עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

Summary

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

Abstract

הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא הפוטנציאל לכל החיים של הרשתית teleost נוירוג'נסיס ברשתית, חידוש לאחר נזק חמור. חוקרים של מסלולים התחדשות של דג זברה עשוי להביא תובנות חדשות לפיתוח אסטרטגיות חדשניות לטיפול במחלות ניווניות ברשתית אצל יונקים. במסמך זה, התמקדנו אינדוקציה של פגיעה נקודתית אל הרשתית החיצונית בדג זברה למבוגרים באמצעות 532 ננומטר דיודת לייזר. פגיעה מקומי מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים המתרחשים במהלך ניוון הרשתית והתחדשות ישירות על האזור של נזק. באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית פולשני (אוקטובר), היינו מסוגלים להגדיר את המיקום של רגנרציה עוקבות אזור וצג פגום ויוו. אכן, OCT דימות מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה, חתך הרוחב של הרשתית דג זברה, מתן מידע אשר זמינים בעבר רק באמצעות ניתוחים היסטולוגית. על מנת לאשר את הנתונים בזמן אמת OCT, בוצעו מקטעים היסטולוגית, התגובה הרגנרציה לאחר אינדוקציה הפגיעה ברשתית נחקר על ידי אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

החזון הוא כנראה תחושת החיוניות ביותר של האדם, ליקוי שלה יש השפעה סוציו-אקונומי גבוה. בעולם המתועש, מחלות ניווניות של הרשתית חשבון עבור הרוב המכריע של אובדן ראייה ועיוורון בקרב אוכלוסיית הבוגרים¹. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הגורם תורשתית השכיחה ביותר לעיוורון בקרב אנשים בין הגילאים 20-60, להשפיע על 1.5 מיליון אנשים ברחבי העולם^2,3. זה משפחה הטרוגנית של הפרעות רשתית תורשתיות מאופיין על ידי אובדן הדרגתי של photoreceptors (PRs) ואחריו ניוון של אפיתל הפיגמנט ברשתית, לאחר מכן, gliosis ובניה של נוירונים הפנימית⁴. הקורס של המחלה יכולה להיות מוסברת על ידי אובדן מצטבר שני סוגי יחסי ציבור תא, מתחיל בדרך כלל עם מוטות, אשר אחראים על חזון אכרומטי אור עמום, קונוסים, המהווה מרכיב חיוני עבור צבע חזון, חדות הראייה⁵. פגם גנטי יחיד מספיקה לגרום RP. עד כה יותר מ-130 מוטציות בגנים מעל 45 קושרו עם מחלת⁶. זה מוביל פנוטיפים מחלות בדרגות שונות, היא אחת הסיבות לכך ריפוי גנטי שאינו להכליל ובכך גישה טיפולית מסובכים. לכן, יש צורך דחוף לפתח גישות טיפוליות כללי חדש לטיפול degenerations רשתית במסנוור מחלות.

ניוון הרשתית לעתים קרובות כרוך אובדן יחסי ציבור; לכן, מוות של תאים PR הוא סימן היכר של התהליכים ניווניות הרשתית⁷. זה כבר הוכח כי מוות של תאים יחסי ציבור מעוררת מולר עכשיו, דונלד תא (MC) הפעלת והתפשטות⁸. MCs, הסוג של תא גליה הגדולות ב הרשתית חוליות, נחשבו בעבר להיות לא יותר מאשר "דבק" בין הנוירונים ברשתית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הראו כי MCs לפעול כתמיכה יותר מבני גרידא⁹. בין הפונקציות השונות, MCs להשתתף גם נוירוג'נסיס ותיקון¹⁰. אכן, בתגובה גורמים diffusible של הרשתית המתנוונת, MCs להגדיל באופן משמעותי ביטוי חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). לכן, GFAP תוויות יכול לשמש כסמן להפעלה MC כתגובה משני פגיעה ברשתית, ניוון¹¹.

לאחרונה, פיתחנו עיבוד הרומן של פגיעה נקודתית באמצעות לייזר לזירוז ניוון רשתית בדג זברה (רזבורה rerio). פגיעה נקודתית יש יתרון ללימוד תהליכים ביולוגיים מסוימים כגון ההעברה של תאים לתוך האתר פצוע ותזמון מדויק של האירועים המתקיימים במהלך התחדשות ברשתית¹². יתר על כן, דג זברה הפך חשוב במחקר חזותי בגלל הדמיון בין מערכת הראייה שלה וגם של בעלי החוליות. תכונות היסטולוגית מורפולוגיים ברוטו של האדם ושל teleost retinae להציג כמה הבדלים. בהתאם, retinae האדם, דג זברה מכילים את אותן הכיתות תא מרכזי שאורגן אותו דפוס בשכבות, איפה אור חישה photoreceptors לכבוש את השכבה החיצונית ביותר, בעוד הנוירונים ברשתית הקרנה, תאי גנגליון, שוכנים לנגדו שכבת עצביים, מקורב על העדשה. את interneurons ברשתית, אמקרין, הפרעה דו קוטבית, תאים אופקיים, להתאים בין קולט אור, גנגליון תא שכבות¹³. יתר על כן, הרשתית דג זברה הוא נשלט-חרוט, ולכן קרוב יותר הרשתית האנושית מאשר, למשל, הרשתית מכרסמים למד באופן אינטנסיבי. הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא נוירוג'נסיס מתמיד דגים רשתית, חידוש ברשתית לאחר נזק. דג זברה, MCs יכול dedifferentiate, לתווך התחדשות רשתית נפצעו^14,15. עוף, MCs יש יכולת גם להזין מחדש את מחזור התא, dedifferentiate. בעקבות פגיעה ברשתית בדגים הבוגרים, MCs לאמץ מאפיינים מסוימים של קדמון, תאי גזע, להגר ברשתית הרקמה הפגועה, לייצר נוירונים חדשים¹⁶. ג'ין ביטוי פרופיל של MCs יונקים חשף דמיון לא צפוי אבות ברשתית, וגדל ראיות על הפוטנציאל neurogenic מהותי של MCs עוף, מכרסם, רשתית העין האנושית אפילו¹⁷. ובכל זאת, למה התגובה משובי ציפורים, יונקים מושווה נמוך עם תגובת חזקים ב דגים הוא לא הבנתם. לכן, הבנת מנגנוני תיקון אנדוגני דג זברה יכול להציע אסטרטגיות עבור התחדשות ברשתית מגרה יונקים ובבני אדם. העסקת מנגנון תיקון אנדוגני של MCs כמכשיר טיפולי לטיפול של חולים עם ניוון הרשתית תהיה השפעה יוצאת דופן בחברה שלנו.

במסמך זה, אנו מספקים את השלבים הנחוצים להפיכת להעסיק את המודל ניוון/התחדשות במחקר אופטלמולוגיות. אנחנו התמקדנו קודם גרימת נזק מוקד ברשתית neurosensory, ואז על ההדמיה של אירועים פיתוח אתר הפציעה, ו סוף סוף להמחיש במעורבות MCs סמוכים. פרוטוקול כללי קל יחסית לבצע ופותח מגוון רחב של אפשרויות להערכת הרשתית לאחר מכן.

Protocol

כל ניסויים דבקה ההצהרה עבור שימוש של בעלי החיים לרפואת עיניים ומחקר החזון של האגודה לחקר רפואת עיניים (ארוו) וחזון ולכבד את תקנות הקשורות מרשויות השלטון-

1. חיות

1. לשמור על TgBAC (gfap:gfap-GFP) זן (אלב) 167 דג זברה בגילאי 6-9 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורת 26.5 ° C עד 18/כהה מחזור ¹⁸ 14/10 h.
2. עקוב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי חיים לאחר אישור על ידי הרשויות הממשלתיות.

2. הרדמה מערכתית הפיך

1. להכין הפתרון מניות של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate מלח (tricaine) על ידי המסת 400 מ ג של אבקת tricaine ב mL 97.9 מיכל מים ו- 2.1 מ של 1 מ' של טריס buffered תמיסת מלח (TBS). התאם ל pH 7.0 מ' 1 טריס (pH 9), חנות-4 מעלות צלזיוס עד חודש אחד כהה.
   הערה: Tricaine צריך להיות מוכן בתוך המים כמו תנאי המחייה הטבעי של החיה, רצוי להשתמש המים במיכל המקורי.
2. לדלל את הפתרון מניות 1:25 בתוך מיכל המים ולהשתמש מיד.
3. למקם את דג זברה 10 ס מ פטרי המכילות 50 מ של הרדמה פתרון עד שהם הופכים משותק אינם מגיבים לגירויים חיצוניים (כ 2-5 דקות, תלוי משקל וגיל).
4. להעביר כל דג בעבודת יד בעל פין סיליקון בהזמנה אישית עבור טיפול לייזר ( איור 1 א').
   זהירות! הדג יכול להישאר anesthetized מחוץ למיכל עבור עד 10 דקות בלבד-
5. להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה, למקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.
6. כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.

3. לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית

הערה: א 532 ננומטר דיודת לייזר משמש כדי ליצור מוקד נזק האור על הרשתית של דג זברה. הסידור ניסיוני של הלייזר מאפשר הקמת פגיעה ברשתית מוקד לשחזור של דג זברה בוגרת.

1. להגדיר את הפלט עוצמת הלייזר: 70 mW; קוטר אווירי: 50 מיקרומטר; משך פעימה: גב' 100
   זהירות! השימוש של אור לייזר דורש הגנה אישית המתאימה וסימון של האזור.
2. להחיל 1-2 טיפות של 2% hydroxypropylmethylcellulose topically בעיניים לפני הטיפול ולהשתמש 2.0 מ מ הפונדוס לייזר העדשה למקד את קרן הלייזר-מכוון על הרשתית-
   זהירות! hydroxypropylmethylcellulose טיפות צמיגה, עלול לגרום לבעיות נשימה, אם זה ממשיך הזימים.
3. מקום ארבעה כתמים בלייזר סביב עצב הראייה בצד השמאל העין ולהשתמש העין נכון, לא מטופל כמו בקרה פנימית-

4. אין ויוו הדמיה של המורפולוגיה רשתית

1. ביום 0, להמחיש הרשתית דג זברה ישירות לאחר אינדוקציה לייזר בלי להחיות אותם מן ההרדמה. נקודות פעם כל אחרות, מעסיקים הרדמה כללית (ראה סעיף 2: הרדמה מערכתית הפיך). מניחים את דג זברה קיבוע על בעל פין סיליקון בהזמנה אישית ( איור 1 B, B.1).
2. כדי לקבל תמונות אופטימלית, חתך עדשות מגע הידרוג זמינים מסחרית כדי להתאים את עין דג זברה (Ø = 5.2 מ מ, r = 2.70 מ מ, עובי מרכז = 0.4 מ מ) על-ידי אגרוף חור. למלא את השטח קעורה של העדשה methylcellulose ומניחים אותו על פני הקרנית.
3. לצייד את המערכת OCT עם עדשה מנורה ללא מגע שסע 78D.
4. למקד את התמונה אינפרא-אדום (IR) ב- IR + מצב OCT ( איור 2 א) כדי להמחיש את הפונדוס של העין ולקחת IR תמונות על ידי לחיצה " ידרשו " לחצן ( איור 2B) כדי להתאים לשפה כתמים על הרשתית באמצעות המערכת לייזר ' תוכנה s.
מצב
5. Visualize מקטע תלת מימדי של השכבות ברשתית IR + OCT ולקחת את התמונות על ידי לחיצה " ידרשו " לחצן ( איור 2B). לצפות את חומרת פגיעה בשכבה הגרעינית החיצונית (גרת) (ר' סעיף 3: לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית) בתמונות האלה.
6. להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה של מקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.
7. כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.
8. לבצע דומה ויוו הדמיה של מורפולוגיה רשתית על יום 1, 3, 7, 14 ושבוע 6-

5. Hematoxylin & אאוזין (H & E) Staining

1. המתת חסד דג זברה על ידי צלילה אל תוך קר (4 ° C) פתרון הרדמה על קרח לפחות 10 דקות, enucleate העיניים מיד על ידי אמצעי מלקחיים קטנים מעוקלים.
2. לתקן את העיניים כל ב- 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עבור 20 h, ואז מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול מדורגת (קסילן 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 96% למשך 3 דקות פעמיים, אתנול 70% 3 mi n פעם אחת).
   זהירות! מחברים יכול להיות מעצבן העיניים, האף, המסלול בדרכי הנשימה העליונות. כדורגלן הוא חומר מסרטן ידוע אנושי, סיכון הרבייה חשד.
3. להטביע את הדגימות פרפין, לחתוך קטעים 5 מיקרומטר ברמה של ראש עצב הראייה, לטעון אותם בשקופיות זכוכית-
4. כתם הסעיפים deparaffinized 0.1% חומצה hematoxylin פתרון עבור 5 דקות וטבול את השקופיות פעמיים במים מזוקקים לאחר טובלים את השקופיות בתמהיל חומצה הידרוכלורית (2 מ ל 25% מזוקקים HCl ב 250 מ ל מים) ו אמוניה לערבב (2 מ ל 25% אמוניה ב 250 מ ל מים מזוקקים). כתם הסעיפים עם אאוזין גרם תמיסה מימית 0.5% למשך 3 דקות לאחר התפתחות hematoxylin צביעת על-ידי מי ברז במשך לפחות 10 דקות
5. הר השקופיות מיובש שרף אקרילי הרכבה בינונית ולבחון את השקופיות במיקרוסקופ אור.

6. אימונוהיסטוכימיה עבור ההפעלה MC

1. לחמם הסעיפים deparaffinized במאגר אנטיגן אחזור (טריס-EDTA + דטרגנט ללא יונית 0.05%, pH 9.0) למשך 3 דקות של דוד אידוי מזון המתאים או במיקרוגל למשך 10-15 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם TBS עבור 5 מינימום לכל.
2. מעגל הסעיפים עם סיליקון עט ולהוסיף 100 µL חסימת פתרון (TBS + סרום נורמלי עז 10% + 1% אלבומין שור, pH 7.6) בטמפרטורת החדר במשך ה 1
3. הכתם עם נוגדנים polyclonal של הארנב אנטי-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) ועם נוגדנים חד שבטיים של העכבר המעביר אנטי-גלוטמין (אלף), שניהם לדילול 1:200 (40 µL עבור דגימה). דגירה השקופית בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. תשטוף שלוש פעמים עם TBS + 0.1% 20 Tween למשך 5 דקות כל אחד.
4. סיום ויזואליזציה עם המתאים נוגדנים משניים. פרוטוקול זה משמש ארנב נגד עז IgG H & L ירוקה נוגדנים משניים עבור GFAP ועכבר נגד עז IgG H & L אדום בהיר עבור GS, שניהם לדילול שבערך בטמפרטורת החדר במשך ה 1
5. הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל דאפי ולבחון את השקופיות תחת המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.

תוצאות

OCT בזמן אמת: על מנת לנתח את התפקיד של MCs תיקון ברשתית, השתמשנו מודל פגיעת לייזר גרימת אזור מוגדרים היטב היטב של פגיעה ברשתית דג זברה. האתר של נזק צולמה על-ידי OCT ויוו בפעם הראשונה (יום 0) בתוך 60 דקות לאחר הפגיעה (איור 3). כדי לפצות על המערכת האופטית ...

Discussion

התחדשות/ניוון הרשתית דג זברה נחקר על ידי גישות שונות כגון מוות תא בתיווך cytotoxin²², פגיעה מכנית²³פציעה תרמי²⁴. אנחנו מועסקים 532 ננומטר דיודת לייזר לפגיעה ברשתית דג זברה. ובכך, המודל שלנו מציע מספר יתרונות. למשל, במהירות יצרנו אזור מוגדר היטב של פגיעה מקומית...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer