Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Resumen

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Resumen

La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria causada por Trypanosoma cruzi, cuya movilidad no es sólo importante para la localización, sino también para la Unión celular y la invasión. Actuales modelos animales para el estudio de T. cruzi permitan una observación limitada de parásitos in vivo, que representa un reto para la comprensión de la conducta parásito durante las etapas iniciales de la infección en seres humanos. Este protozoo tiene una etapa flagelar en vectores y huéspedes mamíferos, pero no existen estudios que describen su motilidad en vivo. El objetivo de este proyecto fue establecer un modelo de pez cebra vertebrado vivo para evaluar motilidad de T. cruzi en el sistema vascular. Pez cebra transparente larvas fueron inyectadas con fluorescencia etiquetada tripomastigotos y observado mediante microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (LSFM), un método no invasivo para visualizar organismos vivos con óptico de alta resolución. Los parásitos podrían visualizarse durante largos períodos de tiempo debido al riesgo relativamente bajo de la técnica de fotodaño en comparación con el confocal o microscopía de epifluorescencia. Parásitos de T. cruzi fueron observados en el sistema circulatorio del pez cebra vivo en vasos de diferentes tamaños y la yema. Podría también verse atado a la pared del saco vitelino y a la válvula aurículo-ventricular a pesar de las fuertes asociados con las contracciones del corazón. LSFM de T. cruzi-larvas de pez cebra inoculado es un método valioso que puede utilizarse para visualizar parásitos de la circulación y evaluar su tropismo, patrones de migración y movilidad en el ambiente dinámico del sistema cardiovascular de un animal vivo.

Introducción

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoo cruzi del T.. Aproximadamente de 6 a 7 millones de personas en todo el mundo están infectadas con T. cruzi. La enfermedad se transmite principalmente en América Latina, pero se ha divulgado en los Estados Unidos, Canadá y muchos Europeo así como algunos países del Pacífico occidental, principalmente debido a la migración de personas infectadas¹. Chagas es en gran parte transmitidas por vectores y transmisión a los seres humanos por contacto con heces de insectos hematophagic en la subfamilia Triatominae, conocido comúnmente como "vinchucas". Sin embargo, T. cruzi también puede transmitirse mediante transfusiones de sangre, transferencia vertical de madre a hijo, o la ingestión de alimentos contaminados con parásitos². La fase aguda de la infección es principalmente asintomático o sintomático constitutivamente y dura de 6 a 8 semanas, después de que compromiso del sistema inmune controla la carga del parásito, pero no eliminar completamente la infección³. Mayoría de las personas entonces entrar en una fase crónica asintomática; sin embargo, casi 30% de los pacientes desarrollan una fase crónica sintomática, en el cual el sistema cardiaco y con menos frecuencia el digestivo y sistema nervioso están comprometido⁴. Este escenario presenta un reto para el control y tratamiento de la enfermedad ya que hay no hay vacunas disponibles, existen sólo dos medicamentos eficaces para Chagas: benznidazol y nifurtimox. Ambos tratamientos requieren la administración prolongada y pueden tener graves efectos secundarios².

Mayor comprensión del comportamiento de T. cruzi comportamiento en vivo es clave para determinar la migración parasitaria, accesorio de celular e invasión en el anfitrión; la falta de modelos en vivo limita el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Estudios in vitro de infección por T. cruzi han demostrado que la motilidad de tripomastigotos es importante por la Unión a membranas de la célula huésped y la posterior invasión celular⁵. Agotamiento de la energía en tripomastigotos en co-cultivo con una línea celular susceptible se ha demostrado para reducir la invasión celular⁶. Curiosamente, en trypanosomátidos, movimiento flagelar también se ha caracterizado como un mecanismo de evasión contra anticuerpos específicos del parásito⁷.

La motilidad flagelar ha sido extensivamente estudiado en vitro en Trypanosoma brucei, un parásito relacionado que causa la tripanosomiasis africana⁸. In vitro los estudios de la motilidad de estos tripanosomas demostraron que la simulación de las condiciones de la sangre o fluidos corporales, incluyendo la viscosidad y la presencia de obstáculos representativos de células sanguíneas, es importante para el movimiento hacia adelante del parásito⁹ . Como todavía no ha sido posible visualizar el movimiento de los parásitos en el torrente sanguíneo en vivo.

Las larvas de pez cebra son un poderoso modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno en vivo. Son pequeños, baratos y relativamente fáciles de criar en comparación con otros modelos vertebrados establecidos para enfermedad de Chagas. Pez cebra tienen sistemas inmunitarios innatos y adaptativos similares a los seres humanos, pero su sistema inmune adaptativo comienza a desarrollarse en 4 días post fecundación (dpf) y no es maduro para otras varias semanas¹⁰. Durante el desarrollo temprano, cuando sólo los macrófagos están presentes, hay una gran ventana para el estudio de comportamiento del parásito sin interferencia inmune inmediata¹⁰. Sin embargo, la mayor ventaja de utilizar larvas de pez cebra como modelo para estudiar el comportamiento patógeno vertebrado radica en su transparencia óptica, lo que los hace susceptibles para la investigación microscópica y proyección de imagen¹¹. Además, existen múltiples herramientas para manipular la genética de peces. Por ejemplo, la cepa de Casper es una línea mutante de pez cebra con ninguna pigmentación, haciendo el animal totalmente transparente y útil para la visualización de los órganos individuales y para seguimiento en tiempo real de las células inyectadas¹².

Una limitación clave de observación longitudinal de movimiento rápidamente parásitos en peces cebra vivo usando confocal o microscopía de epifluorescencia se encuentra en la imposibilidad de adquisición alta velocidad y profundidades de penetración grande con buena calidad de imagen y baja la proyección de imagen riesgo de fotoenvejecimiento. Ficha técnica de iluminación de la fluorescencia micsroscopy (LSFM) es una técnica emergente que supera estas limitaciones para permitir estas observaciones. Mediante el uso de uno de los objetivos para detectar la fluorescencia y un segundo objetivo de iluminación ortogonal que sólo se ilumina el plano focal del objetivo de detección, es posible obtener secciones ópticas de alta resolución en un microscopio confocal, pero con significativamente reducida fotodaño, incluso con respecto a la microscopía de epifluorescencia¹³. La técnica LSFM usada aquí se llama solo plano iluminación microscopia (SPIM), en el cual una hoja fina de la luz enciende un solo plano dentro de las larvas de pez cebra.

El objetivo de esta metodología es establecer larval pez cebra como modelo de infección no viable para la comprensión de la movilidad de T. cruzi y comportamiento relacionados con en vivo. Para lograr esto, se inyectaron larvas de pez cebra transparente con etiqueta fluorescente tripomastigotos, la forma celular responsable de la infección de seres humanos y se identificaron el movimiento de T. cruzi en la circulación cardiovascular del pez cebra utilizando LSFM.

Protocolo

los siguientes protocolos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Los Andes Universidad (CICUAL). Nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) directrices deben seguirse estrictamente para evitar la contaminación con el patógeno T. cruzi.

Nota: mantenimiento y cuidado de los animales: pez cebra Casper, una cepa genéticamente modificada de pez cebra (Danio rerio) se utiliza en el presente Protocolo debido a su transparencia óptica valiosa en todas las etapas del desarrollo. Peces son manipulados con atención óptima condiciones para la especie ¹⁴, en un 14 h luz-10 h oscuro ciclo a 28 ± 1 ° C, en un pH (7.0-7.4) controladas múltiples tanque recirculación agua sistema. Animales son alimentados dos veces al día con vivo Artemia (Artemia salina) y enriquecidos con alimento de cría. Todos los protocolos fueron aprobados por CICUAL en Universidad de los Andes (C.FUA_14-017).

1. preparación de huevo agua

1. preparar sal de acuario de 0.6 g/L en inversa ósmosis o agua desionizada (DI) y añadir azul de metileno 0,01 mg/L a la solución.
   Nota: La conductividad medida debe ser de 400-500 μS/cm y pH nivel en 7.2-7.9. Para bajar el pH, airear el agua del huevo durante unas horas.

2. Preparación de solución madre de Metanosulfonato

1. preparar 0,4% tricaine solución madre disolviendo 400 mg Metanosulfonato (MS-222), en 97,9 mL de agua destilada (ddH ₂ O). Después de que el polvo se ha disuelto completamente, ajustar el pH a 7.0 con 2,1 mL 1M Tris (pH 9.0) y refrigere la solución.

3. Preparación de 1.0% agarosa de bajo punto de fusión

1. disolver el polvo de agarosa de punto de fusión bajo en huevo agua a una concentración final de 1.0%. Calienta la mezcla en el microondas o en un plato caliente con agitación continua hasta que la solución de agarosa aparece homogénea.
2. Almacenar las alícuotas a 4 º C durante no más de una semana.

4. Ensayo y la colección embrionaria de apareamiento

1. tres días antes de las inyecciones de establece acoplamientos con parejas sanas de peces machos y hembras en los tanques de cría. Enriquecimiento con canicas de vidrio y plantas artificiales mejora de desove. Apareamientos deben ser durante la tarde y noche.
2. a la mañana siguiente, recoger los huevos enraícen por drenar el tanque a través de un colador y lavar los huevos con el agua del huevo. Eliminar todos los huevos por invertir el colador y verter agua huevo a través del tamiz en una placa Petri. Para mantener los embriones sanos, su agua limpia quitando cualquier suciedad y embriones muertos con una pipeta plástica.
3. Transferencia de los embriones en una incubadora a una temperatura estable de 28,5 ° C para permitir el desarrollo de los embriones según el pez cebra provisional normas ¹⁵. Examinar los embriones dos veces al día y descartar huevos inviable para mantener saludable el embrague.

5. Embrión Dechorionation

Nota: este procedimiento es necesario si los embriones no han incubado en el momento de la inyección. En este procedimiento, " las larvas " son animales fuera de su corion desde 48 h post fertilización (hpf) adelante.

1. En el día del experimento, colocar la placa Petri que contiene los embriones sanos bajo un estereoscopio disección.
2. Tome extremos opuestos del corión con dos pinzas afiladas (Dumont #5), y suavemente rasgar y tirar abren el corion. Son imágenes de unos 5-6 larvas se inyectan a la vez y por lo general 3-4.
3. Quitar las chorions de agua usando una pipeta de transferencia.

6. Preparación de Material de inyección

1. preparar 1.0 mm agujas con Capillares de vidrio de paredes delgadas y un dispositivo de tirador de la micropipeta con la siguiente configuración: 2 pesos ligeros 1 peso pesado, tirón superior 2 mm + 5 mm fondo pull, 75,9 ° C (paso 1) + () de 78,2 ° C Paso 2). Almacenar las agujas en un plato de Petri en una tira de plastilina. La aguja ideal debe tener una punta estrecha, como T. cruzi medir aproximadamente 20 x 1-3 μm y pasar fácilmente a través de la aguja. Puede variar la longitud de la punta: una punta más larga es útil para llegar a estructuras más profundas, pero una extremidad más corta será más rígida, facilitando la inyección para el usuario.
   Nota: El tamaño de la punta de la aguja depende de la temperatura: una temperatura elevada para el paso 2 resulta en una punta más fina y más.
2. Preparar una solución de agarosa al 1,5% en ddH ₂ O y viértalo en un plato de Petri de 10 cm. Cubrir una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.
3. Colocar un molde prefabricado microinyección sobre la agarosa y déjelo solidificar.
4. Levantar el molde prefabricado microinyección hacia fuera y añadir agua de huevo para el almacenamiento a 4 ° C. Esto evita que la agarosa se sequen.
5. Huevo de agregar agua a la solución a una concentración final de 150 mg/L. tienda 4 Metanosulfonato ° C.

7. Cultivo de células para el crecimiento del parásito

1. parásitos se mantienen en una línea celular de astrocitoma humano (CRL-1718) usando el método descrito por Vargas Zambrano et al. ¹⁶
2. iniciar el cultivo de células humanas en un frascos de cultivo T25 (superficie = 25 cm ²) con una densidad de 2 x 10 ⁵ o 4 x 10 ⁵ células en 4 mL de Medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal de ternero (FCS), complementado con 2 mM L-glutamina, 4,5 g/L glucosa, 10 mM HEPES, piruvato de 1 mM y 1% de penicilina-estreptomicina (referido como " completar los medios de comunicación "). Incubar los cultivos de astrocitoma a 37 ° C en un 5% CO ₂ ambiente.
3. Una vez una monocapa confluente, separar las células con 2 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por incubar 3 min a 37 ° C. visualmente Verifique las células para la separación y bloquear la solución de tripsina usando 3 mL de RPMI-1640 con 10% FCS en un tubo de 15 mL.
4. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 1.350 x g.
5. Lavar el pellet celular resultante en medio DMEM en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g a 22 ° C.
6. Contar las células manualmente en una cámara de Neubauer y Compruebe la viabilidad en un microscopio óptico a 40 aumentos.
7. Resuspendió suavemente el celular pellets en 4 mL de medio completo y utilizarlo para crear nuevos cultivos celulares utilizando 2 x 10 ⁵ células cada frasco de cultivo T25.

8. T. cruzi cultura y etiquetado

1. parásitos son una cepa originalmente obtenido de un humano infectado y caracterizado como cepa de T. cruzi DA (MHOM/CO/01/DA), genotipo TcI unidad discreta de tipificación (DTU) ¹⁶. Después de 3 o 4 días de cultivo, recoger los parásitos móviles en el sobrenadante de cultivo celular humano astrocytoma y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g. descartar el medio.
   Nota: Los parásitos en el medio completo pueden utilizarse para volver a la cultura en una proporción 1:1 con las células de astrocitoma en frascos de cultivo T25.
2. Suavemente vuelva a suspender el sedimento en 10 mL estéril 1 x de Buffer de fosfato salino (PBS) con 0.1% de FCS y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de PBS. Tomar 10 μL para contar los parásitos nadan libremente en una cámara de Neubauer.
4. El resto de los parásitos suspendidos de nuevo (990 μL) y añadir 1 μl de Carboxyfluorescein Diacetato de SuccinimiDYL éster (CFSE), concentración final 5.0 μm. Incubar 10 min a temperatura ambiente.
   Nota: CFSE 5 mm debe ser alícuotas y mantenidos a -20 ° C.
5. De la pelotilla de los parásitos (1.350 x g, 5 min). Reconstituir la pelotilla del parásito por sacudiendo el tubo y lávela en 10 mL de 1 x PBS-0.1% FCS seguidos de un exprimido posterior (1.350 x g, 5 min).
6. Eliminar el sobrenadante y suavemente volver a suspender el sedimento de parásito etiquetados en 1 X PBS con el volumen adecuado para obtener una concentración final de aproximadamente 10-20 parásitos/nL para inyección.
7. Utilizar un pequeño volumen (∼ 10 μl, aproximadamente 1 x 10 ⁴ -2 x 10 ⁴ parásitos) de tripomastigotos evaluar viabilidad y etiquetado. Un microscopio invertido de fluorescencia puede utilizarse para la visualización directa de los parásitos. En el modo de luz transmitido, compruebe que los parásitos se mueven. En el modo de fluorescencia, utilice el filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para evaluar parásito etiquetado.

9. Inyección de larvas de pez cebra

1. carga del parásito
   1. tomar 10 μl de parásitos de la resuspensión (100 μL) y cargarlos en las agujas de cristal utilizando una pipeta de microloader de 10 μl.
   2. Insertar la aguja de vidrio en el soporte de la aguja de las amalgamas dentales, utilizan un soporte magnético y colocar al lado el estereoscopio.
   3. Pinzas finas usando bajo el estereoscopio, cortar la aguja creando un embotado abierto fin y medir el tamaño de la gota para obtener un volumen de inyección de 1 nL (esto es equivalente a un diámetro de grano de 0.12-0.13 mm cuando se mide en aceite mineral ¹⁷). Un Consejo más es preferido para que la aguja puede alcanzar estructuras profundas dentro de los peces sin dañar el tejido. En este protocolo, se utiliza una aguja embotada, pero puede utilizarse una aguja biselada así.
2. De montaje
   1. anestesiar larvas de 48 hpf con Metanosulfonato de 150 mg/L. Compruebe que no responden al tacto, pero asegúrese de que está latiendo el corazón.
   2. Colocar las larvas en el molde de agarosa de microinyección en posición lateral.
   3. Coloque el soporte de la aguja al lado del estereoscopio y ajustar el instrumental quirúrgico para que la punta de la aguja está en el centro del campo de visión. Mueva la caja Petri preparada en pasos de 6.2 a 6.4 para que la yema larval está cerca de la punta de la aguja. Comprobar el estado de la larva para asegurarse de que el corazón latir.
   4. Establecer los valores microinyectora como sigue: inyección 9,6 libras por pulgada (psi) de presión, mantiene la presión: 20 psi, 100 ms gama de gating; valor período de 1,9 (corresponde a 10,9 ms). El volumen de la inyección debe ser entre 1-3 nL, con aproximadamente 10-20 parásitos/nL.

10. Inyección del parásito

1. inyectar el pescado en la parte superior anterior de la yema en el conducto de Cuvier. Este paso debe realizarse para asegurar la supervivencia de animales después de la inyección. Tarda aproximadamente 10 min para inyectar con éxito 5-6 larvas.
2. Como control, se inyectan 1-2 larvas con el mismo volumen del vehículo (1 x PBS).
3. Transferencia de la larva a agua fresca al huevo inmediatamente.

11. LSFM montaje de inyecta larvas

1. transferencia de la larva inyecta con parásitos a un plato de Petri vacío y retire con cuidado el agua circundante con una pipeta de plástico y papel absorbente. Añadir 100 μl de precalentado 1.0% agarosa de punto de fusión bajo (consulte el paso 3 para la preparación de agarosa) para cubrir la larva. Asegurar la agarosa no es más de 40 ° C.
2. Insertar un alambre dentro de un capilar de vidrio de 1.0 mm y usarlo como un émbolo para aspirar la larva en posición vertical. Asegúrese de dejar una pequeña cantidad de agarosa sobre la larva. Espere hasta que la agarosa se solidifique antes de exponer la larva (esto requerirá unos minutos). Si es necesario, empuje hacia fuera de agarosa sobrante por debajo de la larva y córtelo apagado
3. Coloque el capilar en el portamuestras de microscopio y empuje hacia afuera el extremo que contiene la larva hasta que cuelga libre de los capilares. La cámara de muestra deberá ser rellenada con solución de Metanosulfonato (150 mg/L) y la temperatura de 28 ° C.
4. Coloque la larva delante de la pupila del objetivo de detección utilizando un micromanipulador XYZ sistema. Rotaciones sobre el eje vertical, usar de escenario una rotación. Posicionamiento de la larva debe hacerse en el modo de luz transmitido para identificar claramente las estructuras larvales.

12. LSFM proyección de imagen de la inyección de parásitos

modo de

1. cambio de fluorescencia y ajustar la intensidad de iluminación, así como el tiempo de exposición para disminuir fotodaño y optimizar tiempo resolución. Para estos experimentos particulares, utiliza una potencia de 2.8-3.0 mW para la muestra y expone cada fotograma para 200 ms usando una cámara con 6,45 μm píxeles y eficiencia cuántica de ~ 70% en las longitudes de onda de detección. Esta configuración debe dar lugar a imágenes adecuadamente expuestos en unos 5 cuadros/s. Asegúrese de que utilizar un objetivo con la mayor apertura numérica posible.
2. Iniciar una adquisición video de la región de interés (ROI). En nuestro caso, se observan parásitos adheridos a válvulas y libremente móvil en el área del corazón. Se recomienda tomar un video de un solo plano con el tiempo, o para utilizar el sistema de instrumental quirúrgico o piezo galvo enfocar diferentes planos mientras se mueve el parásito.
   Nota: Este procedimiento es útil para los tiempos de adquisición cortos de hasta 2 h. Para la adquisición a largo plazo, las larvas deben montarse utilizando métodos alternativos ²⁰.

13. Tratamiento y análisis de datos adquiridos de imágenes

Nota: tratamiento de la imagen fue realizada en un ordenador personal con un procesador GHz 2,90 8,00 GB de memoria y una tarjeta de video con 1,00 GB de memoria.

Conjunto de datos de

1. abierta la adquirida en el software de la opción de procesamiento de imágenes. El open software FiJi recomienda LSFM procesamiento de datos y análisis ²¹.
2. En el software de análisis de imagen, ajustar niveles de brillo y contraste para mejorar las imágenes.
   Nota: No hay parámetros fijos son usados en este caso pero seleccionando la " Auto " opción puede ser útil para obtener una mejora inicial.
3. Seleccione el retorno de la inversión.
   Nota: Para el seguimiento de los parásitos, FiJi tiene tanto seguimiento manual y automática de plugins disponibles.

14. Recuperación de larvas imágenes

1. quitar la larva cuidadosamente de la agarosa usando Pinzas finas y una herramienta de lazo de pelo. Transferir el pescado a huevo fresco agua y comprobación para la recuperación después de 15 minutos volver a la larva a incubadora a 28 ± 0,5 ° C.
2. Alternativamente, proceder a la eutanasia las larvas reflejadas con una sobredosis de Metanosulfonato. A continuación, introducir las larvas en una solución de hipoclorito de sodio (6.15% NaClO) durante 5 minutos matar el parásito. Disponer según la institución ' protocolos de s.

Resultados

Condiciones óptimas para la inyección:

Grupos de larvas de pez cebra fueron inyectados a las 24, 48, 72, 96 y 120 hpf, en diferentes sitios anatómicos y su supervivencia fue examinada cada día por 5 días. Después de 5 días post inyección, embriones inyección en 24 hpf tenía 6,25% (2/32) de supervivencia, mientras que el 95% (38/40) de larvas inyectados en 48 hpf sobrevivió. Como control, las larvas fueron inyectadas con 1 x PBS como un vehículo. No hubo diferencias en la supervivencia entre larvas vehículo inyectado e inyectado por el parásito, no indicando efectos parásitos dependientes de la tasa de supervivencia de los peces (p = 0,08). Larvas inyectadas entre 72-120 hpf tuvieron tasas de supervivencia comparables a 48 hpf inyecta larvas en el volumen de inyección constante. Para todos los procedimientos aquí presentados, 48 larvas hpf fueron utilizadas debido a su facilidad de manipulación y habiendo desarrollado órganos y fácilmente penetrable piel sin daño evidente después de la inyección.

Las larvas inyectadas en 48 hpf fueron inyectados en el espacio pericárdico, Cola muscular, ventrículo de cerebelo, vesícula ótica, notocordio y conducto de Cuvier en el saco vitelino. No hubo diferencias en la supervivencia de las larvas que se inyecta en sitios anatómicos diferentes. Sin embargo, la región más fácil y rápida para inyectar era que el conducto de Cuvier situado en la parte anterior del saco vitelino (figura 1, película 1). Inyecciones en ese sitio permitieron la introducción de volúmenes más altos con un menor riesgo de lesión a estructuras vitales. Además, entre 24-72 hpf, esta región es un sitio óptimo para acceder directamente a la vasculatura en desarrollo y corazón¹¹.

Visualización del parásito mediante LSFM:

Dentro de 8-10 min después de la inyección de T. cruzi en el conducto de Cuvier, se identificaron parásitos en larvas de pez cebra con LSFM debido a su señal fluorescente CFSE y la transparencia óptica de las larvas. Después de la inoculación, se observaron parásitos que ya sea adherido a las paredes alrededor del sistema circulatorio o viajando en la dirección del flujo de sangre (figura 2, figura 3). Cuando un parásito permanezca adherido a una estructura cardíaca, tales como la válvula auriculoventricular, oscila con las contracciones del corazón, lo que indica que los mecanismos moleculares de la adherencia de parásitos pueden ser eficaces en nuestro modelo de vertebrados (Movie 2, pelicula 3 Película adicional 1). T. cruzi también se adhirieron a las paredes del saco vitelino larval ( figura 2, Movie 2), una estructura que después será reabsorbida y formar parte de la del intestino del pez cebra²². Esto podría ser similar a lo que sucede durante la fase crónica de la enfermedad en seres humanos infectados, donde los parásitos se encuentran en cardiomiocitos y en el sistema nervioso digestivo^23,24. Cuando no, los parásitos se desvió a través del flujo de sangre en la misma dirección que los eritrocitos ( figura 3, película 4). Parásitos se podrían observar en diferentes vasos de tamaño de los peces, pero eran más abundantes en el espacio pericárdico y en la región adyacente de la yema que contiene el flujo de sangre ( figura 2, figura 3, película adicional 2).

En 10 min post inyección, era más difícil punto solas formas del parásito debido a su distribución a lo largo de la vasculatura y una inhabilidad para rápidamente pantalla diferentes sitios anatómicos de los peces debido a un limitado campo de visión de LSFM (con 40 aumentos ). Después de 24 horas post inyección (hpi), la señal de la CFSE comienza a acumularse en la región cerca del intestino en desarrollo (suplementario Figura 1).

Figura 1: Sitio de la inyección óptima. (A) imagen de larva 48 hpf mostrando el sitio de inyección óptima en el conducto de Cuvier (flecha amarilla) utilizando un estereoscopio ordinario. Ampliada (B) vista de la caja en la que muestra el conducto de Cuvier (flecha amarilla). Barra de escala = 200 μm (A), 50 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes LSFM de un parásito estático en una larva de hpf 48. El parásito T. cruzi (flecha amarilla) permanece adherido a las paredes del saco vitelino, a lo largo de la secuencia Time-lapse (7.2 s, 17.2 s y 27,2 s), alrededor de ~ 15 minutos después de la inyección del parásito. No hay cambio en la posición del parásito es observado durante un período de adquisición de al menos 30 s. un atrio; v ventrículo. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Trayectoria de un parásito viajando en el espacio pericárdico mediante LSFM. El parásito T. cruzi se puede realizar un seguimiento mientras la deriva en el espacio pericárdico (PS), siguiendo la dirección del flujo de sangre (pista en rojo) alrededor de ~ 15 minutos después de la inyección del parásito. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Valle de la circulación de sangre de la yema en una larva 48 hpf. Película de una larva 48 hpf mostrando la sangre circulación valle o conducto de Cuvier utilizando un estereoscopio ordinario. Diferentes regiones se concentran durante el vídeo para mostrar glóbulos rojos circulando a lo largo del conducto. Flecha amarilla muestra el sitio de inyección óptima. Película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Haga clic aquí para descargar el video.

Película 2: Parásitos de T. cruzi atado a las paredes de la vesícula vitelina. Película LSFM de proyección larva 48 hpf que parásitos de T. cruzi permanecen adheridas al saco de la yema de huevo unos 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Ningún cambio en la posición del parásito fue observada durante un período de adquisición de al menos 30 s. un atrio; v ventrículo. Haga clic aquí para descargar el video.

Película 3: Los parásitos de T. cruzi atado a las paredes del corazón. Película LSFM de una larva 48 hpf muestra que acercarse de parásitos de T. cruzi n adheridos a la pared cardiovascular, a pesar de las contracciones del corazón fuerte alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Los eritrocitos se observan como sombras redondeadas negras. Haga clic aquí para descargar el video.

Movie 4: parásitos moviéndose en el espacio pericardial. Película LSFM un parásitos de T. cruzi de mostrar hpf larva 48 a la deriva en el espacio pericárdico. Dos parásitos pueden encontrarse en diferentes puntos temporales (ID 1, en círculo rojo y ID 2 en círculo amarillo), siguiendo una trayectoria similar. La película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Haga clic aquí para descargar el video.

Suplementario Figura 1: señal fluorescente de acumulación de la CFSE en la yema de huevo. Imágenes de estereoscopio de una larva de tipo salvaje inyectado en 48 hpf en el conducto de Cuvier. Señal fluorescente CFSE se acumula progresivamente en la yema, después de dos días post inyección (48 hpi). Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario 1 película: parásitos unido a las paredes y válvulas del sistema circulatorio. Imágenes de serie de tiempo de estereoscopio de una larva de tipo salvaje inyectado en 48 hpf. Imágenes son tomadas a intervalos de 0,2 s capturar parásitos de T. cruzi en sincronía con las contracciones del músculo cardiaco en la válvula auriculoventricular. Película se registró unos 30 min después de la inyección del parásito. Haga clic aquí para descargar el video.

Adicional 2 de la película: parásitos móviles y adheridos en la yema y espacio periventricular. Película LSFM de una larva 48 hpf muestra T. cruzi parásitos deriva o adheridos en el espacio pericárdico o la yema de huevo. Una vista de luz transmitida se observó para los primeros 5 s. El punto de vista de la fluorescencia se observó de s 25.8 5.2. La película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Haga clic aquí para descargar el video.

Discusión

Este estudio destaca las ventajas del pez cebra como modelo animal para estudiar comportamiento patógeno en vivo. En particular, este estudio propone un método para visualizar el patógeno T. cruzi en su entorno natural: circulación hemática. El ambiente del microambiente circulatorio en peces es comparable a la de los mamíferos, y trypanosomátidos han evolucionado mecanismos para viajar, evadiendo el sistema inmunitario y a las células para la infección en ese medio ambiente²⁵. Este protocolo ofrece una descripción de un procedimiento óptimo para el cultivo de T. cruzi en una línea celular humana y posterior aislamiento de formas flagelares de etiquetado fluorescente. A continuación se muestra la configuración adecuada para inyección acertada de los parásitos en pez cebra transparente para más adelante montaje y visualización utilizando LSFM. Finalmente, este protocolo ofrece sugerencias para la eficiente y eficaz en vivo imagen de parásito ubicación y movimiento en la circulación mediante LSFM.

El flagelo de tripanosomas surge de su región posterior, que fluye desde el cuerpo celular, y cuelga gratis en la parte anterior del organismo²⁶. T. cruzi se propulsa moviendo el flagelo por delante del cuerpo, que ondula todo el cuerpo del parásito. Movimiento flagelar no sólo es indispensable para la motilidad del parásito, como en el caso de T. brucei²⁷ (el agente causal de la tripanosomiasis africana), pero también se utiliza para la infección celular, como se ha demostrado en T. cruzi^{5 ,28}. Aunque pez cebra no son el huésped natural de T. cruzi, la motilidad del parásito puede estudiarse en un sistema de circulación cardiovascular en desarrollo utilizando los protocolos descritos aquí. Además, hay especies de tripanosomas que infectan a los ciprínidos, la clase de pez cebra, como T. carassii y T. borreli²⁵. Estas especies podrían ser utilizadas para estudiar en tiempo real los movimientos y mecanismos de enganche de estas trypanosomátidos; este tipo de estudios puede prestar la penetración en el proceso de infección de células de mamífero.

En este estudio, se inyecta móviles T. cruzi parásitos fueron observadas viajando a través de la circulación cardiovascular de peces inoculados, moviéndose junto con eritrocitos opacos y adherirse a las estructuras de las paredes del sistema cardiovascular. Utilizamos un LSFM casa construida con un 10 X acromático distancia de funcionamiento larga objetivo de aire (17,6 mm) para el brazo de iluminación con una apertura numérica de 0.25. 40 X objetivo de inmersión de agua apocromática con una apertura numérica de 0,8 y una distancia de trabajo de 3,5 mm se utilizó para el brazo de detección. El objetivo de detección se sumergió en la cámara de la muestra, mientras que el objetivo de la iluminación estaba fuera de la cámara. Un puerto en la cámara de sellado con un cubreobjetos y pegamento óptico permitida para que la viga de la iluminación entrar en la cámara, como se muestra en Lorenzo et al. ¹⁸ para la iluminación, utiliza un laser DPSS 50 mW en 488 nm, cuyo poder fue modulada por un filtro óptico sintonizable de acusto. La trayectoria de detección utiliza filtros compatibles con proteína fluorescente verde (GFP) o FITC. Un microscopio de ficha técnica de iluminación, equipado con un soporte de muestra capilar (idealmente con rotación automática) y control de la temperatura de la cámara de muestra debe ser adecuado para esta aplicación. El microscopio debe ser alineado y calibrado según las instrucciones del fabricante o los protocolos estándar de laboratorio del usuario antes de adquisición, si es necesario. En este protocolo, hemos controlado el microscopio utilizando el software SPIM¹⁹.

Es importante tener en cuenta que en la circulación del pez cebra, accesorio parásitas de larvas es eficaz. En el sentido cardinal, parásitos permanecieron Unidos por hasta varios minutos; en el corazón, sostuvieron a las válvulas y las paredes, oscilante con las contracciones del corazón. Otros estudios siguen con el fin de dilucidar si T. cruzi interactúa con los eritrocitos que fluyen que deriva en la dirección del flujo de sangre. Anteriores estudios en vitro han demostrado que la presencia de estructuras sólidas (es decir, células de la sangre), o mayor viscosidad del líquido para simular sangre en vitro, tiene un efecto significativo en la motilidad y la velocidad del parásito ⁹.

Hay muchas preguntas sobre el curso de la infección de T. cruzi en humanos después de amastigotes que escape células fagocitarias, la célula inicialmente infectada tipo²⁹. ¿Por ejemplo, cómo llegan a sus órganos blanco? ¿Cuáles son los mecanismos para el tropismo de los órganos preferidos, como cardíaco, digestivo y sistema nervioso central? Curiosamente, en este estudio los parásitos fueron inicialmente reflejados en el corazón porque es el sitio de mayor densidad de parásitos. Sin embargo, la señal de la CFSE acumulada posteriormente en el intestino en desarrollo por 7 días después de la inyección. Aunque la anatomía de los peces y mamíferos es diferente, los resultados de este estudio demuestran una forma de tropismo, como se observó que los parásitos exhiben tropismo hacia órganos conocidos recomendado: a pesar de la diferencias. Una limitación importante de este estudio refiere a la temperatura utilizada en los experimentos. Larvas de pez cebra deben mantenerse alrededor de 28 °C durante todo el procedimiento. Aunque esta temperatura sea similar al host de vectores (insectos de la subfamilia Triatominae), es bastante diferente de los mamíferos de sangre caliente que son los hospederos finales (alrededor de 37 ° C). T. cruzi es conocido por tener formas vivas flagelar en ambos ejércitos; sin embargo, es importante tener en cuenta que este factor podría tener un efecto en el comportamiento de los animales en vivo.

Aunque el sistema inmune adaptativo fish´s no madurito hasta 4 semanas post fecundación, el sistema inmunitario innato está activo en desarrollo¹⁰. Tan pronto como hpf de 48 o 96, células fagocíticas se observaron después de haber engullido etiquetado tripanosomas (datos no mostrados). Esto limita la ventana de tiempo para la visualización del parásito. Sin embargo, si un estudio tiene que centrarse en evaluar la respuesta inmune de fish´s, se puede recomendar la inyección en etapas posteriores. Además, la inyección de parásitos en las líneas de peces transgénicos con macrófagos marcados o de otras células del sistema inmune pueden ser útiles en el estudio de fijación del parásito y los mecanismos de endocitosis posible. Es importante tener en cuenta que si los parásitos están marcados con CFSE, etiquetas de transgénicos de la célula no deben ser GFP, y un marcador al final del espectro de color amarillo o rojo.

Para evaluar la dirección detallada del movimiento de parásito, puede ser útil seguir su trayectoria en 3 dimensiones (3D). Para la visualización 3D y reconstrucción del proceso, es necesario un sistema de alta velocidad. Con el equipo utilizado en el presente Protocolo, sólo es posible visualizar los parásitos en un plano. En este caso, priorizamos mantener la estabilidad del plano focal durante el movimiento del parásito y registro de su trayectoria en un plano.

La metodología propuesta aquí allana el camino para investigar comportamiento del parásito en circulación cardiovascular. En Resumen, los pasos esenciales para parásitos vivos fluorescentes dentro de larvas de pez cebra de la proyección de imagen son:(i) uso de embriones nacidos tempranos (24-48 hpf) o larvas o animales entre 72-96 hpf con ninguna pigmentación para que sean transparentes y fáciles de inyectar; (ii) las larvas imagen tan pronto como sea posible después de la inyección para evitar la eliminación del parásito a las células fagocíticas; y (iii) enfoque LSFM en el sitio de interés (por ejemplo, región pericárdica) y mantener el enfoque. Este novedoso procedimiento permite la visualización de los tripomastigotos en un ambiente comparable a su nicho natural de la infección, proporcionando por primera vez la posibilidad de estudio de T. cruzi en un organismo vivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Micropipette	Fisherbrand	21-377-815
Agarose RA	Amresco	N605	Regular
Agarose SFR	Amresco	J234	Low Melting point
Aquarium salt	Instant ocean	SS15-10
Cell Count chamber	Boeco	Neubauer
Cell culture flasks	Corning	430639
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
CFSE	ThermoFisher	C34554
Detection objective	Nikon 40x 0.8NA	40x CFI APO NIR
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5648
Dumont #5 fine forceps	World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Fetal calf serum (FCS)	Eurobio	CVFSVF00-01
Filter	Chroma	ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting	Vitrez Medical	160215
Glass capillaries for pulling needles	World precision instruments	TW100-4
Glucose	Gibco	A2494001
HEPES	Gibco	156300-80
Incubator	Thermo Corporation	Revco
Larval microinjection mold	Adaptive Science Tools	I-34
Laser	Crystalaser	DL488-050
L-glutamine	Gibco	250300-81
Methylene blue	Albor Químicos	12223
Micromanipulator	Narishige	MN-153
Micromanipulator system	Sutter Instrument	MP-200	For LSFM
Micropipette puller device	Narishige	PC-10
Microscope	Olympus	CX31
Microscope (inverted)	Olympus	CKX41
Multipurpose microscope	Nikon	AZ100M
Neubauer counting chamber	Boeco Germany
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-163
Petri dish 94x16	Greiner bio-one	633181
Plastic pasteur pipette	Fisherbrand	11577722
Rotation stage	Newport	CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R4130
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Stereoscope	Nikon	C-LEDS
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	886-86-2
TRIS	Amresco	M151
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	R-001-100
Tubes 15 ml	Corning	05-527-90