Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Özet

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Özet

Chagas hastalığı Trypanosoma cruzikimin hareketliliği sadece yerelleştirme, hücresel bağlama ve işgali için de önemli değil, neden olduğu paraziter bir enfeksiyondur. Hayvan modellerinde geçerli: T. cruzi çalışmanın parazit davranışını anlamak için bir meydan okuma enfeksiyon insanlarda ilk aşamalarında temsil eden parazitler içinde vivo sınırlı gözlem izin. Bu protozoon kamçılı aşamasında hem vektör hem de memeli ev sahibi var, ama onun hareketliliği vivotanımlayan hiçbir çalışma vardır. Bu projenin amacı T. cruzi hareketliliği damar sisteminde değerlendirmek için canlı omurgalı Zebra balığı modeli kurmak oldu. Larvaları ile fluorescently enjekte edildi şeffaf Zebra balığı trypomastigotes etiketli ve hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM), yüksek optik çözünürlük ile canlı organizmalar görselleştirmek için invaziv bir yöntem kullanarak görülmektedir. Parazitler bu teknik için confocal karşılaştırıldığında duyarlilik nispeten düşük riski nedeniyle uzun bir süre için görüntülenmeyecektir veya epifluorescence mikroskobu. T. cruzi parazitleri farklı boyutta kan damarları ve sarısını canlı Zebra balığı dolaşım sistemi de seyahat tespit edildi. Onlar sarısı sac duvar ve kalp kasılma ile ilişkili güçlü kuvvetler rağmen Atriyoventriküler kapak ekli görülebiliyordu. T. cruziLSFM-Zebra balığı aşısını larva bir yöntemdir parazitler dolaşan görselleştirmek için kullanılan ve onların tropism, geçiş desen ve motilite canlı hayvan kalp-damar sisteminin dinamik ortamda değerlendirmek bir değerli.

Giriş

Chagas hastalığı protozoon parazit tarafından neden T. cruzi. Yaklaşık 6-7 milyon kişi dünya çapında T. cruziile bulaşmış. Hastalık esas olarak Latin Amerika'da iletilir, ama Amerika Birleşik Devletleri, Kanada ve birçok Avrupa yanı sıra özellikle geçiş enfekte bireylerin¹nedeniyle bazı batı Pasifik ülkeleri bildirilmiştir. Chagas büyük ölçüde vektör kaynaklı ve iletilen insanlara "kissing bugs" olarak bilinen Triatominae alt familya hematophagic böceklerin dışkı ile temas. Ancak, T. cruzi kan nakli, dikey anne çocuk veya parazitler²ile kontamine yiyeceklerin yenmesi için nakil yolu ile de bulaşabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik veya yapısal semptomatik ve 6 ila 8 hafta sürer Akut Faz sonra hangi nişan bağışıklık sisteminin parazit yük kontrol eder, ama enfeksiyon³tamamen ortadan kaldırmaz. Çoğu kişiler sonra bir kronik asemptomatik dönem girin; Ancak, neredeyse hastaların % 30 kardiyak sistem ve daha az sıklıkla sindirim ve sinir sistemleri güvenliği aşılan⁴olan bir semptomatik kronik faz geliştirmek. Bu senaryo yana aşı yok ve sadece iki etkili ilaçlar için Chagas hastalığı tedavi ve kontrol için bir meydan okuma sunuyor: benznidazole ve nifurtimox. Her iki tedavi uzun süreli yönetim gerektirir ve ciddi yan etkileri²olabilir.

T. cruzi davranışını anlamak artan davranış vivo paraziter geçiş, hücresel eki ve işgal ev sahibi içinde belirleyen anahtar olduğunu; vivo modellerin eksikliği yeni tedavi yaklaşımları gelişimi sınırlar. Vitro çalışmalar T. cruzi enfeksiyon trypomastigotes hareket bağlama konak hücre zarlarında ve sonraki hücresel işgali⁵için önemli olduğunu göstermiştir. Trypomastigotes ortak kültür duyarlı hücre hattı ile enerji tükenmesi hücresel işgali⁶azaltmak için gösterilmiştir. İlginçtir, trypanosomatids, kamçı hareket de parazit özel antikorlar⁷karşı bir kaçırma mekanizması olarak karakterize.

Kamçı hareketliliği kapsamlı bir şekilde okudu vitro Trypanosoma brucei, Afrika tripanozomiyasına⁸neden yakından ilgili bir parazit olmuştur. Vitro çalışmalar bu Tripanozomlar hareketliliği, kan veya vücut sıvıları, viskozite ve engelleri kan hücrelerinin temsilcisi varlığı da dahil olmak üzere koşullarının simülasyonu parazit ileri hareketi^{9 önemli gösterdi} . Derecede-in henüz bu parazitler ve kan dolaşımına vivo içindeiçinde hareket görselleştirmek mümkün olmamıştır.

Zebra balığı larva ana bilgisayar-patojen etkileşim içinde vivoeğitim için güçlü bir model vardır. Bunlar küçük, ucuz ve Chagas hastalığı için kurulan diğer omurgalı modellerle karşılaştırıldığında yükseltmek nispeten kolay. Zebra balığı var doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri insanlara benzer, ama onların edinilmiş bağışıklık sistemi 4 gün sonrası döllenme (dpf) geliştirmeye başlar ve başka bir birkaç hafta¹⁰için olgun değil. Erken geliştirme sırasında sadece makrofajlar bulunduğunda, parazit davranış hemen bağışıklık girişim¹⁰olmadan çalışmak için büyük bir pencere var. Ancak, Zebra balığı larva patojen davranış eğitimi omurgalı bir model olarak kullanan en büyük avantajı mikroskobik eleme ve¹¹görüntüleme için mükellef geliştirmelerde optik saydamlıklarını yatıyor. Ayrıca, Balık genetik işlemek için birden çok araç vardır. Örneğin, Casper zorlanma ile pigmentasyon tamamen şeffaf ve yararlı görselleştirme bireysel organları ve gerçek zamanlı izleme enjekte hücreler¹²hayvan yapma, Zebra balığı mutant bir çizgidir.

Bir imkânsızlık görüntüleme, yüksek satın alma hızları ve büyük penetrasyon derinliklerinde iyi resim kalitesine sahip ve düşük hızla hareket eden parazitlerin canlı Zebra balığı confocal kullanarak veya epifluorescence mikroskobu boyuna gözlem bir anahtar sınırlaması yatıyor duyarlilik riski. Hafif levha floresan micsroscopy (LSFM) bu gözlemler izin vermek için bu sınırlamalar üstesinden gelir gelişmekte olan bir görüntüleme tekniğidir. Floresan ve sadece odak düzlemi algılama amacın aydınlatan ikinci bir dik aydınlatma hedefi tespit etmek için bir hedefi kullanarak, yüksek çözünürlüklü optik bölümleri olduğu gibi confocal mikroskop ama ile elde etmek mümkündür önemli ölçüde azaltılmış duyarlilik, hatta epifluorescence mikroskobu¹³ile ilgili olarak. Burada kullanılan LSFM teknik tek uçak aydınlatma mikroskobu (ince bir levha ile ışık Zebra balığı larva içinde tek bir uçağı aydınlatan istenmeyen anlık ileti), denir.

Bu metodoloji amacı T. cruzi hareketliliği ve ilgili davranışları vivo içindeanlamak için uygun bir enfeksiyon model olarak larva Zebra balığı kurmaktır. Bunu gerçekleştirmek için biz şeffaf Zebra balığı larva fluorescently etiketli trypomastigotes, insanlar, enfeksiyon için sorumlu hücresel formu ile enjekte ve T. cruzi hareketinde Zebra balığı kalp-damar dolaşımını tespit LSFM kullanarak.

Protokol

aşağıdaki protokolleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Los Andes Üniversitesi (CICUAL) tarafından kabul edildi. Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) yönergeleri kesinlikle patojen ile kontaminasyonu önlemek için takip T. cruzi.

Not: hayvan bakım ve Onarım: Casper Zebra balığı, Zebra balığı genetiği değiştirilmiş bir tür (Danio rerio) bu protokolü değerli optik saydamlıklarını nedeniyle tüm gelişim aşamalarında kullanılır. Balık en uygun bakım kontrollü koşullar türler için ¹⁴, döngüsünde bir 14 h ışık-10 s karanlık, 28 ± 1 ° C, pH (7.0-7,4) adlı çok tank dolaşım su sistemi kullanılarak işlenir. Hayvanlar günde iki kez canlı tuzlu karides (Artemia salina) ile beslenen ve gıda yetiştirme ile zenginleştirilmiş. Tüm iletişim kuralları Universidad de los Andes (C.FUA_14-017) CICUAL tarafından kabul edildi.

1. hazırlık yumurta su

1. hazırla 0,6 g/L akvaryum tuz Ters Ozmos (RO) veya deiyonize (DI) su ve 0.01 mg/L Metilen mavisi ekleyin.
   Not: Ölçülen iletkenlik 400-500 µS/cm ve pH 7.2-7,9 düzey olmalıdır. PH düşürmek için yumurta su birkaç saat havalandırmak.

2. Tricaine hisse senedi çözüm hazırlanması

1. hazırla 97,9 mL distile su (GKD ₂ O) 400 mg tricaine (MS-222) eriterek tarafından tricaine hisse senedi çözüm % 0,4. Toz tamamen çözülmüş sonra pH 7.0 2.1 mL 1 M kullanarak ayarlayın Tris (pH 9.0) ve çözüm buzdolabına.

3. %1.0 hazırlanması düşük erime noktası özel

son konsantrasyonu %1,0

1. erime düşük erime noktası özel toz yumurta içinde su. Karışımı bir mikrodalga veya özel çözüm homojen görünene kadar sürekli karıştırarak ile sıcak tabakta ısı.
2. Aliquots en fazla bir hafta için 4 ° C'de depolayın.

4. Tahlil ve embriyo koleksiyonu çiftleşme

1. enjeksiyonu öncesinde üç gün içinde tank doğurmak erkek ve dişi balık sağlıklı çiftleri kullanılarak matings kurmak. Zenginleştirme cam mermerler ve yapay ağaçlar ile yumurtlama geliştirir. Matings öğleden sonra boyunca ayarlamak ve gecede yaptı.
2. Ertesi sabah, tank bir süzgeç aracılığıyla boşaltma ve yumurta yumurta su ile yıkama tarafından oluşturulan yumurta toplamak. Bütün yumurtaları ters çevirme süzgeç ve süzgeç aracılığıyla bir Petri kabına yumurta su dökme çıkarın. Embriyo sağlıklı tutmak için onların herhangi bir enkaz ve ölü embriyo transferi plastik pipet ile kaldırarak temiz su.
3. Bir kuluçka 28.5 ° c Zebra balığı hazırlama standartları ¹⁵ göre embriyo gelişimi sağlamak için istikrarlı bir sıcaklık embriyo transfer edin. Günde iki kez embriyoların incelemek ve debriyaj sağlıklı tutmak için inviable yumurta atın.

5. Embriyo Dechorionation

Not: embriyo enjeksiyon zamanda yumurtadan değil, bu yordam gereklidir. Bu yordamda, " larva " hayvanlar onların koryon 48 h dışarı sonrası döllenme (hpf) itibaren vardır.

1. Deneme günü, diseksiyon stereoscope altında sağlıklı embriyoların içeren Petri kabına yerleştirin.
2. Koryon karşıt ucunda iki keskin forseps (Dumont #5) ile kapmak ve hafifçe açık gözyaşı ve çekme koryon. Yaklaşık 5-6 larva bir kerede enjekte ve genellikle 3-4 yansıma.
3. Chorions transfer pipet kullanarak denizden çıkarmak.

6. Enjeksiyon malzemesi hazırlama

1. hazırlamak 1.0 mm iğneler ince duvar cam kılcal damarlar ve micropipette çektirme cihazı aşağıdaki ayarlarla kullanarak: 2 hafif ağırlık + 1 ağır, 2 mm en iyi çekme + 5 mm alt çekme, 75.9 ° C (Adım 1) + 78.2 ° C () 2. adım). İğneler bir petri kil modelleme Las Vegas saklayın. İdeal iğne dar bahşiş olarak T. cruzi olmalıdır yaklaşık 20 x 1-3 µm ölçmek ve iğne ile kolayca geçecek. Ucu uzunluğu değişebilir: daha uzun bir ipucu daha derin yapıları ulaşmak yararlıdır, ama kısa bir ipucu daha sert enjeksiyon kullanıcı için daha kolay hale olacak.
   Not: Kullanılan sıcaklık iğne ucu boyutunu bağlıdır: adım 2 için daha yüksek bir sıcaklık sonuç daha uzun ve daha ince bahşiş.
2. GKD ₂ O % 1.5 özel çözümde hazırlamak ve 10 cm Petri kabına dökün. Yaklaşık 1.0 cm derinliğe kapak.
3. Üzerinde özel bir Prefabrik mikroenjeksiyon kalıp yerleştirin ve katılaşmaya sağlar.
4. Prefabrik mikroenjeksiyon kalıp dışarı Asansör ve yumurta su depolama için 4 ° C'de ekleyin Bu özel kurumasını engeller.
5. Ekle yumurta su tricaine hisse senedi çözüm için 150 mg/l mağaza son bir konsantrasyon 4 ° C.

7. Hücre kültür parazit büyüme için

1. parazit Vargas-Zambrano vd tarafından açıklanan yöntemi kullanarak bir insan tümörü hücre satırı (CRL-1718) korunur ¹⁶
2. T25 kültür şişeler içinde insan hücreleri kültürünü başlatın (yüzey alanı = 25 cm ²) bir yoğunluk 2 x 10 ⁵ veya 4 x 10 ⁵ hücrelerin RPMI-1640 orta 4 ml fetal buzağı serum (FCS) yüzde 10'u ile desteklenmiş 2 mM L-glutamin, 4,5 g/M glikoz, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate ve % 1 penisilin-streptomisin (adı verilen " tamamlamak medya "). Tümörü kültürleri % 5 CO ₂ ortamında 37 ° C'de kuluçkaya.
3. Bir monolayer Konfluent olduğunda, onları 3 dk 37 ° C. görsel olarak onay için hücre dekolmanı az için kuluçka tripsin-EDTA % 0.25 2 mL kullanarak hücre bağlantısını kesin ve RPMI-1640 3 mL % 10 FCS 15 mL tüp ile kullanarak tripsin çözüm engellemek.
4. Santrifüj 1.350 x g., 5 min için hücre süspansiyon
5. Elde edilen hücresel Pelet DMEM ortamda 15 mL tüp ve santrifüj 1.350 x g 22, 5 min için yıkayın ° C.
6. Hücrelerde el ile Neubauer odası ve onay için 40 X büyütme, ışık mikroskop içinde canlılık saymak.
7. Nazikçe yeniden askıya hücresel cips 4 mL tam medya ve yeni hücre kültürleri T25 kültür şişe 2 x 10 ⁵ hücreleri kullanarak oluşturmak için kullanın.

8. T. cruzi kültür ve etiketleme

1. parazit vardır aslında enfekte bir insandan alınan ve T. cruzi DA zorlanma (MHOM/CO/01/DA), karakterize bir zorlanma genotip ayrı yazarak birimi (DTU) MKE ¹⁶. Kültür, 3 ya da 4 gün topladıktan sonra hareketli parazitler insan tümörü hücre kültür süpernatant ve santrifüj 1.350 x g., 5 min için orta atın.
   Not: Parazit tam ortamda yeniden kültür 1:1 oranında T25 kültür şişeler hücrelerde tümörü ile ne amaçla kullanılacağını.
2. Yavaşça 10 ml steril 1 fosfat tampon serum (PBS) % 0,1 FCS ve 5 min için santrifüj x 1350 x g., pelet yeniden askıya alma
3. Süpernatant atın ve 1 mL PBS yeniden askıya alma. Free-swimming parazitler Neubauer odasında sayımı için 10 µL alın.
4. Yeniden askıya alınan parazitler (990 µL) dinlenmek ve Carboxyfluorescein Diacetate Succinimi 1 µL ekleyinDyl Ester (CFSE), nihai toplama 5.0 µM. Incubate oda sıcaklığında 10 dk için.
   Not: Bölünmemeli ve bakımlı -20, 5 mM CFSE stok olmalıdır ° C.
5. (1.350 x g, 5 min) parazitleri cips. Parazit Pelet tüp flicking tarafından yeniden oluşturmak ve yıkama PBS-0.1% FCS ardından bir sonraki tur tarafından (1.350 x g, 5 min) 1 x 10 ml.
6. Süpernatant atmak ve yavaşça etiketli parazit Pelet yaklaşık son bir konsantrasyon elde etmek için 1 X PBS içinde uygun cilt ile yeniden askıya 10-20 parazitler/nL enjeksiyon için.
7. Küçük bir birim kullanmak (∼ 10 µL, yaklaşık 1 x 10-⁴ -2 x 10 ⁴ parazitler), canlılık ve etiketleme değerlendirmek için trypomastigotes. Bir ters Floresans mikroskobu parazitleri doğrudan görselleştirme için kullanılabilir. İletilen ışık modunda parazitleri hareket kontrol edin. Parazit etiketleme değerlendirmek için floresein Isothiocyanate (FITC) filtre Floresans modunda kullanın.

9. Zebra balığı larva enjekte

1. parazit yükleme
   1. parazit resuspension (100 µL) üzerinden 10 µL alıp 10 µL microloader pipet ucu kullanarak mühürlü cam iğne yükleyin.
   2. Cam iğne micromanipulator iğne bağı yerleştirin, manyetik bir stand kullanma ve yer yanındaki stereoscope.
   3. Bir künt açık oluşturma iğne kesmek stereoscope altında kullanma iyi forseps sonlandırmak ve 1 bir enjeksiyon hacmi elde etmek için damla boyutu ölçmek nL (Bu mineral yağ ¹⁷ mm ölçülen zaman eşdeğer 0,12 0,13 boncuk çapı için). İğne yapıları erişebilmesi uzun bahşiş tercih edilir derin doku zarar olmadan balık içinde. Bu protokol için bir künt iğne kullanılır, ancak eğimli bir iğne de kullanılabilir.
2. Montaj
   1. 48 larvaları anestezi hpf, 150 mg/L tricaine ile. Dokunmak, yanıt vermeyen onay ama emin olun kalp atıyor.
   2. Larvalar mikroenjeksiyon özel kalıp bir lateral pozisyonda yerleştirin.
   3. Stereoscope yanında iğne bağı yerleştirin ve iğne ucu görüş alanı merkezinde micromanipulator ayarlamak. Larva sarısı iğne ucu yakın olması adımları 6.2 - 6.4 için hazırlanmış Petri kabına taşıyın. Kalp dayak devam etmesini sağlamak için larva durumunu kontrol.
   4. Set microinjector değerleri aşağıdaki gibi: enjeksiyon 9,6 pound / inç (PSI) basınç; basınç tutun: 20 psi; perdeleme 100 ms aralığı; (10,9 ms için karşılık gelen) 1.9 dönem değeri. Enjeksiyon hacmi 1-3 nL, yaklaşık 10-20 parazitler/nL ile arasında olmalıdır.

10. Parazit enjeksiyon

1. enjekte balık sarısı Cuvier kanalı, çift ön kısmında. Bu adımı enjeksiyon sonra hayvan hayatta kalmasını sağlamak için icra edilebilir. 5-6 larva başarıyla enjekte için yaklaşık 10 dakika sürer.
2. Bir kontrol, 1-2 larva aynı araç birimle (1 x PBS) enjekte.
3. Hemen taze yumurta suya larva transfer.

11. Larva enjekte, montaj LSFM

1. parazit için boş bir Petri kabına enjekte larva Transfer ve çevresindeki su plastik pipet ve emici kağıt ile dikkatli bir şekilde çıkarın. Düşük erime noktası özel ısıtılmış %1.0 100 µL hemen ekleyin (Adım 3 için özel hazırlık bakın) larva kapsayacak. Özel 40 üzerinde olmadığından olun ° C.
2. 1.0 mm cam kılcal damar içinde düz bir tel takın ve bir dikey pozisyonda larva kadar emmek için bir dalgıç kullanın. Özel larva yukarıda küçük bir miktar bıraktığınızdan emin olun. (Bu bir kaç dakika gerektirir) larva açığa önce özel katılaşır kadar bekleyin. Gerekirse, larva aşağıda aşırı özel dışarı itmek ve kapalı kesim
3. Kılcal yer içinde mikroskop örnek tutucu ve sonuna kadar ücretsiz kılcal asılı larva içeren dışarı itin. Numune odası tricaine çözüm (150 mg/L) ve 28, ayarla sıcaklık ile doldurulmalıdır ° C.
4. Larva bir XYZ-micromanipulator sistemini kullanarak algılama amaç öğrencinin önünde konumlandırın. Dikey eksen hakkında rotasyonu için döndürme sahne alanı kullanın. Larva konumlandırma larva yapıları açık bir şekilde belirtmek için iletilen ışık modunda yapılmalı.

12. Parazitler enjekte, görüntüleme LSFM

1. değişiklik floresan için modu ve aydınlatma yoğunluğu yanı sıra duyarlilik azaltmak ve zaman çözünürlüğü en iyi duruma getirmek için çekim hızı ayarlayın. Bu belirli deneyler için 2.8 3.0 mW güç örnek için kullanılan ve her çerçeve 200 6.45 µm piksel ve algılama dalga boylarında ~ %70 kuantum verimi ile bir kamera ile ms için maruz. Bu ayarları hakkında 5 kare/s bir amaç ile en yüksek olası sayısal diyafram kullandığınızdan emin olun yeterince maruz görüntülerde sonuçlanmalıdır.
2. Bölge (ROI) ilgi video edinimi başlatın. Bizim durumumuzda, parazitler vanalar için bağlı ve serbestçe hareket kalp çevresinde gözlenir. Bu zaman içinde bir video tek bir uçak almak veya parazit hareket ederken farklı düzlemler odaklanmak için micromanipulator veya piezo-galvo sistemini kullanmak için tavsiye edilir.
   Not: Bu yordam en fazla 2 saat kısa edinme zamanlar için yararlı olacaktır. Uzun vadeli edinmesinin larvalar alternatif yöntemler ²⁰ kullanarak monte edilmelidir.

13. Görüntü işleme ve alınan veri analizi

Not: görüntü işleme 2.90 GHz işlemci, 8.00 GB-in bellek ve 1.00 GB belleği olan bir ekran kartı olan bir kişisel bilgisayarda gerçekleştirilen.

Görüntü işleme yazılımı tercih

1. Açık alınan veri kümesi. Açık Yazılım FiJi LSFM veri işleme ve analiz ²¹ için önerilir.
2. Görüntü analizi yazılımı görüntüleri geliştirmek için parlaklık ve kontrast düzeyleri ayarlayın.
   Not: Sabit parametre kullanılan bu durumda ama seçme " otomatik " seçeneği bir ilk donaným elde etmek yararlı olabilir.
3. Yatırım Getirisi seçin.
   Not: bireysel parazitler izlemek için FiJi her iki el ile ve otomatik izleme eklentileri mevcut vardır.

14. Larva yansıma kurtarma

1. Kaldır dikkatle özel kullanarak üzerinden larva iyi forseps ve saç döngüsü aracı. 15 dk. döndükten sonra larva kuluçka 28 ± 0,5 ° c için balık geri taze yumurta su ve kurtarma için onay transfer
2. Alternatif olarak, aşırı dozda tricaine ile görüntülü larva ötenazi için devam edin. O zaman, sodyum hipoklorit çözeltisi içinde larvalar tanıtmak (%6.15 NaClO) parazit öldürmek 5 min için. Kurum göre elden ' s standart protokolleri.

Sonuçlar

Enjeksiyon için en uygun koşulları:

Zebra balığı larva grupları 24, 48, 72, 96 ve 120 enjekte farklı anatomik sitelerdeki hpf ve onların yaşam 5 gün boyunca her gün muayene. 5 gün enjeksiyon deftere naklettikten sonra embriyo 24 enjekte hpf vardı %6.25 (2/32) hayatta kalma, % 95'i (38/40) 48 enjekte larva hpf hayatta iken. Bir denetim olarak larva 1 x PBS ile bir araç olarak enjekte edildi. Sağkalım oranı balıkların üzerinde hiçbir bağımlı parazit etkileri gösteren araç enjeksiyonlu ve parazit enjekte larva arasında hayatta hiçbir fark vardı (p 0,08 =). 72-120 hpf arasında enjekte larva 48 hpf-Injected larva için karşılaştırılabilir sağkalım oranları sabit enjeksiyon ses seviyesinde vardı. Burada sunulan tüm yordamları için 48 hpf larva manipülasyon ve organ ve belirgin zarar vermeden kolayca işlenebilir cilt enjeksiyon sonra geliştirilmiş olması onların kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır.

Hpf larva 48, enjekte edildi Perikardiyal boşluğa enjekte, kas, arka beyin ventrikül ve vezikül notochord ve Cuvier kanal sarısı saç kuyruk. Farklı anatomik sitelerinde enjekte larva yaşama hiçbir farklılıklar vardı. Ancak, enjekte etmek için en hızlı ve en kolay bölge Cuvier kanal sarısı sac (şekil 1, film 1) ön kısmında bulunan oldu. Enjeksiyonları, bu sitede önemli yapıları yaralanma daha düşük bir risk daha yüksek birimleri tanıtımıyla izin. Ayrıca, 24-72 hpf arasında bu bölge gelişmekte olan damarlara ve kalp¹¹doğrudan erişmek için bir en iyi sitedir.

Parazit görselleştirme: LSFM kullanarak

8-10 dk içinde T. cruzi enjeksiyon Cuvier koli takip, parazitler Zebra balığı larva CFSE floresan sinyallerini ve larvalar optik saydamlığını nedeniyle LSFM kullanarak tespit edilmiştir. Aşı sonra parazit ya da dolaşım sistemi veya kan akımı (Şekil 2, şekil 3) yönünde seyahat etrafında duvarlar yapıştırılır tespit edildi. Bir parazit Atriyoventriküler kapak gibi bir kalp yapısına bağlı kalır zaman kalp kasılma, parazitler ve bağlılık için moleküler mekanizmalar bizim omurgalı modelinde (film 2, film 3 etkili olabileceğini gösteren ile olsun Tamamlayıcı film 1). T. cruzi da daha sonra emilir ve Zebra balığı bağırsak²²parçası haline bir yapı larva sarısı sac ( Şekil 2, Film 2), duvarlar için yapıştırılır. Bu parazitler nerede bulunur cardiomyocytes ve sindirim sinir sistemi^23,24sırasında enfekte insanlar, kronik hastalık aşamasında neler için benzer olabilir. Ne zaman bağlı değil, eritrositler ( şekil 3, Movie 4) olarak aynı yönde kan akımı yoluyla parazitleri sürüklendi. Parazitler balığın farklı büyüklükteki gemiler gözlenen ama Perikardiyal uzayda ve kan akımı ( Şekil 2, şekil 3, tamamlayıcı film 2) içeren bitişik sarısı bölgesinde daha bol.

10 dk sonrası enjeksiyon kendi dağıtım damarlara ve sitelere hızlı bir şekilde ekran farklı anatomik LSFM (40 X büyütme, görüş bir sınırlı alanı nedeniyle balıkların bir yetersizlik nedeniyle parazit spot tek formlara daha zor ). 24 saat sonra enjeksiyon (HPI) sonrası, CFSE sinyal gelişmekte olan bağırsak (ek şekil 1) yakınındaki bölgede toplamaya başlar.

Şekil 1: En iyi enjeksiyon izi. Larva 48 görüntüsünü(a)normal bir stereoscope kullanarak en uygun enjeksiyon yerinde Cuvier (sarı ok) kanal gösterilen hpf. (B) Magnified kutusunun içinde bir gösterilen Cuvier (sarı ok) kanal görüntüleyin. Ölçek çubuğu = 200 µm (A), 50 µm (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: 48 hpf larva statik bir parazit görüntülerini LSFM. T. cruzi parazit (sarı ok) yumurta sarısı sac, hızlandırılmış sıra boyunca duvarlara yapıştırılan kalır (7,2 s, 17,2 s ve 27,2 s), yaklaşık ~ 15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Parazit konumunu bir değişiklik yok en az 30 Alım döneminde gözlenen s. a, Atrium; v, ventrikül. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: LSFM kullanarak Perikardiyal uzayda seyahat bir parazit yörüngesini. T. cruzi parazit-ebilmek var olmak izci kan akımı (kırmızı ile gösterilen parça) yönünü takip (PS), Perikardiyal uzayda sürüklenen sırasında yaklaşık ~ 15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Film 1: kan dolaşımı Vadisi bir larva 48 yumurtalı hpf. Bir larva 48 film kan dolaşımını Vadisi veya düzenli bir stereoscope kullanarak Cuvier kanal gösterilen hpf. Farklı bölgelerde kanalı dolaşan kırmızı kan hücreleri göstermek için video sırasında odaklandık. Sarı ok en uygun enjeksiyon yeri gösterir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Film 2: T. cruzi parazitler bağlı sarısı sac duvarlar için. LSFM film bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazitler parazit enjeksiyon sonra yumurta sarısı sac yaklaşık 10-15 dk yapıştırılır kalır. Parazit konumunu bir değişiklik yok en az 30 Alım döneminde gözlenen s. a, Atrium; v, ventrikül. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Film 3: T. cruzi parazitler bağlı kalp duvarlarının. Bir larva 48 LSFM film hpf bu T. cruzi parazitler remai gösterilenn şeklinde olması gereken kalp-damar duvar, güçlü kalbin kasılma rağmen yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Eritrositler siyah yuvarlak gölgeler görülebilir. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Film 4: Perikardiyal alanda taşımak parazitler. Perikardiyal uzayda sürüklenen bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazit LSFM film. İki parazit farklı zaman noktalarda (kimlik numarası 1, kırmızı daire ve sarı daire içinde kimliği 2), benzer bir yörünge takip takip edilebilir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 1: CFSE birikimi floresan sinyal sarısı. Stereoscope 48, enjekte wildtype larva görüntülerini hpf Cuvier kanalı. Sonra iki gün enjeksiyon (48 HPI) sonrası CFSE floresan sinyal giderek sarısı içinde birikir. Ölçek çubuğu 500 µm. = rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 1: parazit bağlı duvarlar ve dolaşım sistemi valfleri. Stereoscope zaman serisi görüntüleri 48, enjekte bir vahşi türü larva hpf. Görüntüleri T. cruzi parazitler senkronizasyonu kalp kası kasılmalar Atriyoventriküler Vana ile hareket yakalama 0.2 s aralıklarla alınır. Film yaklaşık 30 dk sonra parazit enjeksiyon kaydedildi. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Movie 2: hareketli ve yapıştırılan parazitler periventriküler alanı ve sarısı. LSFM film sürüklenen veya Perikardiyal boşluk veya sarısı şeklinde olması gereken bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazit. İletilen ışık görünümü için ilk 5 gözlendi s. Floresans görünümü 5.2-25,8 s ile gözlenmiştir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu çalışmada patojen davranış vivo içindeçalışmak için hayvan bir model olarak Zebra balığı avantajları vurgular. Özellikle, bu çalışma onun doğal ortamda patojen T. cruzi görselleştirmek için bir yöntem öneriyor: hematic dolaşım. Dolaşım microenvironment balık çevre memeliler karşılaştırılabilir ve trypanosomatids seyahat, bağışıklık sistemi kaçırmak ve için o çevre²⁵enfeksiyonunda hücrelere bağlama için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu iletişim kuralı T. cruzi bir insan hücre satırı kültürünü ve floresan etiketleme için kamçı formları sonraki yalıtım için en uygun bir yordamın açıklaması sunmaktadır. Daha sonra daha sonra montaj ve LSFM kullanarak görselleştirme için şeffaf Zebra balığı içine parazit başarılı enjeksiyon için uygun ayarları gösterir. Son olarak, bu iletişim kuralı parazit konumu ve LSFM kullanarak dolaşım hareketinde etkin ve etkili vivo içinde görüntüleme için öneriler sunar.

Tripanozomlar kamçı hücre gövdesinden akan ve posterior bölgede çıkar ve asmak organizma²⁶ön kısmında ücretsiz. T. cruzi kendisi kamçı asıl olayın asalağın tüm vücudu undulates vücut önünde sallayarak tarafından propels. Kamçı hareket sadece T. brucei²⁷ (Afrika tripanozomiyasına sorumlu ajan) olduğu gibi parazit hareketliliği için vazgeçilmez değil ama aynı zamanda T. cruziiçinde^{5 gösterildiği hücresel enfeksiyon için kullanılır ,28}. Zebra balığı olmamasına rağmen T. cruziiçin doğal ev sahibi, asıl olayın asalağın hareketliliği burada açıklanan protokolleri kullanarak gelişmekte olan bir kardiyovasküler dolaşım sisteminde okudu. Ayrıca, cyprinids, Zebra balığı, T. carassii ve T. borreli²⁵. gibi sınıf bulaştırmak Tripanozomlar türü bulunmaktadır Bu parazit türler gerçek zamanlı olarak çalışma hareketleri ve bu trypanosomatids eki mekanizmaları için kullanılabilir; Bu tür çalışmalar memeli hücre enfeksiyon sürecine içgörü ödünç verebilirim.

Bu çalışmada, hareketli T. cruzi enjekte gözlenen aşısını balık kardiyovasküler dolaşım seyahat, opak eritrositler ile birlikte hareket ve kardiyovasküler sistem duvar yapıları yapıştırma parazitler vardı. Biz uzun çalışma mesafesi 10 X akromatik ile ev yapımı LSFM kullanılan hava amaç (17.6 mm) 0,25 sayısal bir diyafram ile aydınlatma kol için. 40 X apochromatic su daldırma amacı 0,8 sayısal bir diyafram ve 3.5 mm çalışma mesafesi ile algılama kol için kullanıldı. Aydınlatma amaç odası dışında iken algılama amaç örnek odasına dalmış. Bir coverslip ile mühürlü odası ve optik tutkal Lorenzo ve ark. içinde gösterildiği gibi aydınlatma ışını odası, girmek izin verilen bağlantı noktası ¹⁸ için aydınlatma, biz 50 mW DPSS laser 488 kullanılan nm olan güç bir Acousto optik Tunable filtre tarafından modüle. Algılama yol filtreleri yeşil flüoresan Protein (GFP) veya FITC ile uyumlu kullanılır. Bir kılcal örnek sahibi (ideal ile otomatik rotasyon) ve sıcaklık kontrolü örnek odası ile donatılmış hafif levha mikroskop bu uygulama için uygun olmalıdır. Mikroskop hizaladım ve üretici yönergelerine veya satın alma önce kullanıcının laboratuvar standart protokolleri göre gerekirse kalibre. Bu protokol için istenmeyen anlık ileti yazılımı¹⁹kullanma mikroskop kontrol.

Zebra balığı dolaşımda bulunan larvalar paraziter eki etkili olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kardinal ven parazitler için kadar birkaç dakika bağlı kaldı; kalbinden, subaplar ve duvarlar, kalp kasılma ile salınan tutundu. Daha fazla çalışmaları olup olmadığını T. cruzi kan akımı yönde drift akan eritrositler etkileşim aydınlatmak için kalır. Önceki vitro çalışmalar sağlam yapılar (Yani, kan hücreleri) varlığı veya artmış viskozitesi kan vitrotaklit etmek için sıvı göstermiştir, hareketliliği ve parazit hızı üzerinde önemli bir etkisi vardır ⁹.

Fagositik hücreleri, başlangıçta enfekte hücre türü²⁹amastigotes kaçış sonra T. cruzi enfeksiyon insanlarda seyri ile ilgili birçok soru vardır. Örneğin, hedef organları nasıl gelecekler mi? Kalp, sindirim ve merkez sinir sistemi gibi tercih edilen organlara tropism mekanizmaları nelerdir? O parazitleri en yüksek yoğunluğa sitenin olduğu ilginçtir, bu çalışmada parazitleri başlangıçta kalbinden görüntüsü. Ancak, CFSE sinyal daha sonra 7 gün sonrası enjeksiyonu ile gelişmekte olan bağırsaklarda biriken. Balık ve memeliler anatomisi farklı olsa da, bu çalışmanın sonuçları parazitler tropism bilinen tercih edilen hedef organları organizma farklılıklara rağmen doğru sergilenen gözlendi gibi tropism, bir tür göstermektedir. Bu çalışmanın önemli bir sınırlama ile ilgili deneylerde kullanılan sıcaklık. Zebra balığı larvaları yaklaşık 28 °C tüm işlem sırasında tutulmalıdır. Bu sıcaklık vektör konak (Triatominae alt familya böcekler) benzer olduğu halde, son ana bilgisayarlar (yaklaşık 37 ° C) oluşturan sıcak kanlı memeliler oldukça farklıdır. T. cruzi kamçılı yaşam formları her iki konaklarda sahip olduğu bilinmektedir; Ancak, bu faktör içinde vivohayvan davranışlarında bir etkisi olabilecek akıldan çıkarmamak önemlidir.

4 hafta fertilizasyon deftere nakletmeden fish´s edinilmiş bağışıklık sistemi olgun olmamasına rağmen doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde erken¹⁰geliştirme etkindir. Fagositlerlerce yuttu Tripanozomlar (veri gösterilmez) etiketli 48 veya 96 hpf, gibi erken tespit edildi. Bu parazit görselleştirme için zaman pencere sınırlar. Ancak, bir çalışma fish´s bağışıklık yanıtı değerlendirirken üzerinde odaklanmak için olsaydı, daha sonraki aşamalarında enjeksiyon önerilebilir. Ayrıca, parazitler ve enjeksiyon ile Etiketlenmiş makrofajlar transgenik balık satırlara veya diğer hücreleri bağışıklık sisteminin parazit eki ve olası endositoz mekanizmaları eğitim yararlı olabilir. Bu parazitler CFSE ile etiketlenir, transgenik hücre etiket-meli değil var olmak GFP ve bir işaretleyici sarı veya kırmızı sonunda spektrum gereklidir unutmamak önemlidir.

Parazit hareket detaylı yönü değerlendirmek için onların yörünge 3 boyutlu (3D) takip etmek yararlı olabilir. 3 boyutlu görselleştirme ve işlemi yeniden inşası için yüksek hızlı bir sistem gereklidir. Bu protokol için kullanılan ekipman ile sadece bir düzlemde parazitler görselleştirmek mümkündür. Bu durumda, parazit hareketi sırasında odak düzlemi istikrarı korumak ve onun yörünge bir düzlemde kayıt öncelik.

Burada önerilen metodoloji parazit davranış kardiyovasküler dolaşımda daha ayrıntılı araştırmaya yol açıyor. Özetle, Zebra balığı larva içinde canlı floresan parazitler görüntüleme için temel adımlar şunlardır:(i) erken taranmış embriyo (24-48 hpf) veya larva veya hayvanlar arasında 72-96 hpf yok pigmentasyon ile böylece bunlar şeffaf ve enjekte etmek kolay kullanımı; (ii) görüntü larva sonra en kısa zamanda enjeksiyon parazit izni Fagositik hücreleri tarafından önlemek için; ve (iii) LSFM (örneğin, Perikardiyal bölgesi) ilgi sitesi üzerinde odaklanmak ve odak korumak. Roman Bu yordam trypomastigotes görselleştirme bir ortamda ilk kez T. cruzi yaşayan bir organizma çalışma imkanı sağlamaktadır doğal enfeksiyon çevresinden karşılaştırılabilir verir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Micropipette	Fisherbrand	21-377-815
Agarose RA	Amresco	N605	Regular
Agarose SFR	Amresco	J234	Low Melting point
Aquarium salt	Instant ocean	SS15-10
Cell Count chamber	Boeco	Neubauer
Cell culture flasks	Corning	430639
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
CFSE	ThermoFisher	C34554
Detection objective	Nikon 40x 0.8NA	40x CFI APO NIR
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5648
Dumont #5 fine forceps	World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Fetal calf serum (FCS)	Eurobio	CVFSVF00-01
Filter	Chroma	ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting	Vitrez Medical	160215
Glass capillaries for pulling needles	World precision instruments	TW100-4
Glucose	Gibco	A2494001
HEPES	Gibco	156300-80
Incubator	Thermo Corporation	Revco
Larval microinjection mold	Adaptive Science Tools	I-34
Laser	Crystalaser	DL488-050
L-glutamine	Gibco	250300-81
Methylene blue	Albor Químicos	12223
Micromanipulator	Narishige	MN-153
Micromanipulator system	Sutter Instrument	MP-200	For LSFM
Micropipette puller device	Narishige	PC-10
Microscope	Olympus	CX31
Microscope (inverted)	Olympus	CKX41
Multipurpose microscope	Nikon	AZ100M
Neubauer counting chamber	Boeco Germany
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-163
Petri dish 94x16	Greiner bio-one	633181
Plastic pasteur pipette	Fisherbrand	11577722
Rotation stage	Newport	CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R4130
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Stereoscope	Nikon	C-LEDS
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	886-86-2
TRIS	Amresco	M151
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	R-001-100
Tubes 15 ml	Corning	05-527-90