En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

Resumen

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

Resumen

Para apoyar la aplicación clínica de humano adiposo derivado mesenquimal (haMSC) terapia de células madre para la artrosis de rodilla (KOA), examinamos la eficacia de la persistencia de la célula y la biodistribución de haMSCs en modelos animales. Hemos demostrado un método para etiquetar la membrana de la célula de haMSCs con colorante fluorescente lipofílico. Posteriormente, la inyección intraarticular de las células etiquetadas en ratas con KOA quirúrgico inducido fue monitoreada dinámicamente por un en vivo sistema de imagen. Se empleó el lipofílico carbocyanines hizo (DilC₁₈ (5)), un far-red análogo fluorescente de Dil (dialkylcarbocyanines), que utiliza un láser rojo para evitar la excitación de la autofluorescencia verde natural de los tejidos circundantes. Además, los espectros de emisión rojo-cambiado de puesto de permitir la proyección de imagen de tejidos profundos en animales vivos y el procedimiento de etiquetado no causaron efectos citotóxicos o daño funcional de haMSCs. Este enfoque ha demostrado ser un método de seguimiento eficiente para haMSCs en un modelo de ratas KOA. La aplicación de este método podría utilizarse también para determinar la vía de administración óptima y la dosis de MSCs de otras fuentes en los estudios preclínicos.

Introducción

Osteoartritis de rodilla (KOA) es un desorden degenerativo, resultantes de la pérdida de cartílago articular y la inflamación progresiva, que se ha convertido en una enfermedad crónica importante en los ancianos en el mundo¹. Sin embargo, los tratamientos actuales con fármacos antiinflamatorios, suplementos físicos y procedimientos quirúrgicos sólo pueden proporcionar alivio temporal de dolor sintomático².

Humanas derivado de adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) se han convertido en un prometedor remedio regenerativo para la osteoartritis de la rodilla, debido a su diferenciación multipotent potencial para regeneración de cartílago e inmunomoduladores propiedades^{3, 4}. En comparación con vías farmacológicas para investigar mecanismos de acción en vivo, seguimiento de haMSCs vivo en modelos animales de pequeño KOA es actualmente instructivo para establecer la razón de ser de y la factibilidad de la terapia de haMSC antes de la aplicación clínica. Para las pruebas preclínicas, meniscectomy medial (MM) desestabiliza la carga mecánica de la articulación para inducir KOA en ratas, que ofrece un modelo relativamente factible con reproducibilidad constante⁵. La aparición de KOA inducida por MM es anterior a la transección del ligamento cruzado anterior sola o combinada con parcial meniscectomy intermedio⁶. Por lo tanto, las interacciones a largo plazo entre haMSCs inyectado con el microambiente patológico de KOA son a menudo evaluadas en ratas inducidas por MM^7,8.

Aunque la eficacia terapéutica de haMSCs ha sido ampliamente divulgado conocimiento relevante sobre la persistencia en vivo de haMSCs implantado mediante inyección intra-articular (IA) es escaso^9,10. Por lo tanto, distintos métodos de etiquetado celulares han sido desarrollados, incluyendo el immunohistology¹¹, luciferasa¹², transfección de¹³ proteína fluorescente verde, óxido de hierro de etiquetado para la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)¹⁴ y numerosas células fluorescentes tintes^8,15,16. Comparado con el análisis de la histología de la mano de obra intensiva, en vivo no invasivo la proyección de imagen emplea dispositivos ópticos para detectar la distribución en tiempo real y dinámica de las células etiquetadas con señales fluorescentes^10,17. Para la proyección de imagen funcional de células vivas, etiquetado fluorescente de cytocompatible es una técnica de sofisticado rastreo radioactivo libre para revelar actividades celulares después de trasplante de células madre¹⁸. Por otra parte, tintes lipofílicos fluorescentes multicoloras poseen ventajas sobre tintes hidrófilos amino reactivos o proteínas fluorescentes, incluyendo la permeabilidad de la célula mejorada y mayor fluorescencia cuántica rendimientos¹⁹.

Por lo tanto, los protocolos aquí utilizan un rojo láser para excitar las células etiquetadas con carbocyanines lipofílico hizo (DilC₁₈(5)), que es un far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico²⁰. Los espectros de excitación y emisión rojo-cambiado de puesto de evita autofluorescent interferencia y permite la proyección de imagen durante un largo período de tiempo en animales vivos⁸de tejidos profundos. Este método de seguimiento de células en vivo con que es válido para el monitoreo de células madre trasplantadas, tales como haMSCs, en modelos animales, que es esencial para entender y mejorar la actual terapia regenerativa con células madre.

Protocolo

procedimientos con sujetos animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional local y Comité de ética, con un esfuerzo para minimizar el sufrimiento de los animales. El siguiente protocolo fue aprobado por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) en Shanghai novena personas ’ s Hospital afiliado a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con el protocolo número [2017] 063.

1. establecimiento de un modelo de artrosis de rodilla de ratas de Surgically-Induced

1. para este procedimiento quirúrgico, ratas Sprague Dawley (SD) macho de uso 8-12 semanas de edad con un peso entre 250 y 300 g.
2. Anestesiar a los animales y 40 mg/kg tiletamina zolazepam de 40 mg/kg mediante inyección intramuscular.
3. Colocar el animal en una posición lateral izquierda sobre una platina calefactada. Afeitado completamente la rodilla derecha con una navaja de afeitar. Desinfectar la zona quirúrgica con solución providone-yodo al 10% seguido de etanol al 70%, repetir dos veces más y luego pintar con solución providone-yodo al 10% y cubrir la zona no quirúrgica con un paño quirúrgico.
4. Usando un bisturí, haga una incisión de 2 cm lateralmente a lo largo del tendón rotuliano para exponer el jointcapsules.
5. Utilizar un bisturí para transecto del ligamento colateral medial. Reflejar el menisco hacia el fémur.
6. Goteo de solución estéril de cloruro de sodio 0,9% en la superficie del cartílago articular durante la operación para evitar que el cartílago de la desecación.
7. Coge el menisco medial con pinzas y corte a través el menisco en su punto más estrecho de la fijación tibial con un bisturí ( figura 1A). Evitar lesionar el cartílago.
8. Cerca de la cápsula articular con una sutura absorbible 4-0.
9. Controlar las ratas quirúrgicas hasta que recupere conciencia.
10. Inyectar 20 mg/kg de gentamicina para prevenir la infección y 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía intramuscular para aliviar el dolor después de la cirugía.
11. Mantener las ratas en un Animalario con control de temperatura en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h durante 3-8 semanas Inicio KOA. Los animales continúan recibiendo medicamentos para el dolor, incluyendo pero no limitado a buprenorfina (0,05 mg/kg, i.m.) y gentamicina (20 mg/kg, i.m.), si persisten los síntomas de dolor.

2. Histología de rata KOA modelo

1. sacrificar a las ratas con la excesiva inhalación de ₂ CO (agregar una tasa de relleno de aproximadamente el 30% del volumen por minuto con dióxido de carbono del aire existente en la cámara para hacer la inconsciencia animal dentro de 2-3 min flujo de CO2 mantener por un mínimo de 1 minuto después de la respiración cesa.) en el indicado tiempo puntos (representante se muestran los resultados en 8 semanas de la inducción de KOA que van desde 3 a 8 semanas) después de la cirugía.
2. disecar la piel y el músculo alrededor de las articulaciones de rodilla y de las articulaciones de la rodilla con un bisturí.
3. Fijar las articulaciones de rodilla en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 3 días a temperatura ambiente. Luego, descalcificación de las muestras en 20% de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) por 4 semanas a 4 ° C y cambiar el EDTA cada 3 días.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico, usar equipo de protección personal (EPP), tales como guantes y gafas.
4. Deshidratar las muestras usando un procesador de tejidos automático. El menú para iniciar así un ciclo de lavado: etanol al 70% durante 1 hora; entonces 80% etanol y etanol al 95% para 1 h respectivamente; seguido por 2 ciclos de etanol al 100% para 1 h; Posteriormente, xileno dos veces durante 1 hora cada vez y parafina 3 veces en 58 ° C durante 1 hora cada vez.
   PRECAUCIÓN: Xileno es tóxico, así que use PPE apropiado, como guantes y gafas.
   Nota: Opcionalmente, utilice frascos Coplin para deshidratación manual con la misma configuración que el procesador de tejidos automático.
5. Deposite el aspecto medial de la cara común intacto e incrustar en el bloque de parafina con el tejido que encaja en el centro.
   Nota: Opcionalmente, utilice pinzas para insertar manualmente las muestras en el bloque de parafina.
6. Empezar a disminuir 5 μm secciones sagitales del margen medial de la articulación para 30 μm intervalos con 2 secciones seriales en micrótomo rotatorio.
7. Secciones en portaobjetos de vidrio y Desparafinizar el portaobjetos en xileno. Entre las secciones de serie 2, mancha una diapositiva con hematoxilina & eosina (H & E) tinción: 0,1% hematoxilina durante 15 min, 1% solución de ácido acético para 10 s y 0.5% eosina durante 10 minutos. Y mancha el otro portaobjetos con tinción de Safranina O/Fast Green: 0,1% hematoxilina durante 15 min, 0.02% verde Fast Green durante 3 min., 1% solución de ácido acético para 10 s y 0.1% O safranina durante 3 min
   PRECAUCIÓN: Xileno es tóxico, usar PPE apropiado, tales como guantes, gafas.
8. Anotar las diapositivas manchadas con el sistema de evaluación internacional de la sociedad de investigación de la osteoartritis (OARSI) histopatología en ratas ⁶.

3. Etiquetado de humanos las células madre mesenquimales con el tinte fluorescente hizo

1. preparar hizo etiquetado celular solución en etanol 100% a una concentración de 1 mM. Proteger la solución de etiquetado de la célula de la luz y almacenar a temperatura ambiente por 6 meses.
2. Cultivar haMSCs con procedimientos de cultivo celular estándar en Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM) suplementado con 1% penicilina y estreptomicina y 10% fetal suero de ternera (FCS) en un plato de petri de 10 cm.
3. Separar haMSCs con tripsina de 0.25% de 2 mL con confluencia de previo a alrededor de 80% de EDTA 1 mM.
4. Neutralizar la tripsina con medio de cultivo de 4 mL y centrifugar las células a 800 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
5. Suspender las células en una densidad de 1 x 10 ⁶ células/mL en medio de cultivo libre de suero de 5 mL.
6. Etiqueta las células mediante la adición de 50 μl que solución de etiquetado de células en 5 mL medio de cultivo libre de suero a 37 ° C por 50 minutos
7. Girar las células etiquetadas a 800 x g durante 3 min
8. Lavan las células dos veces con 5 mL fosfato buffer salino (PBS) a 800 x g durante 3 min.
9. Comprobar la haMSCs etiquetados usando un microscopio de fluorescencia con un sistema de filtro de Cy5.
10. Contar las células con tinción de azul de tripano y obtener 2.5 x 10 ⁶ células viables en 100 μl PBS para la inyección.

4. En Vivo Fluorescente imágenes a pista haMSCs

1. ocho semanas después de la cirugía (paso 1), anestesiar las ratas KOA por la inyección intramuscular de tiletamina de 25 mg/kg y zolazepam de 25 mg/kg.
2. Afeitado completamente la rodilla derecha con una navaja para exponer el área. Desinfectar el área con etanol al 70%.
3. Con una aguja de jeringa 26 G, inyectar 2.5 x 10 ⁶ etiquetado células en 100 μl PBS en el centro de la zona del triángulo formado por el lado medial del ligamento rotuliano, el cóndilo femoral medial y el cóndilo tibial medial ( figura 1B).
4. Abra el software de la proyección de imagen e inicializar la bioluminiscencia en vivo sistema de imagen.
5. Ratas de posición en el decúbito supino posición en la etapa central del sistema de proyección de imagen y cierre la puerta de la cámara de.
6. Comprobar la " fluorescente " casilla de verificación y seleccione filtro fluorescente fija de 640 nm para la excitación y 680 nm de emisión ( figura 2A).
7. Seleccionar campo de visión a D. Set pixel binning en medio (8), F/Stop para 2 y la exposición tiempo al auto. Mantener el óptimo tiempo de exposición constante para obtener resultados comparables en todo el estudio ( figura 2A).
8. Quitar el animal de la etapa y el monitor para la recuperación de la anestesia.
   Nota: Animal del lugar en una almohada cubierta con 2-3 capas de toallas de.
9. Elegir las unidades de eficiencia radiante para la medición de la fluorescencia ( figura 2B). Seleccione las regiones de interés (ROI) para el análisis y cuantificación de señales fluorescentes de cada imagen ( figura 2).
10. Repetir en vivo la proyección de imagen para cada rata secuencialmente para el estudio de retención longitudinal haMSCs en el empalme de.
    Nota: Sugerimos a los animales de la proyección de imagen ' señales fluorescentes por sistema de proyección de imagen in vivo una vez cada dos días durante la primera semana después de la inyección y una vez por semana hasta que la señal no puede ser detectada.

Resultados

Para inducir el modelo KOA, MM fue realizado en la articulación de la rodilla derecha de ratas SD (figura 3). Ocho semanas después de la cirugía, las ratas fueron sacrificadas y las secciones seriadas de empalmes de la rodilla se evaluaron con dos H & E y Safranina O/Fast Green tinción (figura 4). H & E la coloración, la superficie del cartílago articular exhibió las fronteras más ásperas en las rodillas de cirug...

Discusión

Normas de seguridad y estudios de biodistribución de terapia de células madre están urgente antes de que podemos llevar tratamiento regenerador de células madre para el KOA del Banco a la cabecera. Sin embargo, el medio ambiente patológico de la enfermedad desempeña un papel importante en la persistencia y la biodistribución de trasplantados haMSCs¹⁰. Recientemente, nuestro grupo demostró que la inyección intraarticular de haMSCs persistió ya en un ambiente patológico de KOA de las inye...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None