Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Zusammenfassung

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Zusammenfassung

Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist das lebenslange Potenzial der teleost Netzhaut Netzhaut Neurogenese und Regeneration nach schweren Schäden. Die Regeneration Wege im Zebrafisch untersucht könnte neue Einblicke in innovative Strategien für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut bei Säugetieren bringen. Hierin, konzentrierten wir uns auf die Induktion einer fokalen Läsion an der äußeren Netzhaut in Erwachsenen Zebrafisch mittels einem 532 nm Diodenlaser. Eine lokalisierte Verletzung ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse, die während retinalen Degeneration und Regeneration direkt auf dem Gelände des Schadens stattfinden. Verwendung von nicht-invasiven optischen Kohärenztomografie (OCT), konnten wir die Position der beschädigte Bereich und Monitor anschließende Regeneration definieren in-vivo. In der Tat produziert OCT-Bildgebung Cross-sectional hochauflösende Bilder der Zebrafisch Netzhaut, Bereitstellung von Informationen, die zuvor nur mit histologischen Analysen verfügbar war. Um die Daten in Echtzeit OCT bestätigen, histologische Abschnitte wurden durchgeführt und regenerative Reaktion nach der Induktion der Netzhaut Verletzung wurde von Immunohistochemistry untersucht.

Einleitung

Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung¹. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit^2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von Degeneration des retinalen Pigmentepithels und anschließend Gliosis und Umbau des inneren Neuronen⁴gekennzeichnet. Der Krankheitsverlauf lässt sich erklären durch den inkrementellen Verlust der PR zwei Zelltypen, Stangen, die sind verantwortlich für achromatische Vision im Dämmerlicht und Zapfen, die für Color Vision und Sehschärfe⁵sind in der Regel ab. Ein einzelnes Gendefekt reicht für RP. Bisher wurden mehr als 130 Mutationen in mehr als 45 Genen verbunden mit der Krankheit-⁶. Dies führt zu unterschiedlichen Phänotypen der Krankheit und ist einer der Gründe, die Gentherapie nicht verallgemeinerbare ist und somit eine komplexe therapeutische Ansatz. Daher ist dringend erforderlich, neue allgemeine Therapieansätze zur Behandlung von retinaler Degenerationen in blendenden Krankheiten zu entwickeln.

Netzhautdegeneration oft schließt PR Verlust; Daher ist PR Zelltod ein Markenzeichen für die degenerativen Prozesse in der Netzhaut-⁷. Es wurde bereits nachgewiesen, dass PR Zelltod Müller Glia Zelle (MC) Aktivierung und Proliferation⁸stimuliert. MCs, großen glialen Zelltyp in der vertebrate Retina galten einmal als nichts anderes als ein "Klebstoff" zwischen Netzhaut Neuronen. In den letzten Jahren haben viele Studien gezeigt, dass MCs zu handeln, als mehr als bloße strukturelle⁹unterstützen. Unter den verschiedenen Funktionen MCs beteiligen sich auch an Neurogenese und¹⁰zu reparieren. In der Tat, in Reaktion auf diffusiblem Faktoren von der degenerierenden Netzhaut, MCs deutlich erhöhen glial fibrillary sauer (GFAP) Proteinexpression. Daher kann als Marker für MC Aktivierung als sekundäre Reaktion auf Netzhaut Verletzung und Degeneration¹¹GFAP Kennzeichnung verwendet werden.

Vor kurzem haben wir eine neuartige Anpassung der fokalen Verletzungen mit Hilfe eines Lasers induzieren Netzhautdegeneration im Zebrafisch (Danio Rerio) entwickelt. Fokalen Verletzung ist vorteilhaft für das Studium bestimmte biologische Prozesse wie die Wanderung von Zellen auf der verletzten Seite und der genaue Zeitpunkt der Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration¹²stattfinden. Darüber hinaus ist der Zebrabärbling aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen seine visuellen System und dem von anderen Wirbeltieren in visuelle Forschung wichtig geworden. Grobe morphologischen und histologischen Merkmale des menschlichen und teleost Netzhaut zeigen einige Unterschiede. Dementsprechend enthalten Mensch und Zebrafisch Netzhaut die gleichen großen Zelle Klassen organisiert in dem gleichen geschichteten Muster, wo lichtempfindlichen Photorezeptoren die äußerste Schicht, besetzen, während die Netzhaut Projektion Neuronen, die Ganglienzellen im Innersten wohnen neuronalen Ebene, proximal an der Linse. Die Netzhaut Interneuronen, die amakrinen, bipolar, und horizontalen Zellen zwischen den Photorezeptoren und Ganglienzellen Zelle Schichten¹³zu lokalisieren. Darüber hinaus ist die Zebrafisch Netzhaut Kegel beherrscht und daher näher an der menschlichen Netzhaut als zum Beispiel intensiv studierte Nagetier Netzhaut. Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist die anhaltende Neurogenese in Fisch Netzhaut und Netzhaut Regeneration nach Schaden. Im Zebrafisch können MCs Gewebestammzelle und Regeneration im geschädigte Netzhaut^14,15vermitteln. Bei Hühnern haben MCs einige Fähigkeit auch, geben Sie den Zellzyklus und Gewebestammzelle. Nach Netzhaut Verletzung bei Erwachsenen Fischen MCs übernehmen bestimmte Merkmale der Stammvater und Stammzellen, migrieren, die beschädigte Netzhautgewebe und produzieren neue Neuronen¹⁶. Gen Expression profiling von Säugetieren MCs offenbart unerwartete Ähnlichkeiten mit retinalen Stammväter, und Beweise für die innewohnende Potenzial neurogenen MCs im Huhn, Nager und auch die menschliche Netzhaut wächst¹⁷. Dennoch, warum die regenerative Antwort in Vögel und Säugetiere niedriger, verglichen mit der starke Reaktion in Fisch ist noch nicht geklärt. Daher kann die körpereigene Reparaturmechanismen im Zebrafisch Verständnis Strategien für anregende retinalen Regeneration bei Säugetieren und beim Menschen vorschlagen. Einsatz der körpereigene Reparaturmechanismus der MCs als therapeutisches Werkzeug für die Behandlung von Patienten mit Netzhautdegeneration hervorragend für unsere Gesellschaft auswirken würde.

Hier bieten wir Ihnen die notwendigen Schritte zur Degeneration/Regeneration Modell in Augenheilkunde beschäftigen. Wir konzentrierte sich zunächst auf Induktion fokalen Schäden in der neurosensorischen Netzhaut, dann auf die Darstellung der Ereignisse am Verletzung Aufstellungsort und schließlich visualisieren Beteiligung der benachbarten MCs entwickeln. Das allgemeine Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und öffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Bewertung der Netzhaut danach.

Protokoll

alle Experimente der Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten und beachten Sie die damit verbundenen Vorschriften der staatlichen Behörden.

1. Tiere

1. pflegen TgBAC (Gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) Belastung im Alter von 6-9 Monate unter normalen Bedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und eine 14/10 h hell/dunkel-Zyklus ¹⁸.
2. Richtlinien der Tierbetreuung der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die staatlichen Behörden.

2. Reversible systemische Narkose

1. Vorbereitung der Stammlösung Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate-Salz (Tricaine) durch Auflösen von 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 mL Wassertank und 2,1 mL 1 M Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS). Passen Sie auf pH 7,0 mit 1 M Tris (pH 9) und Store bei 4 ° C in den dunklen bis zu einem Monat.
   Hinweis: Tricaine sollten bereit sein, im Wasser wie die natürlichen Lebensbedingungen der Tiere, vorzugsweise original Wassertank verwendet werden sollten.
2. Der Stammlösung 01:25 im Tank Wasser zu verdünnen und sofort nutzen.
3. Setzen der Zebrabärbling in einer 10 cm Petrischale mit 50 mL Anästhesie-Lösung, bis sie unbeweglich und nicht auf äußere Reize (ca. 2-5 min, je nach Gewicht und Alter reagieren).
4. Übertragen jeden Fisch von hand auf eine maßgeschneiderte Silikon Stift Halterung für Laser-Behandlung ( Abb. 1A).
   VORSICHT! Der Fisch kann außerhalb des Behälters für bis zu 10 min nur betäubt bleiben.
5. Um die Narkose nach der Behandlung und/oder Bildgebung umzukehren, legen der Zebrabärbling in Behälter, Tank Wasser.
6. Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.

3. Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut

Hinweis: A 532 nm Diodenlaser wird verwendet, um fokale leichte Schäden an der Netzhaut der Zebrafisch erstellen. Der Versuchsaufbau des Lasers ermöglicht die Einrichtung einer reproduzierbaren fokale Netzhaut Verletzung im Erwachsenen Zebrafisch.

1. Eingerichtet, die Ausgangsleistung des Lasers: 70 mW; Antenne Durchmesser: 50 µm, Impulsdauer: 100 Ms.
   Vorsicht! Die Verwendung von Laserlicht erfordert geeignete persönliche Schutzausrüstung und Kennzeichnung des Gebiets.
2. 1-2 Tropfen 2 % Hydroxypropylmethylcellulose topisch in die Augen vor der Behandlung und eine 2,0 mm Fundus Laserlinse verwenden, um den mit dem Ziel, Laser Strahl auf die Netzhaut zu konzentrieren.
   VORSICHT! Hydroxypropylmethylcellulose Tropfen sind zähflüssig und kann Probleme verursachen, wenn es auf den Kiemen geht atmen.
3. Platz vier Laser Spots rund um den Sehnerv auf der linken Seite Auge und verwenden Sie das richtige, unbehandelte Auge als interne Kontrolle.

4. In vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie

1. am Tag 0, visualisieren die Zebrafisch Netzhaut direkt nach der Laser-Induktion ohne Wiederbelebung sie aus der Narkose. Zu allen anderen Zeitpunkten beschäftigen Vollnarkose (siehe Abschnitt 2: Reversible systemische Anästhesie). Legen Sie die immobilisierten Zebrafisch auf eine maßgeschneiderte Silikon-Pin-Halter ( Abbildung 1 B, b. 1).
2. Um optimale Aufnahmen zu schneiden eine handelsübliche Hydrogel-Kontaktlinse Zebrafisch Auge passen (Ø = 5,2 mm, R = 2,70 mm Mittendicke = 0,4 mm) durch einen Locher. Füllen Sie die konkave Oberfläche der Linse mit Methylcellulose und legen Sie es über die Hornhaut.
3. Statten das OCT-System mit einem 78D berührungslose Schlitz Lampe Objektiv.
4. Konzentrieren sich die Infrarot (IR) Bild in der IR + OCT-Modus ( Abbildung 2A) zu visualisieren den Fundus des Auges die IR Bilder durch Klicken auf die " erwerben " Taste ( Abb. 2 b) zu lokalisieren die Laser-Flecken auf der Netzhaut, die mit dem System ' s Software.
5. Visualisieren eine dreidimensionale Abschnitt der Netzhaut Schichten in der IR + OCT-Modus und nehmen Sie die Bilder durch Klicken auf die " erwerben " Taste ( Abb. 2 b). Die Schwere der Verletzungen in der nuklearen Außenschicht (ONL) zu beobachten (siehe Abschnitt 3: Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut) in diesen Bildern.
6. , Betäubung rückgängig zu machen, nachdem die Behandlung und/oder Bildgebung der Zebrabärbling in einem Behälter mit Wassertank platziert.
7. Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.
8. Führen Sie ähnlich wie in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie an Tag 1, 3, 7, 14 und Woche 6.

5. Hämatoxylin & Eosin (H & E) färben

1. einschläfern Zebrafisch durch Eintauchen in kalt (4 ° C) Anästhesie-Lösung auf Eis für mindestens 10 min und Einatmung die Augen sofort mit Hilfe von kleinen gebogenen Pinzette.
2. Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C für 20 h die ganze Augen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixieren und dann pausiert die Proben in einer Reihe von abgestuften Alkohol (Xylol, 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 96 % für 3 min zweimal und Ethanol 70 % 3 mi einmal n).
   VORSICHT! PFA kann reizend auf die Augen, der Nase und der oberen Atemwege. PFA ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Gefahr für die reproduktive.
3. Der Proben in Paraffin eingebettet, geschnitten 5 µm-Abschnitte auf der Ebene des Sehnervenkopfes und klebe sie auf Glasobjektträger.
4. Fleck in den deparaffinized Abschnitten mit 0,1 % Säure Hämatoxylin Lösung für 5 min und Tauchen Sie die Folien zweimal in destilliertem Wasser nach dem Eintauchen der Folien in Salzsäure-Mix (2 mL 25 % HCl in 250 mL destilliertes Wasser) und Ammoniak (2 mL 25 % Ammoniak in 250 mL mischen destilliertes Wasser). Fleck in den Abschnitten mit Eosin G wässriger Lösung 0,5 % für 3 min nach der Entwicklung der Hämatoxylin-Färbung von Leitungswasser für mindestens 10 min.
5. Montieren Sie dehydrierten Folien in Acrylharz Eindeckmittel und beobachten Sie die Folien unter dem Lichtmikroskop.

6. Immunohistochemistry für die Aktivierung von MC

1. die deparaffinized Abschnitte in Antigen Abruf Puffer (Tris-EDTA + 0,05 % nicht-ionische Waschmittel, pH 9,0) für 3 min in eine geeignete Dampfgarer oder Mikrowelle für 10-15 min. erhitzen und waschen dreimal mit TBS für 5 min.
2. Kreis in den Abschnitten mit einem Silikon Stift und hinzufügen 100 µL blockiert Lösung (TBS + 10 % normalem Ziegenserum + 1 % Rinderserumalbumin, pH 7.6) bei Raumtemperatur für 1 h.
3. Fleck mit Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Kaninchen polyklonalen Antikörper und Anti-Glutamin Synthestase (GS) Maus monoklonaler Antikörper, sowohl in einer Verdünnung von 1: 200 (40 µL pro Probe). Über Nacht inkubieren Sie die Folie in eine feuchte Kammer bei 4 ° C. Waschen dreimal mit TBS + 0,1 % Tween 20 für 5 min.
4. Finish Visualisierung mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Dieses Protokoll verwendet eine Ziege Anti-Kaninchen IgG H & L grün Sekundärantikörper für GFAP und eine Ziege Anti-Maus IgG H & L leuchtend rot für GS, sowohl in einer Verdünnung von 1: 500 bei Raumtemperatur für 1 h
5. Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit DAPI und beobachten Sie die Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Echtzeit-OCT: ein Laser Verletzungen Modell induzieren eine gut abgegrenzte Zone von Schäden in der Netzhaut Zebrafisch verwendet, um die Analyse der Rolle der MCs in retinalen Reparatur. Die Website des Schadens wurde mittels in Vivo OCT zum ersten Mal (Tag 0) innerhalb von 60 Minuten nach der Verletzung (Abbildung 3) abgebildet. Um die Optik des Auges Fisch zu kompensieren, wurde eine maßgeschneiderte Kontaktlinse auf die Hornhau...

Diskussion

Regeneration/Degeneration der Netzhaut in der Zebrabärbling wurde durch verschiedene Ansätze wie Zytotoxin-vermittelte Zelle Tod²², mechanische Verletzungen²³und thermische Schädigung²⁴untersucht. Wir beschäftigten 532 nm Diodenlaser die Zebrafisch Netzhaut beschädigen. Unser Modell bietet dabei mehrere Vorteile. Zum Beispiel haben wir schnell einen klar umrissenen Bereich der Verletzung in der äußeren Netzhaut, speziell in der PRs-Schicht lok...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer