조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

요약

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

초록

샤 가스 병은 기생 감염 기인 Trypanosoma cruzi, 그 운동 뿐만 아니라 뿐만 아니라 세포 바인딩 및 침략에 대 한 지역화를 위해 중요 하다. T. cruzi 의 연구에 대 한 현재 동물 모델 기생충 vivo에서 인간에서 감염의 초기 단계 동안 이해 기생충 행동에 대 한 도전을 대표의 한정 된 관측을 허용 한다. 이 protozoan flagellar 단계 벡터에 포유류 호스트, 하지만 아무 연구의 운동 성에서 vivo에서설명 하는. 이 프로젝트의 목적은 혈관 시스템에서 T. cruzi 운동 성을 평가 하는 라이브 척추 zebrafish 모델을 구축 했다. 투명 zebrafish 애벌레 붙일 주사 했다 trypomastigotes를 표시 하 고 가벼운 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM), 높은 광학 해상도 살아있는 생물을 시각화 하는 비 침범 성 방법을 사용 하 여 관찰. 기생충이이 기술은 photodamage confocal에 비해 상대적으로 낮은 위험 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 구상 될 수 또는 epifluorescence 현미경 검사 법. T. cruzi 기생충 다른 크기의 혈관에 노 른 자 라이브 zebrafish의 순환 시스템에서 관찰 되었다. 그들은 또한 보일 수 있었다 노른자위 낭 벽에 그리고 심장 수축과 관련 된 강력한 힘에도 불구 하 고 것 밸브에 연결 된. T. cruzi의 LSFM-접종된 zebrafish 애벌레 기생충 순환 시각화 하는 데 사용할 수와 그들의 차 있는 굴곡 운동, 마이그레이션 패턴 및 살아있는 동물의 심장 혈관 시스템의 동적 환경에서 운동 성을 평가 하는 귀중 한 방법입니다.

서문

샤 가스 병은 protozoan 기생충에 의해 발생 T. cruzi. 약 6 7 백만 명이 전세계 T. cruzi와 감염 됩니다. 질병, 라틴 아메리카에서 주로 전송 하지만 미국, 캐나다 그리고 많은 유럽 뿐만 아니라 일부 서 부 태평양 국가, 주로 감염 된 개인¹의 이동 때문에 보고 되었습니다. Chagas 이며 주로 벡터 부담 "키스 버그"로 일반적으로 알려진 Triatominae subfamily에 hematophagic 곤충의 배설물과 접촉 하 여 인 간에 게 전송. 그러나, T. cruzi 또한 수혈, 아이, 또는 기생충²오염 된 식품의 섭취로 어머니 로부터 수직 전이 통해 전송할 수 있습니다. 급성 단계 감염과 주로 무 증상 또는 constitutively 증상은 6에서 8 주까지 지속 후 면역 시스템의 약혼 기생충 부하를 제어 하지만 감염³를 완전히 제거 하지는 않습니다. 대부분의 개인 입력 만성 무 증상 단계; 그러나, 거의 30%의 환자는 심장 시스템 빈도가 소화 및 신경 시스템은 손상 된⁴징후 만성 단계, 개발. 이후 아무 백신을 사용할 수 있으며 샤 가스에 대 한 두 가지 효과적인 약물이 시나리오 질병 치료 및 제어에 대 한 도전 선물 한다: benznidazole 그리고 nifurtimox. 두 치료는 장기간된 관리를 요구 하 고 심각한 부작용²를 할 수 있습니다.

기생 마이그레이션, 세포 부착, 및 호스트; 내에서 침공을 결정 하는 열쇠 이다 vivo에서 동작 T. cruzi 의 동작의 이해를 증가 vivo에서 모델의 부족 소설 치료 접근의 개발을 제한합니다. T. cruzi 감염의 학문 생체 외에서 trypomastigotes의 운동에 바인딩 호스트 세포 막 및 후속 셀룰러 침공⁵에 대 한 중요 하다는 것으로 나타났습니다. Trypomastigotes 취약 셀 라인 공동 문화에 에너지 고갈 세포 침공⁶을 줄이기 위해 표시 되었습니다. 흥미롭게도, trypanosomatids에서 flagellar 운동 또한 기생충 특정 항 체⁷에 대 한 회피 메커니즘으로 특징 되어 있다.

Flagellar 운동 성 광범위 하 게 공부 생체 외에서 Trypanosoma brucei, 아프리카 Trypanosomiasis⁸원인이 밀접 하 게 관련 된 기생충에에서 되었습니다. 이러한 trypanosomes의 운동 성의 생체 외에서 연구 보여주었다 혈액 이나 체액, 점도 등 혈액 세포의 장애물의 존재의 조건의 시뮬레이션 기생충 전진 운동^{9에 대 한 중요 한} . 로 서 아직 그것은 되지 않았습니다 vivo에서혈 류 량에서 기생충의 움직임을 시각화 수 없습니다.

Zebrafish 애벌레는 호스트 병원 체 상호 작용 비보를 공부 하는 강력한 모델입니다. 그들은 작은, 저렴 한, 그리고 인상 Chagas 질병에 대 한 다른 설립된 척추 모델에 비해 상대적으로 쉽게입니다. Zebrafish는 타고 난 및 적응형 면역 시스템, 인 간에 게 유사한 하지만 그들의 적합 한 면역 계통 4 일 게시물 수정 (dpf)에서 개발 하기 시작 하 고 다른 몇 주¹⁰에 대 한 성숙 하지 않습니다. 초기 개발 하는 동안 때만 세포, 즉각적인 면역 간섭¹⁰없이 기생충 행동 공부에 대 한 큰 창이 있다. 그러나, 병원 체 행동을 공부 하 고 대 척추 동물 모델로 zebrafish 애벌레를 활용의 가장 큰 장점은 현미경 검사 및¹¹이미징에 대 한 의무가 그들을 만드는 그들의 광학 투명도에 있다. 또한, 물고기 유전자를 조작 하 여러 도구가 있습니다. 예를 들어 캐스퍼 부담 없이 착 색을 완전히 투명 하 고 개별 장기의 시각화 및 삽입 된 셀¹²의 실시간 추적 유용 동물 만들기와 제 브라의 돌연변이 라인입니다.

라이브 zebrafish confocal 사용 하 여 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 신속 하 게 움직이는 기생충의 종 적 관찰의 주요 제한 높은 수집 속도 및 큰 침투 깊이 좋은 이미지 품질 및 이미지의 불가능성에서 속 인 다 photodamage의 위험입니다. 밝은 시트 형광 micsroscopy (LSFM)이이 관측을 허용 하도록 이러한 한계를 극복 하는 새로운 이미징 기술입니다. 형광 및만 탐지 목표의 초점 평면 조명 두 번째 직교 조명 목표를 검출 하기 위하여 하나의 목표를 사용 하 여 고해상도 광학 섹션 confocal 현미경, 하지만 함께 하는 크게 감소 photodamage, 심지어 epifluorescence 현미경 검사 법¹³에 관하여. 여기에 사용 되는 LSFM 기술은 단일 평면 조명 현미경 (SPIM), 빛의 얇은 시트 zebrafish 애벌레 내 단일 면을 조명 이라고 합니다.

이 방법론의 목적은 애벌레 zebrafish T. cruzi 운동 성 및 비보에관련된 동작을 이해 하기 위한 실행 가능한 비 감염 모델 구축 하는 것입니다. 이 위해 우리는 투명 zebrafish 애벌레 붙일 레이블된 trypomastigotes, 세포 형태, 인간의 감염에 대 한 책임을 주사 하 고 zebrafish의 심혈 관 순환에 T. cruzi 의 움직임을 확인 LSFM를 사용 하 여.

프로토콜

는 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 로스 안데스 대학 (CICUAL)에 의해 승인 했다. Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체와 오염을 방지 하기 위해 지침을 엄격 하 게 따라야 한다 T. cruzi.

참고: 동물 관리 및 유지 보수: 캐스퍼 zebrafish, zebrafish의 유전자 변형된 변형 (Danio rerio) 모든 발달 단계에 그들의 귀중 한 광 투명성 때문이 프로토콜에 사용 됩니다. 물고기는 최적의 치료 조건을 종 ¹⁴, 14 h 빛-10 h 어두운 사이클에서 28 ± 1 ° C, pH (7.0-7.4)에 대 한 제어 멀티 탱크 반복 물 시스템 사용 하 여 조작 됩니다. 동물 라이브 소금물 새우 (Artemia 살 리 나)와 함께 하루에 두 번 먹이 이며 음식 양육과 풍부한. 모든 프로토콜 대학 데 로스 안데스 (C.FUA_14-017)에서 CICUAL에 의해 승인 했다.

1. 계란 물 준비

1. 준비 0.6 g/L 수족관 소금에 역삼 투 (RO) 또는 이온된 (DI) 물과 0.01 mg/L methylene 청색을 솔루션에 추가.
   참고: 측정된 전도도 해야 400-500 µS/c m의 pH 7.2 7.9에서 수준. 낮은 pH, 몇 시간 동안 달걀 물 aerate.

2. Tricaine 재고 솔루션의 준비

97.9 증 류 물 (ddH ₂ O)에서 400 mg tricaine (MS-222)을 용 해 하 여

1. 준비 0.4 %tricaine 재고 솔루션. 가루는 완전히 해산 후 7.0 2.1 mL 1 M를 사용 하 여 pH 조정 트리 (pH 9.0)과 솔루션을 냉장 보관.

3. 준비 1.0%의 저 융 점 Agarose

1.0%의 최종 농도에

1. 디졸브 낮은 녹는 포인트 agarose 분말 달걀에 물. 전자 레인지에 또는 연속 교 반 agarose 솔루션 유형이 나타날 때까지 함께 뜨거운 접시에 혼합물을가 열.
2. 주 보다는 더 이상에 대 한 4 ° C에서 aliquots 저장.

4. 분석 결과 및 배아 컬렉션 짝짓기

1. 주사 3 일전 matings 사육 탱크에서 남성과 여성의 물고기의 건강 한 쌍을 사용 하 여 설정. 유리 구슬 및 인공 식물 농축 산란을 향상 시킵니다. Matings를 오후 동안 설정 해야 하며 하룻밤 왼쪽.
2. 다음날 아침, 스 트레이너를 통해 탱크를 배수 하 고 계란 물으로 계란을 세척 하 여 생성 된 달걀을 수집 합니다. 여과기를 반전 하 고 페 트리 접시에는 스 트레이너를 통해 계란 물을 붓는 의해 모든 계란을 제거 합니다. 태아의 건강을 유지에 어떤 파편 및 전송 플라스틱 피 펫으로 죽은 태아를 제거 하 여 그들의 물을 청소.
3. 는 Zebrafish 준비 표준 ¹⁵에 따라 배아의 개발을 허용 하도록 28.5 ° C의 안정적인 온도에서 인큐베이터에 배아를 전송. 하루에 두 번 배아를 검사 하 고 폐기 inviable 계란 클러치의 건강을 유지 하.

5. 태아 Dechorionation

참고: 배아는 하지 주입의 때에 부 화 하는 경우이 절차는 필요. 이 절차에서는 " 애벌레 " 48 h에서 자신의 chorion 중 동물 게시물 수정 (hpf) 이후는.

1. 실험 당일 해 stereoscope 아래 건강 한 배아를 포함 하는 페 트리 접시를 놓고.
2. 잡아는 chorion의 반대 끝 두 날카로운 집게 (Dumont #5), 하 고 부드럽게 눈물과 풀은 chorion를 엽니다. 약 5-6의 애벌레는 한 번에 주입 하 고 일반적으로 3-4 군데.
3. 는 chorions 전송 피 펫을 사용 하 여 물에서 제거.

6. 사출 재료 준비

1. 준비 1.0 m m 얇은 벽 유리 모 세관 및 micropipette 끌어당기는 장치를 사용 하 여 다음 설정을 가진 바늘: 2 가벼운 무게 + 1 무거운 무게, 2 mm 최고 풀 + 5mm 아래쪽 풀, 75.9 ° C (1 단계) + 78.2 ° C ( 단계 2)입니다. 클레이 모델링의 스트립에 페 트리 접시에 바늘을 저장 합니다. 이상적인 바늘 T. cruzi로 좁은 팁 있어야 약 20 x 1-3 µ m를 측정 하 고 쉽게 바늘을 통해 전달 합니다. 팁의 길이 다를 수 있습니다: 긴 팁 깊은 구조를 도달 하는 데 유용 하지만 짧은 팁 사용자에 대 한 주입을 쉽게 더 엄격한 됩니다.
   참고: 바늘 끝 크기 사용 온도에 따라 달라 집니다: 2 단계에 대 한 더 높은 온도 결과 길고 미세한 팁.
2. 는 DdH ₂ O에서에서 1.5 %agarose 솔루션을 준비 하 고 10 cm 배양 접시에 부 어. 약 1.0 cm의 깊이 커버.
3. 조립식된 microinjection 몰드는 agarose 위에 놓고 그것을 강화 하기 위해 허용.
4. 조립식된 microinjection 금형 밖으로 리프트 및 4 ° c.에 달걀 물 저장을 위해 추가 그러면 밖으로 건조에서 agarose.
5. 4 150 mg/l. 저장소의 최종 농도에 tricaine 재고 솔루션을 추가 달걀 물 ° c.

7. 기생충의 성장 세포 배양

1. 기생충 바르 가스-Zambrano 외에 설명 된 방법을 사용 하 여 인간의 astrocytoma 셀 라인 (CRL-1718)에 유지 됩니다 ¹⁶
2. T25 문화 플라스 크에 인간 세포의 문화를 시작 (면적 = 25 cm ²) 2 x 10 ⁵ 또는 4 x 10 ⁵ 셀 송아지 태아 혈 청 (FCS)의 10%와 RPMI 1640 매체의 4 mL의 조밀도에 보충 2 mM L-글루타민, 4.5 g/L 포도 당, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate, 및 1% 페니실린-스 (라고 " 미디어 완료 "). 5% CO ₂ 환경에서 37 ° C에서 astrocytoma 문화를 품 어.
3. 는 단층 confluent 일단 3 분에서 37 ° C. 시각적으로 표 셀 분리, 배양에 의해 트립 신-EDTA의 0.25%의 2 개 mL를 사용 하 여 셀을 분리 하 고 15 mL 튜브에 10% fcs RPMI 1640의 3 mL를 사용 하 여 트립 신 솔루션 차단.
4. 분리기 1350 x g.에서 5 분 동안 세포 현 탁 액
5. 15 mL 튜브에 1350 x g 22에서 5 분 동안 원심 분리기 DMEM 매체에 결과 세포 펠 릿을 세척 ° c.
6. Neubauer 챔버와 40 X 확대 가벼운 현미경에 생존 확인에 수동으로 셀.
7. 부드럽게 다시 일시 중단 세포 완전 한 미디어의 4 ml에서 작은 고 그것을 사용 하 여 새로운 세포 배양 T25 문화 플라스 크 당 2 × 10 ⁵ 셀을 사용 하 여 만들려고.

8. T. cruzi 문화 및 라벨링

1. 기생충은 원래는 감염 된 인간에서 얻은 고 T. cruzi 다 스트레인 (MHOM/CO/01/다)로 변형 유전자 개별 입력 단위 (DTU) TcI ¹⁶. 인간의 astrocytoma 셀 문화 상쾌한 1350 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기에서 움직이는 기생충을 수집 하는 경작의 3 또는 4 일 후 폐기 매체.
   참고: 완전 한 매체에서 기생충 다시 astrocytoma 셀 T25 문화 플라스 크와 1:1 비율에 문화에 대 한 사용할 수 있습니다.
2. 부드럽게 다시 10 ml 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 0.1 %FCS 5 분 동안 원심 분리기 x 1350 x g.에서 펠 릿 일시 중단
3. 는 상쾌한 삭제 하 고 다시 1 mL의 PBS에 일시 중지. 받아 Neubauer 챔버에 free-swimming 기생충 카운팅을 위한 10 µ L.
4. 다시 일시 중단 된 기생충 (990 µ L)의 나머지를가지고 고 Carboxyfluorescein Diacetate Succinimi의 1 µ L을 추가dyl 에스테 르 (CFSE), 최종 농도 5.0 µ M. 실 온에서 10 분 동안 품.
   참고:에서 5mm CFSE 주식 해야 한다 aliquoted 유지-20에 ° c.
5. 작은 기생충 (1350 x g, 5 분). 튜브를 터치 하 여 기생충 펠 릿을 다시 구성 하 고 10 ml 1 x PBS-0.1% FCS (1350 x g, 5 분) 이후 스핀 뒤의 세척.
6. 는 상쾌한 취소 및 약의 최종 농도 얻기 위해 적절 한 볼륨 1 X PBS에 부드럽게 다시 중단 레이블이 기생충 펠 릿 주사에 대 한 10-20 기생충/nL.
7. 작은 볼륨을 사용 (∼ 10 µ L, 1 x 10 ⁴-2 × 10 ⁴ 기생충 약)의 생존 능력을 평가 라벨 trypomastigotes. 거꾸로 형광 현미경 기생충의 직접적인 시각화를 위해 사용할 수 있습니다. 전송된 빛 모드에서 기생충 이동 확인 하십시오. 형광 모드를 사용 하 여 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 필터 기생충 라벨 평가.

9. Zebrafish 애벌레 주입

1. 기생충 로드
   1. 물의 resuspension (100 µ L)에서 기생충의 10 µ L을 10 µ L microloader 피 펫 팁을 사용 하 여 밀봉된 유리 바늘에 그들을 로드.
   2. 는 micromanipulator의 바늘 홀더 유리 바늘 삽입, 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 및 배치는 stereoscope 옆.
   3. 무딘 오픈 만드는 바늘을 잘라 stereoscope 아래 좋은 집게를 사용 하 여 종료 하 고 1 양의 주사를 놓기 크기 측정 nL (이것이 미네랄 오일 ¹⁷에서 측정 시에 m m 0.12 0.13의 구슬 지름에 해당). 더 팁은 바늘 구조에 도달할 수 있도록 선호는 조직 손상 없이 물고기 깊숙한. 이 프로토콜에 무뚝뚝한 바늘은 사용 하지만, 경사진된 바늘 뿐만 사용할 수 있습니다.
2. 장착
   1. 48의 애벌레 Anesthetize hpf, 150 mg/L tricaine와 함께. 터치, 응답 하지 않는 확인 하지만 심장 박동 확인.
   2. Microinjection agarose 형 가로 위치에 있는 애벌레를 배치.
   3. 는 stereoscope 옆 바늘 홀더 놓고는 바늘의 팁 보기의 필드의 중앙에는 micromanipulator를 조정 합니다. 바늘 팁 애벌레 노 른 자는 단계 6.2-6.4에서에서 준비 하는 페 트리 접시를 이동 합니다. 심장 박동을 계속 유 충의 상태를 확인 하십시오.
   4. 다음과 같이 microinjector 값을 설정: 사출 9.6 파운드 당 인치 (psi) 압력, 압력 개최: 20 psi; 게이팅의 100 밀리초 범위 1.9 (10.9 ms에 해당)의 기간 값. 주사의 볼륨 1-3 nL, 약 10-20 기생충/nL과 사이 여야 합니다.

10. 기생충의 주입

1. 넣기 어의 덕트에 노른자위의 우수한 앞쪽 부분에 물고기. 이 단계는 주입 후 동물 생존을 위해 연습 한다. 성공적으로 5-6 애벌레를 주사를 약 10 분 걸립니다.
2. 컨트롤, 1-2 애벌레 같은 차량 볼륨 (1 x PBS) 주입.
3. 신선한 계란 물에 유 충을 즉시 전송.

11. LSFM 장착의 주입 애벌레

1. 빈 페 트리 접시에 기생충을 주입 하는 유 충을 전송 하 고 주변 물 플라스틱 피 펫과 흡수 성 종이 조심 스럽게 제거. 낮은 용 해 점 agarose preheated 1.0%의 100 µ L를 즉시 추가 (agarose 준비를 위한 3 단계를 참조) 유 충을 커버. agarose 40 아니다 보장 ° c.
2. 1.0 m m 유리 모 세관 내부 직선 와이어를 삽입 하 고 수직 위치에서 유 충을 빨 플런저로 그것을 사용 합니다. 유 충의 위 agarose의 작은 금액을 두고 있는지 확인 하십시오. (이것은 몇 분 필요) 유 충을 노출 하기 전에 agarose 굳은 때까지 기다립니다. 필요한 경우 유 충 아래 초과 agarose를 밀어 하 고 끄고 잘라
3. 는 현미경 샘플 홀더에 모 세관을 배치 하 고는 모 세관에서 무료로 응답 될 때까지 유 충을 포함 하는 끝에 밖으로 밀어. 표본 실 tricaine 솔루션 (150 mg/L)와 28에 설정 온도 가득 한다 ° c.
4. 위치는 XYZ micromanipulator 시스템을 사용 하 여 검색 목표의 눈동자 앞 유 충. 세로 축에 대해 회전, 대 회전 무대를 사용 합니다. 유 충의 위치에서 이루어져야 한다 애벌레 구조를 명확 하 게 식별 하기 위해 전송된 빛 모드.

12. LSFM 이미징의 주입 기생충

형광 하
1. 변경 모드 조명 강도 photodamage 감소 및 시간 분해능을 최적화 노출 시간 조정 하 고. 이러한 특정 실험에 대 한 샘플 2.8-3.0 mW의 힘을 사용 하 고 200 ms 6.45 µ m 픽셀와 검출 파장에서 ~ 70%의 양자 효율을 카메라를 사용 하 여 각 프레임을 노출. 이러한 설정은 약 5 프레임/s의 높은 가능한 숫자 조리개와 목표를 사용 해야 적절 하 게 노출 된 이미지에 발생 한다.
2. 는 관심이 (ROI)의 비디오 수집을 시작합니다. 우리의 경우에, 기생충은 관찰 밸브에 연결 된 자유롭게 움직이는 심장 주변. 그것은 시간, 단일 면의 비디오를 하거나 micromanipulator 또는 piezo galvo 시스템 기생충 이동 하는 동안 다른 비행기에 초점을 사용 하 것이 좋습니다.
   참고:이 절차는 짧은 수집 시간 최대 2 시간으로 유용 합니다. 장기 수집에 대 한 애벌레 거치 되어야 한다 사용 하 여 대체 방법을 ²⁰.

13. 이미지 처리 및 인수 데이터 분석

참고: 이미지 처리 2.90 g h z 프로세서, 8.00 GB의 메모리, 그리고 1.00 GB의 메모리와 비디오 카드는 개인용 컴퓨터에서 수행 되었다.

오픈 인수는

데이터 집합 이미지 프로세싱 소프트웨어 선택의. 오픈 소프트웨어 피지 LSFM 데이터 처리 및 분석 ²¹ 좋습니다.
1. 이미지 분석 소프트웨어에는 이미지를 향상 시키기 위해 밝기 및 대비 레벨을 조정.
   참고: 고정 된 매개 변수는이 경우에 사용 하지만 선택 된 " 자동 " 옵션은 초기 향상을 얻기 위해 유용할 수 있습니다.
2. ROI 선택.
   참고: 개별 기생충을 추적, 피지는 모두 수동 및 자동 추적 플러그인을 사용할 수.

14. 몇 군데 애벌레 복구

1. agarose를 사용 하 여에서 신중 하 게 유 충 제거 미세 집게와 머리 루프 도구. 15 분 28 ± 0.5 ° c.에 인큐베이터에 유 충을 반환 후 신선한 계란 물과 복구에 대 한 확인을 다시 물고기를 전송
2. 또는 tricaine의 과다와 군데 애벌레를 안락사를 진행 합니다. 그런 다음, 염소의 솔루션에 애벌레를 소개 (6.15 %NaClO) 기생충을 죽 일 분. 기관에 따라 처분 ' s 표준 프로토콜.

결과

주입에 대 한 최적의 조건:

Zebrafish 애벌레의 그룹 24, 48, 72, 96, 및 120에 주입 했다 hpf, 다른 해 부 사이트에서 그리고 그들의 생존은 5 일 동안 매일 시험 되었다. 배아 24에 주입 후 5 일 포스트 주입, hpf 했다 6.25% (2/32) 생존, 95% (38/40) 48에 주입 하는 애벌레의 hpf 살아남은 반면. 컨트롤, 애벌레는 1 x PBS와 차량으로 주입 했다. 차량 주입 하 고 기생충을 주입 애벌레, 물고기의 생존 율에 더 종속 기생 효과 나타내는 사이 생존에 차이가 있었다 (p = 0.08). 72-120 hpf 사이 주입 애벌레 지속적인 주입 볼륨에서 48 hpf 주입 애벌레에 비해 생존 율을 했다. 여기에 제시 된 모든 절차에 대 한 48 hpf 애벌레는 조작 하는 데 개발 기관과 분명 손상 없이 쉽게 꿰 뚫을 수 피부 주입 후의 그들의 용이성으로 인해 사용 되었다.

48에 주입 하는 애벌레 hpf 했다 근육, hindbrain 심, otic 소포, notochord, 및 노 른 자 삭에서 어의 덕트 꼬리 pericardial 공간에 주입. 다른 해 부 사이트에 주입 하는 애벌레의 생존에 차이가 있었다. 그러나, 주입 하는 빠르고 쉬운 지역 어의 덕트 (그림 1, 영화 1) 노 른 자 골목의 앞쪽 부분에 위치한 했다. 해당 사이트에 주입 수 중요 한 구조에 상해의 더 낮은 위험과 높은 볼륨의 소개. 또한, 24-72 hpf, 사이이 지역 개발 맥 관 구조 및 심장¹¹에 직접 액세스 하는 최적의 사이트입니다.

LSFM를 사용 하 여 기생충 시각화:

8-10 분에 어 덕트 T. cruzi 의 주입 다음, 내 기생충 zebrafish 애벌레 LSFM를 사용 하 여 그들의 CFSE 형광 신호 및 애벌레의 광학 투명도에 확인 되었다. 접종, 이후 기생충 순환 시스템 또는 혈액의 흐름 (그림 2, 그림 3)의 방향으로 여행 주위 벽에 준수도 관찰 되었다. 그것은 심장 수축, 기생충의 준수에 대 한 분자 메커니즘 (영화 2, 영화 3 우리의 척추 동물 모델에서 더 효과적일 수도 있습니다 나타내는 함께 진동 하는 기생충 같은 것 밸브, 심장 구조에 연결 된 때 추가 동영상 1). 또한 T. cruzi 나중 reabsorbed 되며 zebrafish 내장²²의 일부가 되는 구조 ( 그림 2, 영화 2) 애벌레 노 른 골목의 벽에 준수 됩니다. 이것 수 있습니다 감염 된 인간, 만성 질환 단계 동안 발생 하는 유사한 cardiomyocytes와 소화 신경^23,24에서 기생충을 발견 하는. 하지 때, 기생충 적혈구 ( 그림 3, 영화 4)과 같은 방향으로 혈액의 흐름을 통해 떠내려. 기생충, 물고기의 다른 크기의 혈관에서 관찰 될 수 있었다 그러나 pericardial 공간 및 혈액 흐름 ( 그림 2, 그림 3, 보충 영화 2)를 포함 하는 인접 한 노른자위 지역에서 더 풍부 했다.

10 분 포스트 주입에 그것은 더 어려운 자리 단일 형태의 맥 관 구조, 그리고 신속 하 게 화면 다른 해 부 사이트 (40 X 확대에서 LSFM의 제한 된 시야 때문에 물고기의 무 능력에 따라 그들의 유통으로 인해 기생충 ). 24 시간 후 분사 (hpi)을 게시, CFSE 신호 개발 소장 (보충 그림 1) 근처 지역에서 축적 시작 합니다.

그림 1: 최적의 주입 사이트. (A) 이미지 애벌레 48의 hpf 일반 stereoscope를 사용 하 여 어 (노란색 화살표)의 덕트에 최적의 주입 사이트를 보여주는. (B) 확대의 상자를 보여주는 어 (노란색 화살표)의 덕트에 볼. 눈금 막대 = 200 µ m (A), 50 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 48 hpf 애벌레에 정적 기생충의 LSFM 이미지. T. cruzi 기생충 (노란색 화살표) 남아 시간 경과 시퀀스에 걸쳐 노 른 골목의 벽에 준수 (7.2 s, 17.2 s 및 27.2 s), 기생충 주입 후 약 ~ 15 분. 기생충의 위치에 변화는 적어도 30의 수집 기간 동안 관찰 한, 아 트리 움; 미 v, 심입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: LSFM를 사용 하 여 pericardial 공간에서 여행 하는 기생충의 궤적. T. cruzi 기생충 혈 (트랙 빨간색으로 표시)의 방향에 따라 pericardial 공간 (PS)에서 표류 하는 동안 추적할 수 있습니다 기생충 주입 후 약 ~ 15 분. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 1: 48 유 충에 노른자위의 혈액 순환 밸리 hpf. 영화 48 유 충의 hpf 혈액 순환 밸리 또는 일반 stereoscope를 사용 하 여 어의 덕트를 보여주는. 다른 지역 비디오는 덕트를 통해 순환 적혈구를 표시를 하는 동안 집중 된다. 노란색 화살표는 최적의 주입 사이트를 보여 줍니다. 영화 기록 했다 기생충 주입 후 약 10-15 분. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 2: T. cruzi 기생충 른 골목의 벽에 부착. LSFM 기생충 주사 후 T. cruzi 기생충 남아 노른자위 sac 약 10-15 분에 준수 애벌레 48 hpf 보여주는 영화. 기생충의 위치에 변화는 적어도 30의 수집 기간 동안 관찰 되었다 s. a, 아 트리 움; v, 심입니다. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 3: T. cruzi 기생충 심장의 벽에 부착. LSFM 영화 48 유 충의 hpf는 T. cruzi 기생충 비를 보여주는n 강한 심장 수축에도 불구 하 고 심장 혈관 벽에 붙어 기생충 주입 후 약 10-15 분. 적혈구 검은 둥근된 그림자로 관찰 될 수 있다. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 4: 기생충 pericardial 공간에서 이동. LSFM pericardial 공간에 떠도는 애벌레 48 hpf 보여주는 T. cruzi 기생충의 영화. 2 기생충 다른 시간 지점 (빨간색 동그라미와 노란색 원에 ID 2: ID 1)에서 비슷한 궤적을 따라 추적할 수 있습니다. 영화 기록 했다 기생충 주입 후 약 10-15 분. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 노 른 자에서 축적의 CFSE 형광 신호. 48에서 주입 wildtype 유 충의 stereoscope 이미지 hpf 어 덕트에서. CFSE 형광 신호 2 일 포스트 주입 (48 hpi) 후 노 른 자에 점차적으로 축적. 눈금 막대 = 500 µ m. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 1: 벽과 순환 시스템의 밸브에 부착 된 기생충. 48에서 주입 야생 유형 유 충의 stereoscope 시간 시리즈 이미지 hpf. T. cruzi 기생충 것 밸브에서 심장 근육 수축으로 synchrony에서 이동 캡처 0.2 s 간격으로 이미지를 가져옵니다. 영화는 기생충 주입 후 약 30 분을 기록 했다. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2: 이동 및 준수 기생충 뇌 공간에 노 른 자. LSFM는 애벌레 48 hpf 보여주는 T. cruzi 기생충 표류 또는 pericardial 공간 또는 노른자위에 준수의 영화. 첫 번째 5 전송된 빛 보기 관찰 되었다 s. 형광 볼 5.2 25.8 s에서 관찰 되었다. 영화 기록 했다 기생충 주입 후 약 10-15 분. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 연구는 병원 체 행동에서 vivo에서공부에 대 한 동물 모델 zebrafish의 장점 강조 표시 합니다. 특히,이 연구 병원 체 T. cruzi 그것의 자연 환경에서 시각화 하는 방법을 제안: hematic 순환. 물고기에 순환 microenvironment의 환경, 포유류의 비교 이며 trypanosomatids 여행, 면역 시스템을 회피 한 그 환경²⁵에 감염에 대 한 셀에 연결 하기 위한 메커니즘을 진화 했다. 이 프로토콜은 T. cruzi 는 인간 세포 선에서의 문화와 flagellar 형태의 형광 라벨에 대 한 후속 격리에 대 한 최적의 절차의 설명을 제공합니다. 다음 나중에 장착 하 고 LSFM를 사용 하 여 시각화에 대 한 투명 한 zebrafish에 기생충의 성공적인 주입에 대 한 적절 한 설정을 보여 줍니다. 마지막으로,이 프로토콜 기생충 위치 및 LSFM를 사용 하 여 순환에서 운동의 효율적이 고 효과적인 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 제안을 제공 합니다.

Trypanosomes의 편 셀 시체에서 흐르는 그 후부 지역에서 나온다 및 정지 유기 체²⁶의 앞쪽 부분에 있습니다. T. cruzi 는 기생충의 전신 undulates 몸, 앞 편 쳐서 자체 추진력을 얻습니다. Flagellar 움직임은 뿐만 아니라 기생충 운동 성, T. brucei²⁷ (아프리카 trypanosomiasis의 원인이 대리인)의 경우에 대 한 필수적인 하지만 그것은 또한 사용 세포 감염, T. cruzi^{5에서에서 입증 되었습니다. ,28}. Zebrafish T. cruzi의 자연 호스트 하지 않더라도, 기생충의 운동 성 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 개발 심혈 관 순환 시스템에 공부 될 수 있다. 또한, cyprinids, zebrafish, T. carassii , T. borreli²⁵. 등의 클래스를 감염 trypanosomes 종이 있다 이러한 기생충 종의 움직임 및 이러한 trypanosomatids;의 첨부 파일 메커니즘 실시간으로 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 연구는 포유류 세포 감염 과정에 대 한 통찰력을 빌려 수 있습니다.

이 연구에서는 운동 T. cruzi 주입 기생충 접종된 물고기의 심장 혈관 순환을 통해 관찰 여행, 불투명 한 적혈구, 함께 이동 그리고 심장 혈관 시스템 벽에 구조를 준수 했다. 우리 긴 작동 거리 10 색 X 집 만든 LSFM를 사용 공기 목표 (17.6 mm) 0.25의 숫자 조리개와 조명 팔. 0.8의 숫자 조리개와 3.5 m m의 작동 거리 apochromatic 물 침수 목표 X 40 감지 팔 사용 되었다. 조명 목표 챔버 외부 동안 검출 목적 샘플 챔버에 몰두 했다. 챔버는 coverslip로 밀봉 및 광학 접착제 로렌조 외. 에서처럼 조명 빔 챔버, 입력에 대 한 허용 포트 ¹⁸ 조명, 우리 50 mW DPSS 레이저 시 사용 488 nm 인 전원 Acousto 광학 가변 필터에 의해 변조 했다. 검색 경로 사용 필터 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 FITC와 호환 됩니다. (이상적으로 자동된 회전)와 모 세관 샘플 홀더를 샘플 챔버의 온도 제어를 갖춘 빛 시트 현미경이 응용이 프로그램에 적합 해야 합니다. 현미경 정렬 하 고 필요한 경우 제조업체의 지침 또는 수집 하기 전에 사용자의 실험실 표준 프로토콜에 따라 보정 해야 합니다. 이 프로토콜에서 우리 SPIM 소프트웨어¹⁹를 사용 하 여 현미경 제어.

Zebrafish의 순환에 애벌레 기생 첨부는 효과가 중요 하다. 추기경 맥락에서 기생충 남아 몇 분;에 대 한 연결 에, 그들은 밸브와 벽, 심장 수축과 진동 개최. T. cruzi 혈액 흐름의 방향으로 드리프트 흐르는 적혈구와 상호 작용 하는 여부를 명료 하 게 하기 위해 추가 연구가 남아 있다. 이전 체 외에서 연구 것으로 나타났습니다 (즉, 혈액 세포), 단단한 구조의 존재 또는 생체 외에서혈액을 모방 하는 액체의 증가 된 점도, 운동 성 및 기생충의 속도에 중요 한 영향 ⁹.

Amastigotes phagocytic 세포, 처음 감염 된 세포 유형²⁹탈출 후 인간에서 T. cruzi 의 감염의 과정에 관한 많은 질문이 있다. 예를 들어, 그들이 어떻게 그들의 표적 기관에 도착 합니까? 기본 장기, 심장, 소화, 및 중앙 신경 시스템에 차 있는 굴곡 운동에 대 한 메커니즘은 무엇입니까? 흥미롭게도,이 연구는 기생충 했다 처음 몇 군데 마음에 기생충의 높은 밀도의 사이트 때문에. 그러나, CFSE 신호 이후 축적 된 개발 소장에 7 일 게시물 주입. 물고기와 포유류의 해부학은 다른,이 연구의 결과 기생충 전시 organismal 차이도 불구 하 고 알려진된 선호 대상 기관으로 차 있는 굴곡 운동 관찰로 차 있는 굴곡 운동의 형태를 보여줍니다. 이 연구의 1 개의 중요 한 한계는 실험에 사용 되는 온도 염려 한다. Zebrafish 애벌레 전체 절차 동안 약 28 °C에 보관 한다. 이 온도 벡터 호스트 (Triatominae subfamily의 곤충)에 비슷한 수 있습니다, 하지만 그것은 매우 최종 호스트 (약 37 ° C)를 구성 하는 온 혈 포유류 다릅니다. T. cruzi 는 두 호스트; flagellar 생활 양식 있는 알려져 있다 그러나, 곰 염두에 두고이 요소에 비보동물 행동에 영향을 미칠 수 있습니다 중요 하다.

Fish´s 적응형 면역 시스템은 아니지만 성숙 4 주 게시물 수정 될 때까지, 타고 난 면역 계통은 초기 개발¹⁰에 활성화 됩니다. 빠르면 48 또는 96 hpf, phagocytic 세포 trypanosomes (데이터 표시 되지 않음) 표시 잠겼습니다 데 관찰 되었다. 이 기생충의 시각화를 위한 시간 창을 제한합니다. 그러나, 연구는 fish´s 면역 반응을 평가에 초점을, 나중 단계에서 주입 권장 수 있습니다. 또한, 레이블이 지정 된 대 식 세포와 유전자 변형 물고기 라인으로 기생충의 주입 또는 면역 시스템의 다른 셀 기생충 첨부 파일 및 가능한 endocytosis 메커니즘을 공부 하는 데 유용 수 있습니다. 그것은 기생충 CFSE 표시 됩니다, 유전자 변형 셀 라벨 해서는 안됩니다 GFP, 스펙트럼의 노란색 또는 빨간색 끝에 마커 필요한 경우 유의 해야 합니다.

기생충 운동의 상세한 방향을 평가 하기 위해 3 차원 (3D) 그들의 궤적을 따라 유용할 수 있습니다. 3D 시각화 및 프로세스의 재건, 대 한 고속 시스템 필요 하다. 이 프로토콜에 사용 되는 장비와 함께 하나의 평면에 기생충을 시각화 수는 만입니다. 이 경우에, 우리가 우선 기생충 운동 동안 초점면 안정성을 유지 하 고 한 평면에서의 궤적을 기록.

여기에 제안 된 방법론 추가 심혈 관 순환에 기생충 행동을 조사 하는 방법은 불법 체류자. 요약 하자면, zebrafish 애벌레 내부 라이브 형광 기생충 이미징 필수 단계는:(i)의 사용 초기 빗금된 배아 (24-48 hpf) 또는 애벌레, 또는 아무 염색으로 72 96 hpf 사이 동물 그렇게 그들은 투명 하 고 쉽게 주사; (ii) 이미지 애벌레 phagocytic 세포; 기생충 정리를 피하기 위해 주입 후 즉시 그리고 (iii) LSFM (예를 들어, pericardial 지역)의 사이트에 집중 하 고 초점을 유지. 이 새로운 절차 수 있습니다 trypomastigotes의 시각화를 환경에서 처음으로 제공 하는 살아있는 유기 체에서 T. cruzi 공부 가능성, 그것의 자연 감염 틈새에 비해.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Micropipette	Fisherbrand	21-377-815
Agarose RA	Amresco	N605	Regular
Agarose SFR	Amresco	J234	Low Melting point
Aquarium salt	Instant ocean	SS15-10
Cell Count chamber	Boeco	Neubauer
Cell culture flasks	Corning	430639
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
CFSE	ThermoFisher	C34554
Detection objective	Nikon 40x 0.8NA	40x CFI APO NIR
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5648
Dumont #5 fine forceps	World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Fetal calf serum (FCS)	Eurobio	CVFSVF00-01
Filter	Chroma	ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting	Vitrez Medical	160215
Glass capillaries for pulling needles	World precision instruments	TW100-4
Glucose	Gibco	A2494001
HEPES	Gibco	156300-80
Incubator	Thermo Corporation	Revco
Larval microinjection mold	Adaptive Science Tools	I-34
Laser	Crystalaser	DL488-050
L-glutamine	Gibco	250300-81
Methylene blue	Albor Químicos	12223
Micromanipulator	Narishige	MN-153
Micromanipulator system	Sutter Instrument	MP-200	For LSFM
Micropipette puller device	Narishige	PC-10
Microscope	Olympus	CX31
Microscope (inverted)	Olympus	CKX41
Multipurpose microscope	Nikon	AZ100M
Neubauer counting chamber	Boeco Germany
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-163
Petri dish 94x16	Greiner bio-one	633181
Plastic pasteur pipette	Fisherbrand	11577722
Rotation stage	Newport	CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R4130
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Stereoscope	Nikon	C-LEDS
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	886-86-2
TRIS	Amresco	M151
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	R-001-100
Tubes 15 ml	Corning	05-527-90