Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

Resumen

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Resumen

Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es el potencial de toda la vida de lo teleósteos retina retina neurogénesis y regeneración después de daño severo. Investigar los caminos de la regeneración en el pez cebra podría traer nuevas ideas para desarrollar estrategias innovadoras para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en los mamíferos. En este documento, nos centramos en la inducción de una lesión focal en la retina externa en pez cebra adulto por medio de un láser de diodo de 532 nm. Una lesión localizada permite investigar los procesos biológicos que tienen lugar durante la degeneración retiniana y regeneración directamente en el área de daño. Usando la tomografía de coherencia óptica no invasivos (OCT), hemos sido capaces de definir la ubicación de la regeneración posterior área y monitor dañada en vivo. De hecho, la proyección de imagen OCT produce imágenes de alta resolución, transversales de la retina de pez cebra, proporcionando información que antes sólo estaba disponible con análisis histológicos. Para confirmar los datos de OCT en tiempo real, se realizaron cortes histológicos y la respuesta regenerativa después de la inducción de la lesión retiniana fue investigado por immunohistochemistry.

Introducción

La visión es probablemente el sentido más esencial del ser humano y su deficiencia tiene un alto impacto socio-económico. En el mundo industrializado, enfermedades degenerativas de la retina responsables de la mayoría de la pérdida de la visión y ceguera entre la población adulta¹. Retinitis pigmentosa (RP) es la causa hereditaria más común de ceguera en personas entre las edades de 20 y 60 años, que afecta a aproximadamente 1,5 millones de personas en todo el mundo^2,3. Es una familia heterogénea de enfermedades hereditarias de retinales caracterizada por la pérdida progresiva de los fotorreceptores (PRs) seguida por degeneración del epitelio retiniano del pigmento y, posteriormente, gliosis y remodelación del interior de las neuronas⁴. El curso de la enfermedad puede explicarse por la pérdida incremental de los dos tipos de células de PR, generalmente a partir de barras, que son responsables de la visión acromática en luz dévil y conos, que son esenciales para color visión y agudeza visual⁵. Un defecto genético único es suficiente para causar RP. Hasta ahora más de 130 mutaciones en genes de más de 45 se han asociado con la enfermedad⁶. Esto conduce a diferentes fenotipos de la enfermedad y es una de las razones que la terapia génica no generalizables y así un acercamiento terapéutico complicado. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos generales para el tratamiento de degeneraciones retinianas en cegar enfermedades.

Degeneración retiniana a menudo implica la pérdida de PR; por lo tanto, la muerte celular PR es una característica distintiva de los procesos degenerativos de la retina⁷. Ya se ha demostrado que estimula la muerte celular de PR Müller glia celular (MC) activación y proliferación⁸. MCs, el tipo de célula glial importante en la retina vertebrado, se consideraban ser nada más que un "pegamento" entre las neuronas de la retinales. En los últimos años, muchos estudios han demostrado que MCs actuar como algo más que mera estructural de apoyo⁹. Entre las diferentes funciones, MCs participa también en la neurogénesis y reparación de¹⁰. De hecho, en respuesta a factores difusibles de la retina degeneración, MCs aumentan significativamente la expresión de la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP). Por lo tanto, el etiquetado de GFAP puede utilizarse como un marcador de activación de MC como una respuesta secundaria a lesión de retina y degeneración¹¹.

Recientemente, hemos desarrollado una adaptación de la novela de lesión focal usando un laser para inducir la degeneración retiniana en el pez cebra (Danio rerio). Lesión focal es ventajoso para el estudio de ciertos procesos biológicos como la migración de células en el sitio lesionado y la sincronización precisa de eventos que tienen lugar durante la regeneración retiniana¹². Además, el pez cebra se ha convertido en importante en la investigación visual debido a las similitudes entre su sistema visual y la de otros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de las retinas de humanas y teleósteos muestran algunas diferencias. Por consiguiente, las retinas de humanos y de pez cebra contienen las mismas clases de células principales en el mismo modelo de capas, donde fotorreceptores sensibles a la luz ocupan la capa más externa, mientras que las neuronas de proyección retiniana, las células del ganglio, residen en el interior capa neuronal, próxima a la lente. Las interneuronas retinianas, amacrinas, bipolar y células horizontales, localización entre los fotorreceptores y del ganglio celular capas¹³. Además, la retina de pez cebra es dominado por el cono y por lo tanto más cerca de la retina humana que, por ejemplo, la retina roedor intensamente estudiada. Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es la neurogénesis persistente en la retina de peces y la regeneración retiniana después del daño. En el pez cebra, MCs puede dedifferentiate y mediar la regeneración en la retina lesionada^14,15. En pollo, MCs tienen cierta capacidad también para volver a entrar en el ciclo celular y dedifferentiate. Después de lesión retiniana en peces adultos, MCs adoptar ciertas características del progenitor y las células madre migran al tejido retiniano dañado y producir nuevas neuronas¹⁶. Perfil de expresión génica de MCs mamíferos reveló inesperadas similitudes con progenitores retinianos, y evidencia de potencial neurogénico intrínseco de MCs en pollo, roedor y retina incluso humana crece¹⁷. Sin embargo, por qué la respuesta regenerativa en aves y mamíferos es menor comparada con la respuesta robusta en peces no se entiende todavía. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de reparación endógena en el pez cebra puede sugerir estrategias para estimular la regeneración retiniana en mamíferos y humanos. Empleando el mecanismo de reparación endógena de MCs como una herramienta terapéutica para el tratamiento de pacientes con la degeneración retiniana tendría un impacto excepcional para nuestra sociedad.

En el presente, ofrecemos los pasos necesarios para emplear el modelo de la degeneración y regeneración en investigación oftálmica. Nos centramos primero en inducir daño focal en la retina neurosensorial, luego en la proyección de imagen de eventos a la sitio de la lesión y finalmente visualizable de las MCs adyacentes. El protocolo general es relativamente fácil de realizar y abre una amplia variedad de posibilidades para evaluar la retina luego.

Protocolo

todos los experimentos se adhirió a la declaración para el uso de animales en investigación de visión de la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) y oftálmica y respetar las normas relacionadas de las autoridades gubernamentales.

1. animales

1. TgBAC mantener (gfap:gfap-GFP) pez cebra 167 tensión de (AB) de edades comprendidas entre 6-9 meses en condiciones normales en el agua con una temperatura de 26,5 ° C y 14/10 h luz/oscuridad ¹⁸.
2. Siga las pautas de cuidado de los animales de las instituciones involucradas para los experimentos con animales después de la aprobación por las autoridades gubernamentales.

2. Anestesia sistémica reversible

1. Prepare la solución de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Metanosulfonato) disolviendo 400 mg de polvo de Metanosulfonato en 97,9 mL de agua del tanque y 2.1 mL de 1 M de Tris tampón salino (TBS). Ajustar a pH 7,0 con 1 M Tris (pH 9) y almacenar a 4 ° C en el oscuro hasta un mes.
   Nota: Metanosulfonato debe estar preparado en agua como las condiciones naturales del animal, preferentemente agua de tanque original.
2. Diluir la solución madre 1:25 en agua del tanque y utilizar de inmediato.
3. Colocar el pez cebra en una placa de Petri que contenga 50 mL de solución de la anestesia hasta que se vuelven inmóviles y no responden a los estímulos externos (aproximadamente 2-5 min, dependiendo de la edad y peso) de 10 cm.
4. Transferir cada pescado con la mano a un soporte de silicona a medida para el tratamiento de láser ( figura 1A).
   ¡PRECAUCIÓN! Los peces pueden permanecer anestesiados fuera de la pecera hasta 10 min solamente.
5. Para invertir anestesia tras el tratamiento o la proyección de imagen, coloque el pez cebra en envase que contiene el tanque de agua.
6. Para apoyar la recuperación, crear un flujo de agua de tanque fresco sobre las branquias moviendo el pez cebra y hacia atrás en el agua.

3. Lesión Focal en la Retina con láser

Nota: A 532 nm láser de diodo se utiliza para crear daño luz focal sobre la retina del pez cebra. El montaje experimental del laser permite el establecimiento de una lesión retiniana focal reproducible en pez cebra adulto.

1. Configurar la potencia del láser: 70 mW; diámetro de antena: 50 μm, duración del pulso: 100 ms.
   PRECAUCIÓN! El uso de luz laser requiere una protección personal adecuada y el etiquetado de la zona.
2. Aplique 1-2 gotas de hidroxipropilmetilcelulosa 2% tópico en el ojo antes del tratamiento y usar un lente de laser de fondo de 2,0 mm para enfocar el haz láser-que apunta en la retina.
   ¡PRECAUCIÓN! hidroxipropilmetilcelulosa gotas son viscosas y puede causar problemas en la respiración si va en las branquias.
3. Lugar cuatro láser alrededor del nervio óptico a la izquierda del ojo y utilizar el ojo justo, no tratado como control interno.

4. En vivo Proyección de imagen de la morfología de la retina

1. en el día 0, visualizar la retina de pez cebra directamente después de la inducción de láser sin revivir de la anestesia. En todos los demás puntos de tiempo, emplear anestesia general (ver sección 2: anestesia sistémica Reversible). Poner el pez cebra inmovilizado en un soporte de silicona a medida ( figura 1 B, B.1).
2. Para obtener imágenes óptimas, cortar una lente de contacto de hidrogel comercialmente disponibles para el ojo del pez cebra (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, grueso de centro = 0,4 mm) mediante una perforadora. La superficie cóncava de la lente se llenan de metilcelulosa y colóquelo sobre la córnea.
3. Equipar el sistema de OCT con un lente de lámpara de hendidura sin contacto 78D.
4. Enfocar la imagen infrarroja (IR) en el IR + modo de OCT ( figura 2A) para visualizar el fondo del ojo y tomar el IR fotos haciendo clic en el " adquirir " botón ( figura 2B) para localizar el manchas en la retina mediante el sistema del laser ' software s.
5. Visualiza una sección tridimensional de las capas retinianas en el IR + OCT modo y tomar las fotos haciendo clic en el " adquirir " botón ( figura 2B). Observar la gravedad de la lesión en la capa nuclear externa (ONL) (ver sección 3: lesión focal en la retina con láser) en estas imágenes.
6. Para revertir la anestesia después del tratamiento o la proyección de imagen de pez cebra en un recipiente que contiene el tanque de agua.
7. Para apoyar la recuperación, crear un flujo de agua de tanque fresco sobre las branquias moviendo el pez cebra y hacia atrás en el agua.
8. Realizar similares en vivo la proyección de imagen de morfología retiniana en el día 1, 3, 7, 14 y 6 semana.

5. La hematoxilina & eosina (H & E) tinción

1. eutanasia pez cebra por inmersión en frío (4 ° C) solución de anestesia en hielo durante al menos 10 minutos y enucleate los ojos inmediatamente por medio de pinzas curvas pequeñas.
2. Fijar los ojos todo en paraformaldehído al 4% (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 20 h y luego deshidratar las muestras en una serie gradual de alcohol (xileno, etanol 100% durante 5 minutos dos veces, 100% durante 5 minutos dos veces y etanol 70%, etanol 96% por 3 min dos veces 3 mi n una vez).
   ¡PRECAUCIÓN! PFA puede ser irritante a los ojos, la nariz y la vía respiratoria superior. PFA es un conocido cancerígeno humano y un sospecha peligro reproductivo.
3. Incrustar las muestras en parafina, corte 5 μm secciones en el nivel de la cabeza del nervio óptico y montar en portaobjetos de vidrio.
4. Mancha las secciones deparaffinized con solución de hematoxilina ácido 0,1% durante 5 minutos y sumergir el portaobjetos dos veces en agua destilada después de sumergir el portaobjetos en la mezcla de ácido clorhídrico (HCl en 250 mL de 2 mL 25% agua destilada agua) y amonio (amoníaco de 25% de 2 mL en 250 mL de la mezcla agua destilada). Mancha las secciones con solución acuosa de eosina G 0.5% por 3 min después del desarrollo de la hematoxilina manchas por agua del grifo durante al menos 10 min
5. Montar las diapositivas deshidratadas en medio de montaje de resina acrílica y observe los portaobjetos en el microscopio de luz.

6. Inmunohistoquímica para la activación de MC

1. calentar las secciones deparaffinized en tampón de recuperación de antígeno (Tris-EDTA + 0.05% detergente no iónico, pH 9.0) durante 3 minutos en un apropiado de vapor o en microondas 10-15 min y lavar tres veces con TBS para 5 minutos cada uno.
2. Bloqueo de círculo las secciones con una silicona de la pluma y añadir 100 μl solución (TBS + suero normal de cabra 10% + 1% albúmina de suero bovino, pH 7,6) a temperatura ambiente durante 1 h.
3. Tinción con anticuerpos policlonales de conejo anti-glial proteína ácida fibrilar (GFAP) y la glutamina sintetasa (GS) anticuerpo monoclonal de ratón, tanto en una dilución de 1: 200 (40 μl por muestra). Incubar el portaobjetos en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Lavar tres veces con TBS + 0,1% Tween 20 durante 5 minutos.
Anticuerpos secundarios
4. visualización de acabado con el apropiado. Este protocolo utiliza una cabra anti-conejo IgG H & anticuerpo secundario L verde para GFAP y una cabra anti-ratón IgG H & rojo brillante L de GS, en una dilución de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Montar el portaobjetos con medio de montaje con DAPI y observe los portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.

Resultados

OCT en tiempo real: para analizar el papel de MCs en reparación retiniana, utilizamos un modelo de lesión láser induce una zona bien delimitada de daño en la retina de pez cebra. El sitio de daño era reflejado por medio de OCT en vivo por primera vez (día 0) en 60 minutos después de la lesión (figura 3). Para compensar la óptica del ojo de pescado, una lente de contacto a medida se puso en la córnea. Inmediatamente después...

Discusión

Regeneración, degeneración retiniana en el pez cebra ha sido investigada por diferentes enfoques como de muerte celular mediada por la citotoxina²², lesión mecánica²³y lesiones térmicas²⁴. Se empleó un 532 nm diodo láser para dañar la retina de pez cebra. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece varias ventajas. Por ejemplo, creamos rápidamente un área bien definida de lesión localizada en la retina externa, específicamente en la capa de PRs. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer