JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Данио рерио является популярной модели животных для изучения механизмов сетчатки дегенерации/регенерации в позвоночных. Этот протокол описывает метод побудить локализованных травмы, нарушая наружной сетчатки с минимальным ущербом для внутренней сетчатки. Впоследствии мы осуществляем мониторинг в vivo сетчатки морфология и Мюллер глии ответ всей регенерации сетчатки.

Аннотация

Увлекательный костистых млекопитающих отличается от непрерывного потенциал костистых сетчатки для сетчатки Нейрогенез и восстановление после серьезного ущерба. Исследование путей регенерации в zebrafish может принести новые идеи для разработки новаторских стратегий для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки в млекопитающих. Здесь мы сосредоточились на индукции фокуса поражения внешних сетчатки в взрослых рыбок данио посредством 532 нм Лазер диода. Локализованные травмы позволяет исследовать биологические процессы, которые происходят во время дегенерации сетчатки и регенерации непосредственно в зоне повреждения. С помощью неинвазивных оптическая когерентная томография (Окт), мы были в состоянии определить местоположение поврежденного монитора и области последующей регенерации в vivo. Действительно OCT изображений производит изображения с высоким разрешением, поперечного сечения данио рерио сетчатки, предоставляя информацию, которая была ранее доступна только с гистологическим анализом. Для подтверждения данных от реального времени октября, были исполнены Гистологические срезы и регенеративной ответ после индукции сетчатки травмы были исследованы иммуногистохимия.

Введение

Видение, вероятно, наиболее важным чувство человека и его обесценения имеет высокие социально экономические последствия. В промышленно развитых странах дегенеративных заболеваний сетчатки составляют большинство потери зрения и слепоты среди взрослого населения1. Пигментный ретинит (RP) является наиболее распространенной причиной унаследованные слепоты у людей в возрасте от 20 до 60, затрагивающих примерно 1,5 миллиона человек во всем мире2,3. Это семейство разнородных наследственных заболеваний сетчатки, характеризуются постепенной утратой фоторецепторов (PRs) следуют дегенерация сетчатки пигментного эпителия и, впоследствии, глиоза и реконструкция внутренних нейронов4. Течение заболевания можно объяснить добавочные потери двух типов клеток PR, обычно начиная с стержней, которые отвечают за ахроматические видение в тусклом свете и конусов, которые необходимы для цвет видение и острота5. Дефект одного гена достаточно, чтобы вызвать RP. Пока более чем 130 мутаций в генах, более 45 были связаны с болезнью6. Это приводит к той или иной болезни фенотипы и является одной из причин, что генная терапия не обобщаемым и таким образом замысловатые терапевтический подход. Таким образом существует настоятельная необходимость разработать новые общие терапевтические подходы для лечения дегенерации сетчатки в ослепительно заболеваний.

Дегенерация сетчатки часто включает в себя потери PR; Таким образом смерть клетки PR является отличительной чертой дегенеративных процессов в сетчатке7. Уже было продемонстрировано, что смерть клетки PR стимулирует Мюллер глии клеток (MC) активации и распространения8. МКН, тип основных глиальных клеток сетчатки позвоночных, когда-то считались не более чем «клей» между сетчатки нейронов. В последние годы многие исследования показали, что MCs действовать как больше, чем просто структурной поддержки9. Среди различных функций MCs также участвуют в Нейрогенез и ремонт10. Действительно в ответ на diffusible факторов от вырождающихся сетчатки, MCs значительно увеличить глиальных фибриллово кислой (СВМС) белков. Таким образом СВМС маркировки может использоваться в качестве маркера для активации MC в средней ответ сетчатки травмы и дегенерации11.

Недавно мы разработали Роман адаптации фокуса травмы с помощью лазера, чтобы побудить дегенерации сетчатки в данио рерио (Danio рерио). Для изучения некоторых биологических процессов, таких как миграция клеток на потерпевшего сайт и точное время событий, которые происходят во время регенерации сетчатки12выгодно фокуса травмы. Кроме того данио рерио стало важным в визуальные исследования из-за сходства между своей зрительной системы и других позвоночных. Грубые гистологических особенностей человека и костистых retinae отображать несколько различий. Соответственно человека и данио рерио retinae содержат те же классы основных клеток, организованной в той же многоуровневой схеме, где светочувствительных фоторецепторов занимают внешний слой, в то время как сетчатки проекции нейронов, клетках ганглия, проживают в сокровенное нейронов слоя, проксимальнее объектива. Сетчатки интернейронов, Амакриновые, биполярный и горизонтальные клетки, локализовать между фоторецептор и ганглий клеток слои13. Кроме того данио рерио сетчатки, доминировали в конус и поэтому ближе к человека сетчатки, чем, например, интенсивно изучали грызунов сетчатки. Увлекательный костистых млекопитающих отличается от стойких нейрогенез рыбы сетчатки глаза и сетчатки восстановление после повреждения. В данио рерио MCs можно дедифференцироваться и посредником регенерации в раненых сетчатки14,15. В курицу MCs имеют некоторые способности также повторно ввести клеточного цикла и дедифференцироваться. После сетчатки травмы в взрослых рыб MCs принять определенные характеристики прародителем и стволовых клеток, перенести поврежденных тканей сетчатки и производить новые нейроны16. Ген выражение профилирование млекопитающих МКН показал неожиданные сходство сетчатки прародителями, и доказательств для встроенных нейрогенный потенциал МКН в курицу, грызунов и даже человека сетчатки растет17. Тем не менее, почему восстановительной реакции у птиц и млекопитающих ниже по сравнению с надежным ответом в рыбе не еще не понимается. Таким образом понимание механизмов внутреннего ремонта в zebrafish может предложить стратегии стимулирования регенерации сетчатки в млекопитающих и человека. Используя механизм эндогенного ремонт МКН как лечебное средство для лечения больных с дегенерация сетчатки скажется выдающийся для нашего общества.

Здесь мы предоставляем шаги необходимо использовать модель дегенерации/регенерации в офтальмологических исследований. Мы в первую очередь на вызывающие фокуса повреждения в нейросенсорной сетчатки, затем по визуализации событий, развивающихся на сайт травмы и наконец визуализации участие соседних MCs. Общий протокол относительно легко выполнить и открывает широкий спектр возможностей для оценки сетчатки потом.

протокол

все эксперименты присоединилась к заявлению для использования животных в глазной и видение исследований ассоциации исследований зрения и офтальмологии (Арво) и соблюдать соответствующие правила правительственных властей.

1. Животные

  1. поддерживать TgBAC (gfap:gfap-GFP) данио рерио, 167 (AB) сорт в возрасте 6-9 месяцев в стандартных условиях в воде с температурой 26,5 ° C и свет/темно цикла 14/10 h 18.
  2. Следовать руководящим принципам ухода за животными участвующих учреждений для экспериментов на животных после утверждения государственными органами.

2. Реверсивные системных анестезии

  1. подготовить раствор 3-аминобензоат этиловый метансульфонат соли (tricaine), растворяя 400 мг tricaine порошка в 97,9 мл резервуар для воды и 2.1 мл 1 м трис буфер солевой раствор (TBS). Приспособиться к pH 7.0 с 1 М трис (рН 9) и хранить при 4 ° C в темной вверх до одного месяца.
    Примечание: Tricaine должен быть подготовлен в воде, как естественной жизни животного, предпочтительно должны использоваться оригинальные бак воды.
  2. Разбавить раствор 1:25 в резервуар для воды и немедленно использовать.
  3. Место данио рерио в 10 см Петри, содержащие 50 мл раствора анестезии, до тех пор, пока они становятся неподвижными и не реагировать на внешние раздражители (приблизительно 2-5 мин, в зависимости от веса и возраста).
  4. Передачи каждой рыбы вручную на заказ силиконовые штырь держатель для лазерного лечения ( рис. 1A).
    ВНИМАНИЕ! Рыбы может оставаться наркотизированных снаружи цистерны для только до 10 мин.
  5. Обратить вспять анестезии после лечения и/или изображений, место данио рерио в контейнер, содержащий бак воды.
  6. Для поддержки восстановления, создайте поток свежей бак воды через жабры, перемещая данио рерио взад и вперед в воде.

3. Лазерная фокуса травмы на сетчатке

Примечание: 532 нм диодный лазер используется для создания координационных легкие повреждения на сетчатке данио рерио. Экспериментальная установка лазера позволяет создание воспроизводимых фокуса сетчатки травмы в взрослых рыбок данио.

  1. Создана выходная мощность лазера: 70 МВт; воздушная диаметр: 50 мкм; длительность импульса: 100 г-жа
    осторожно! Использование лазерного света требует надлежащей личной защиты и маркировки области.
  2. Применяют 1-2 капли 2% гидроксипропилметилцеллюлоза местно в глаза до лечения и использовать линзы лазера глазного дна 2,0 мм для направленного лазерного луча на сетчатке.
    ВНИМАНИЕ! гидроксипропилметилцеллюлоза капли вязки и может вызвать проблемы в дыхание, если она идет на жабрах.
  3. Место четыре лазерного пятна вокруг зрительного нерва в левой части глаз и использовать право, неочищенные глаз как внутреннего контроля.

4. В естественных условиях Визуализационная диагностика сетчатки морфология

  1. на день 0, визуализировать данио рерио сетчатки непосредственно после индукции лазер без возрождения их от анестезии. Во всех других моментов времени, используют общий наркоз (см. раздел 2: реверсивный системных анестезии). Место иммобилизованных данио рерио на заказ силиконовые штырь держатель ( рис. 1 Б, в.1).
  2. Для получения оптимального изображения, вырезать коммерчески доступных гидрогелевые контактные линзы в соответствии глаз данио рерио (Ø = 5,2 мм, r = 2,70 мм, толщина центр = 0,4 мм) с помощью дырокол. Залейте метилцеллюлоза вогнутой поверхности объектива и поместите его над роговицы.
  3. Оснащения системы OCT с 78D бесконтактный щелевой лампы объектив.
  4. Фокус инфракрасный (ИК) изображения в ИК + режим октября ( рисунок 2A) для визуализации глазного дна и принимать ИК картинки, нажав " приобретать " кнопку ( рис. 2B) для локализации лазерного пятна на сетчатке, с использованием системы ' программного обеспечения s.
  5. Визуализация трехмерных раздела слоев сетчатки в ИК + OCT режиме и принимать фотографии, нажав " приобретать " кнопку ( рис. 2B). Наблюдать за тяжести травмы в наружном слое ядерной (ONL) (см. раздел 3: Лазерные фокуса травмы на сетчатке) в этих изображениях.
  6. Обратить вспять анестезии, после лечения и/или изображений место данио рерио в контейнер, содержащий бак воды.
  7. Для поддержки восстановления, создайте поток свежей бак воды через жабры, перемещая данио рерио взад и вперед в воде.
  8. Выполнять аналогичные в vivo томография сетчатки морфологии на день 1, 3, 7, 14 и неделя 6.

5. Гематоксилином & эозином (H & E) окрашивания

  1. усыпить данио рерио путем погружения в холодной (4 ° C) анестезии решения на льду, по крайней мере 10 минут и enucleate глаза сразу же с помощью небольшой Изогнутый пинцет.
  2. Исправить весь глаз в параформальдегида 4% (PFA) в фосфатный буфер (PBS) при 4 ° C для 20 h и затем обезвоживает образцы в серию градуированных алкоголя (ксилол 100% для 5 минут дважды, этанол 100% для 5 минут дважды, этанол 96% за 3 мин дважды и этанол 70% 3 ми n раз).
    ВНИМАНИЕ! PFA может вызвать раздражение глаз, носа и верхние дыхательные пути. PFA-это известный канцероген человека и предполагаемого репродуктивного риска.
  3. Внедрить образцы в парафин, вырезать 5 мкм секции на уровне головы зрительного нерва и смонтировать их на стеклянных вставках.
  4. Пятно deparaffinized секции с 0,1% раствор кислоты гематоксилином 5 мин и окунуть слайды два раза в дистиллированной воде после погружения слайды в смесь соляной кислоты (2 мл 25% HCl в 250 мл дистиллированной воды) и аммиака mix (2 мл 25% аммиака в 250 мл дистиллированная вода). Пятно секции с эозином G водный раствор 0,5% за 3 мин после развития гематоксилином пятнать водопроводной воды для по крайней мере 10 мин
  5. Маунт обезвоженной слайды в монтаж акриловой смолы и наблюдать слайды в световой микроскоп.

6. Иммуногистохимия для активации MC

  1. тепла deparaffinized секций в буфере извлечения антигена (Tris-ЭДТА + 0,05% неионный тензид, рН 9,0) 3 мин в соответствующие пароход или микроволновой на 10-15 минут и промыть TBS три раза за 5 мин.
  2. Круг в разделах с силиконовой ручкой и 100 мкл преграждая разрешение (TBS + 10% козий нормальной сыворотки + 1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7,6) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  3. Пятно с анти глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) кролика polyclonal антитела и анти глютамина синтетаза (GS) мыши моноклональные антитела, оба в разведении 1: 200 (40 мкл на сэмпл). Инкубируйте слайд в увлажненные камере при температуре 4 ° C на ночь. Вымойте три раза с TBS + 0.1% Tween-20 для 5 мин.
  4. Отделка визуализации с соответствующим вторичные антитела. Этот протокол используется коза кролика против IgG H & L зеленый вторичное антитело для СВМС и коза анти мыши IgG H & ярко-красный для GS, оба в разведении 1: 500, при комнатной температуре в течение 1 ч. Л
  5. Крепление слайды с монтажа носитель, содержащий DAPI и наблюдать слайды под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Реальном времени OCT: для того чтобы проанализировать роль МКН в сетчатки ремонт, мы использовали модель травмы лазер, вызывая четко разграничить зоны повреждения сетчатки у рыбок данио. На сайте ущерб был образы с помощью OCT в естественных условиях в перв?...

Обсуждение

Регенерации/дегенерация сетчатки в zebrafish были расследованы различных подходов, таких как cytotoxin опосредованной клеток смерти22, механическая травма23и термической травмы24. Мы использовали 532 нм Лазер диода повреждения сетчатки у рыбок данио. Таким о...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Martin Zinkernagel, MD, PhD и Мириам Reisenhofer, PhD за ее научного вклада в создание модели и Федерика Bisignani за ее превосходную техническую помощь.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acid hematoxylin solutionSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2852
AlbuminSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandA07030
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland5470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPI mounting mediumVector Labs, Burlingame, CA, USAH-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%Carl Roth, Arlesheim, SwitzerlandX883.2
EthanolSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandED
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488Life Technologies, Zug, SwitzerlandA11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594Life Technologies, Zug, SwitzerlandA11020
Goat normal serumDako, Glostrup, DanmarkX0907
Hydrogel contact lensJohnson & Johnson AG, Zug, Switzerlandn.a.1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%OmniVision, Neuhausen, Switzerlandn.a.Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandA5040Tricaine, MS-222
Visulas 532sCarl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germanyn.a.532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibodyMillipore, Billerica, MA, USAMAB302
HRA + OCT Imaging SystemHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Spectralis
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibodyInvitrogen, Waltham, MA, USA180063
Silicone pin holderHuco Vision AG Switzerlandn.a.Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerlandn.a.
Slit lamp adapterIridex Corp., Mountain View, CA, USAn.a.
Superfrost Plus glass slidesGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strainKIT, Karlsruhe, Germany15204http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5912
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP1379
78D non-contact slit lamp lensVolk Optical, Mentor, OH, USAV78C
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Switzerland534056
Ocular fundus laser lensOcular Instruments, Bellevue, WA, USAOFA2-0
2100 RetrieverAptum Biologics Ltd., Southampton, United KingdomR2100-EUSteamer

Ссылки

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  3. Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
  4. Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
  5. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  6. Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
  7. Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
  8. Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
  9. Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
  10. Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
  11. Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
  12. DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
  13. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
  14. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  15. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  16. Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
  17. Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
  18. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
  19. Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
  20. Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
  21. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
  22. Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
  23. Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
  24. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
  25. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  26. Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
  27. Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
  28. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены