר את הזחלים, גלמי המושבה בכלובים
17	דם להאכיל בוגרות
21	בגין איסוף ביצים
25	סיום איסוף ביצים
28	הפתח ביצים

טבלה 1: סקירה של לוח הזמנים תחזוקה של המושבה Ae. aegypti בגיל 26 מעלות צלזיוס העיתוי של הדם-ההזנה הנשי, את הבקיעה ביצים הוא גמיש, אבל המשכים ארוכים בשלבים אלה יש להימנע, במיוחד עבור יתושים נגועים Wolbachia, על מנת לצמצם את התמותה. בעקבות לוח זמנים זה ממזער את הבחירה נגד יתושים המהווים מהירה או איטית לפתח או בוגר בכל שלבי החיים, ובלבד הזחלים ניזונים בצורה אופטימלית.

איור 1: ציוד המשמש לגידול Ae. aegypti במעבדה. מיכלי פלסטיק (א), המשמש עבור ביצים או לגידול הזחלים עם אמצעי אחסון של 500, 750 ו- 5,000 mL (משמאל לימין). מגשים (B) המשמש לגידול הזחלים על צפיפות מבוקרת, בדרך כלל 500 הזחלים ב- 4 ליטרים של מים. (ג) 19.7 L ו- (D) 3 L כלובים המשמש עבור דיור למבוגרים. צפיפות של מבוגרים 25 או פחות לליטר צריך להישמר לספק מספיק שטח פנוי. (E) 35 מ ל כוס עם צמר גפן לח סיפק כמקור מים למבוגרים. (F) 35 מ ל גביע עם סוכרוז פתרון מסופקים באמצעות כבל או הפתיל שיניים כמקור של סוכר. (HG–) כוסות מלאות מים לגידול זחל, הרצוף המצע ההטלה של נייר זכוכית או נייר סינון (G ו- H, בהתאמה). (אני) Zip-lock תיק לאחסון של רצועות נייר זכוכית או נייר סינון כתמים שחורים על נייר זכוכית הם יתושים ביצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: לרוחב (א) ו הגבי (ב) נופים של הגלמים למבוגרים Ae. aegypti (ג) הממחיש את דו-צורתיות. זכרים ממוקמות בצד ימין וגם נקבות מצד ימין של כל לוח. כאשר מוזן באופן מיטבי, גלמי זכרים ונקבות נבדלים על ידי גודל; הנקבות גדולות מן הזכרים (A) ויש cephalothorax בולבוסי יחסית לעומת גברים אשר יש צדדים להחמיא (B). גברים מבוגרים הם בקלות להבחין בין הנקבות בתנאים rearing כל, בעיקר על ידי שלהם אנטנה plumose, קאלאמרי ארוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. בן יום ארבע ביצים Ae. aegypti בתנאים שונים. (א) Intact משפיעה על רצועות נייר זכוכית לשמור על לחות גבוהה (> 80 אחוז) אך ללא לחות לעין. המחירים הפתח צריך להיות מעל 90% עבור פראי-סוג Ae. aegypti אם יתוחזק כראוי. ביצים (B) שבוקעים לפני להיות שקוע במים (הבקיעה מפותחת) נבדלים על ידי קאפ מנותקת ביצה זחל גלוי. אפשרות זו מציינת כי רצועת נייר זכוכית נשמר לח מדי. ביצים (C) עוברות ייבוש תלגמי עלול לקרוס, הם נראים בבירור על ידי מראה קעורה שלהם. אם סביר להניח שאני הופכת נוקשה זה גם מציין כי הביצים עשוי להיות יבש מדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תוצאות

איור 4 ממחישה את ההשפעות של תזונה שיוצרת על הפיתוח של Ae. aegypti הזחלים. מתי מכולות מסופקים עם 0.25 מ ג של מזון לכל זחל ליום או פחות, מגביר את קצב ההתפתחות עבור זכרים ונקבות, סינכרונית פחות מאשר במיכלים מסופק עם 0.5 מ ג של מזון. אם במזון הולם זה אינו מסופק בכל מש?...

Discussion

בעקבות פרוטוקול המובאת כאן לשם קיום Wolbachia-נגועים aegypti Ae. עליך לוודא כי יתושים בריא איכות עקבית מיוצרים לניסויים, פתח שדה לעיתונות. בניגוד פרוטוקולים אחרים זה סדר עדיפויות בייצור המוני כמויות היתושים (ראה התייחסות⁵⁷), השיטות הם התמקדו למקסם את הכושר שלהם, הן בתוך דורות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wild type Aedes aegypti			Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti			Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti			Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti			Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast	Lowan		Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub	Quadrant	Q110950	Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)	Tetra	16152	Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers			Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette			Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter	RS Pro	710-5212	Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays	Gratnells		Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh			Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages	BugDorm	DP1000	Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup	Huhtamaki	AA272225	Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid	Huhtamaki	GB030005	Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool	Cutisoft	71841-13	Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar			Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope	M Recht Accessories	C323C/W	Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large)			Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper	Norton Master Painters	CE015962	Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper	Whatman	1001-150	Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves	SemperGuard	Z560979	Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/