Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

Riepilogo

Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.

Abstract

Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è il potenziale permanente della retina Teleostei per neurogenesi retinica e la rigenerazione dopo gravi danni. Studiando le vie di rigenerazione in zebrafish potrebbe portare a nuove comprensioni di sviluppare strategie innovative per il trattamento di malattie degenerative retiniche nei mammiferi. Qui, ci siamo concentrati sull'induzione di una lesione focale a retina esterna in zebrafish adulto per mezzo di un laser a diodo 532 nm. Una lesione localizzata permette di indagare i processi biologici che avvengono durante la degenerazione retinica e rigenerazione direttamente presso l'area di danno. Usando la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT), siamo stati in grado di definire la posizione della rigenerazione successiva area e monitor danneggiata in vivo. Infatti, la formazione immagine OCT produce immagini ad alta risoluzione, a sezione trasversale della retina zebrafish, fornendo informazioni che era precedentemente disponibile solo con le analisi istologiche. Al fine di confermare i dati da ott in tempo reale, sono state eseguite sezioni istologiche e risposta rigenerativa dopo l'induzione della lesione retinica è stata studiata da immunohistochemistry.

Introduzione

Visione è probabilmente il senso più essenziale dell'essere umano e la sua svalutazione ha un alto impatto socio-economico. Nei paesi industrializzati, le malattie degenerative retiniche rappresentano la maggior parte della perdita della vista e cecità fra la popolazione adulta¹. Retinite pigmentosa (RP) è la causa ereditaria più comune di cecità nella gente fra le età di 20 e 60, che colpisce circa 1,5 milioni di persone in tutto il mondo^2,3. È una famiglia eterogenea di malattie retiniche ereditarie caratterizzata da perdita progressiva dei fotorecettori (PRs) seguita da degenerazione dell'epitelio retinico del pigmento e, successivamente, il gliosis e il rimodellamento di neuroni interno⁴. Il corso della malattia può essere spiegato dalla perdita incrementale dei due tipi cellulari PR, solitamente a partire con i coni retinici, che sono responsabili della visione acromatico nella luce fioca e coni, che sono essenziali per la visione e l'acuità visiva del colore⁵. Un singolo difetto di gene è sufficiente per causare la RP. Finora più di 130 mutazioni in oltre 45 geni sono state associate con la malattia⁶. Questo conduce a diversi fenotipi di malattia ed è una ragione per cui la terapia genica è non generalizzabile e così un approccio terapeutico intricato. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche generali per il trattamento di degenerazioni retiniche in accecante malattie.

Degenerazione retinica spesso comporta perdita di PR; Pertanto, la morte delle cellule di PR è un marchio di garanzia di processi degenerativi della retina⁷. Già è stato dimostrato che la morte delle cellule PR stimola Müller glia cella (MC) attivazione e proliferazione⁸. MCs, il tipo di cellule gliali principali nella retina dei vertebrati, una volta sono stati considerati per essere nient'altro che una "colla" tra neuroni retinici. Negli ultimi anni, molti studi hanno dimostrato che MCs agire come più di mera strutturali sostengono il⁹. Tra le diverse funzioni, MCs partecipare anche nella neurogenesi e¹⁰di riparazione. Infatti, in risposta a fattori diffusibili dalla degenerazione retina, MCs significativamente aumentare l'espressione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Di conseguenza, GFAP etichettatura può essere utilizzato come un indicatore per l'attivazione di MC come una risposta secondaria a lesioni retiniche e degenerazione¹¹.

Recentemente, abbiamo sviluppato un adattamento del romanzo di lesioni focali usando un laser per indurre la degenerazione retinica in zebrafish (Danio rerio). Lesione focale è vantaggioso per lo studio di alcuni processi biologici come la migrazione delle cellule nel sito di feriti e la tempistica precisa degli eventi che si svolgono durante la rigenerazione della retina¹². Inoltre, il pesce zebra è diventato importante nella ricerca visiva a causa delle somiglianze tra il sistema visivo e quello di altri vertebrati. Lorda caratteristiche morfologiche ed istologiche di retine umane e Teleostei visualizzano alcune differenze. Di conseguenza, retine umane e zebrafish contengono le stesse classi principali delle cellule organizzate nello stesso modello a strati, dove la luce-sensing fotorecettori occupano lo strato più esterno, mentre i neuroni di proiezione retinica, le cellule del ganglio, risiedono nella parte più interna un neurone strato, prossimale alla lente. Gli interneuroni retinici, amacrine, bipolare e cellule orizzontali, localizzano tra strati di cellule del fotoricettore e del ganglio¹³. Inoltre, la retina di zebrafish è dominata dal cono e quindi più vicino alla retina umana che, ad esempio, la retina del roditore intensamente studiata. Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è la persistente neurogenesi nella retina di pesce e rigenerazione della retina dopo danni. In zebrafish, MCs può dedifferentiate e mediare la rigenerazione in retina feriti^14,15. Nel pollo, MCs hanno alcune capacità anche di inserire nuovamente il ciclo cellulare e di dedifferentiate. A seguito di lesione retinica in pesci adulti, MCs adottare determinate caratteristiche di cellule staminali e progenitrici, la migrazione verso il tessuto retinico danneggiato e produrre nuovi neuroni¹⁶. Profili di espressione genica di mammiferi MCs ha rivelato somiglianze inaspettate ai progenitori della retina, e prova per potenziale neurogenico intrinseco di MCs nella pollo, roditore e nella retina umana sta sviluppandosi¹⁷. Tuttavia, perché la risposta rigenerativa negli uccelli e nei mammiferi è inferiore rispetto con la risposta robusta nel pesce non è ancora capito. Di conseguenza, la comprensione dei meccanismi di riparazione endogena in zebrafish può suggerire strategie per stimolare la rigenerazione della retina in mammiferi ed esseri umani. Impiegando il meccanismo di riparazione endogena di MCs come strumento terapeutico per il trattamento dei pazienti con degenerazione retinica avrebbe un impatto eccezionale per la nostra società.

Qui, forniamo i passaggi necessari per utilizzare il modello di degenerazione/rigenerazione nella ricerca oftalmica. Prima ci siamo concentrati sulla induzione del danno focale nella retina neurosensoriale, quindi sulla formazione immagine degli eventi in via di sviluppo presso il sito di lesione e infine visualizzante coinvolgimento di MCs adiacente. Il protocollo generale è relativamente facile da effettuare e si apre una vasta gamma di possibilità per la valutazione della retina in seguito.

Protocollo

tutti gli esperimenti aderito all'istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e il rispetto dei relativi regolamenti delle autorità governative.

1. animali

1. TgBAC mantenere (gfap:gfap-GFP) ceppo di zebrafish 167 (AB) di età compresa tra 6-9 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un ciclo luce/buio di 14/10 h ¹⁸.
2. Seguire le istruzioni di cura degli animali delle istituzioni coinvolte per esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte delle autorità governative.

2. Anestesia sistemica reversibile

1. preparare la soluzione stock di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate sale (tricaina) sciogliendo 400 mg di polvere di tricaina in 97,9 mL di serbatoio acqua e 2,1 mL di 1 M di Tris buffered saline (TBS). Regolare il pH 7.0 con 1 M Tris (pH 9) e conservare a 4 ° C nel buio fino a un mese.
   Nota: Tricaina dovrebbe essere preparato in acqua come le condizioni di vita naturale dell'animale, dovrebbe essere usato preferibilmente acqua serbatoio originale.
2. Diluire la soluzione di riserva 01:25 in serbatoio di acqua e utilizzare subito.
3. Inserire un 10cm di Petri contenente 50 mL di soluzione di anestesia, fino a quando diventano immobile e non rispondono agli stimoli esterni (circa 2-5 min, a seconda del peso e l'età) di zebrafish.
4. Trasferire ogni pesce a mano a un titolare di pin del silicone su misura per il trattamento laser ( Figura 1A).
   ATTENZIONE! Il pesce può rimanere anestetizzato di fuori del serbatoio per solo fino a 10 min.
5. Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine, posizionare il danio zebrato nel contenitore contenente acqua serbatoio.
6. Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.

3. Lesione focale sulla Retina del laser

Nota: A 532 nm diodo laser viene utilizzato per creare danno luce focale sulla retina di zebrafish. Il set-up sperimentale del laser consente la creazione di una lesione retinica focale riproducibile in zebrafish adulto.

1. Impostare la potenza di uscita del laser: 70 mW; diametro antenna: 50 µm; durata impulso: 100 ms.
   attenzione! L'utilizzo della luce laser richiede protettivi appropriati ed etichettatura dell'area.
2. Applicare 1-2 gocce di 2% idrossipropilmetilcellulosa topicamente nell'occhio prima del trattamento e utilizzare una lente del laser del fondo 2,0 mm per focalizzare il fascio di puntamento laser sulla retina.
   ATTENZIONE! idrossipropilmetilcellulosa gocce sono viscosi e può causare problemi di respirazione se si va sulle lamelle.
3. Posto quattro laser macchie intorno al nervo ottico sulla sinistra dell'occhio e usare l'occhio destro, non trattato come controllo interno.

4. In vivo Imaging della morfologia retinica

1. il giorno 0, visualizzare la retina di zebrafish direttamente dopo l'induzione di laser senza riportarli dall'anestesia. A tutti gli altri punti di tempo, impiegare l'anestesia generale (vedere sezione 2: anestesia sistemica reversibile). Posizionare il zebrafish immobilizzato su un supporto di pin del silicone su misura ( Figura 1 B, b. 1).
2. Per ottenere immagini ottimali, tagliare una lente a contatto idrogel commercialmente disponibili per adattare l'occhio di zebrafish (Ø = 5,2 mm, r = 2.70 mm, spessore centro = 0,4 mm) per mezzo di un punzone di foro. Riempire la superficie concava della lente con metilcellulosa e metterlo sopra la cornea.
3. Dotare il sistema di OCT con una lente di lampada fessura senza contatto 78D.
4. a fuoco l'immagine ad infrarosso (IR) in IR + OCT mode ( Figura 2A) per visualizzare il fondo dell'occhio e l'IR foto cliccando il " Acquire " pulsante ( Figura 2B) per localizzare il macchie sulla retina utilizzando il sistema del laser ' software s.
Modalità di
5. Visualize una sezione tridimensionale degli strati retinici in IR + OCT e scattare le foto cliccando il " Acquire " pulsante ( Figura 2B). Osservare la gravità delle lesioni nello strato nucleare esterno (ONL) (vedere sezione 3: Laser lesione focale sulla retina) in queste immagini.
6. Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine posto zebrafish in un recipiente contenente acqua serbatoio.
7. Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.
8. Eseguire simili in vivo imaging della morfologia retinica il giorno 1, 3, 7, 14 e settimana 6.

5. Ematossilina & eosina (H & E) colorazione

1. eutanasia zebrafish di immersione in freddo (4 ° C) soluzione di anestesia sul ghiaccio per almeno 10 min ed enucleare gli occhi immediatamente per mezzo di piccola pinzetta.
2. Fissare gli occhi tutto in paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 20 h e quindi disidratare i campioni in una serie di graduali alcool (xilene 100% per 5 min due volte, etanolo 100% per 5 min due volte, etanolo 96% per 3 min due volte ed etanolo 70% 3 mi n una volta).
   ATTENZIONE! PFA può essere irritante per gli occhi, il naso e la traccia delle vie respiratorie superiore. PFA è un agente cancerogeno umano conosciuto e un sospetto rischio riproduttivo.
3. Incorporare i campioni in paraffina, tagliare 5 µm sezioni a livello della testa del nervo ottico e montarli sulle lastre di vetro.
4. Macchia le sezioni Sparaffinatura con soluzione di Ematossilina acida di 0,1% per 5 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata dopo l'immersione le diapositive nel mix di acido cloridrico (2 mL 25% HCl in 250 mL di acqua distillata acqua) e mescolare (2 mL 25% di ammoniaca in 250 mL di ammoniaca acqua distillata). Macchia le sezioni con Eosina G soluzione acquosa allo 0,5% per 3 minuti dopo lo sviluppo dell'intensità dell'ematossilina macchiatura di acqua del rubinetto per almeno 10 min.
5. Montare i vetrini disidratati in mezzo di montaggio di resina acrilica e osservare i vetrini al microscopio luce.

6. Immunohistochemistry per l'attivazione di MC

1. scaldare le sezioni Sparaffinatura nel buffer di recupero di antigene (Tris-EDTA + 0.05% detergente non ionico, pH 9.0) per 3 minuti in un piroscafo appropriato o un forno a microonde per 10-15 min e lavare tre volte con TBS per 5 ogni min.
2. Blocco cerchio le sezioni con un silicone penna e aggiungere 100 µ l soluzione (TBS + siero normale di capra 10% + 1% albumina di siero bovino, pH 7.6) a temperatura ambiente per 1 h.
3. Macchia con anticorpo policlonale di coniglio anti-proteina fibrillare acida (GFAP) e con l'anticorpo monoclonale del mouse anti-glutamina sintetasi (GS), entrambi in una diluizione di 1: 200 (40 µ l per campione). Incubare il vetrino in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Lavare tre volte con TBS + 0.1% Tween 20 per 5 minuti ciascuno.
4. Visualizzazione di finitura con l'appropriato anticorpi secondari. Questo protocollo utilizzato un anti-coniglio di capra IgG H & anticorpo secondario L verde per GFAP e un anti-topo di capra IgG H & L rosso brillante per GS, entrambi in una diluizione di 1: 500 a temperatura ambiente per 1 h.
5. Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente DAPI e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.

Risultati

OCT in tempo reale: al fine di analizzare il ruolo di MCs in riparazione retinica, abbiamo usato un modello di lesione laser inducendo una zona ben delineata di danno nella retina zebrafish. Il sito del danno era imaged mediante OCT in vivo per la prima volta (giorno 0) entro 60 minuti dopo l'infortunio (Figura 3). Per compensare l'ottica del fish eye, una lente a contatto su misura è stato disposto sulla cornea. Immediatamente dopo...

Discussione

Rigenerazione/degenerazione retinica in zebrafish è stata studiata da diversi approcci quali citotossina-mediata delle cellule morte²², danno meccanico²³e lesione termica²⁴. Abbiamo impiegato un laser a diodo 532 nm per danneggiare la retina di zebrafish. In tal modo, il nostro modello offre diversi vantaggi. Per esempio, abbiamo creato rapidamente un'area ben definita di lesioni localizzate in retina esterna, in particolare nello strato PRs. Inoltr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer