In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da' etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).

Abstract

Per supportare l'applicazione clinica della terapia umana adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali (haMSC) per l'osteoartrite del ginocchio (KOA), abbiamo esaminato l'efficacia di persistenza delle cellule e biodistribuzione di haMSCs nei modelli animali. Abbiamo dimostrato un metodo per assegnare un'etichetta della membrana cellulare di haMSCs con colorante fluorescente lipofilico. Successivamente, iniezione intra-articolare delle cellule con etichettate in ratti con KOA chirurgicamente indotta è stata monitorata in modo dinamico da un in vivo imaging system. Abbiamo impiegato il lipofilico carbocyanines fatto (DilC₁₈ (5)), un analogo fluorescente da' di Dil (dialkylcarbocyanines), che utilizzato un laser rosso per evitare l'eccitazione del autofluorescence verde naturale dai tessuti circostanti. Inoltre, lo spettro di emissione rosso-spostato di permesso deep tissue imaging negli animali vivi e la procedura di etichettatura non causato nessun effetti citotossici o danno funzionale a haMSCs. Questo approccio ha dimostrato di essere un metodo di verifica efficiente per haMSCs in un modello di ratto KOA. L'applicazione di questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per determinare la via di somministrazione ottimale ed il dosaggio delle MSC da altre fonti in studi pre-clinici.

Introduzione

Osteoartrite del ginocchio (KOA) è un disordine degenerante derivanti dalla perdita di cartilagine articolare e l'infiammazione progressiva, che è diventata una malattia cronica importante negli anziani intorno al mondo¹. Tuttavia, le attuali terapie con farmaci anti-infiammatori, integratori fisici e procedure chirurgiche possono fornire solo un sollievo temporaneo per dolore sintomatico².

Adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) sono diventati un rimedio rigenerativo promettente per l'osteoartrite del ginocchio, a causa della loro differenziazione multipotenti potenziale per la rigenerazione della cartilagine e immunomodulatori proprietà^{3, 4}. Rispetto ai percorsi farmacologici per studiare i meccanismi di azione in vivo, tracking live haMSCs in modelli animali di piccole dimensioni KOA è attualmente istruttivo per stabilire la spiegazione razionale per e la fattibilità della terapia haMSC prima applicazione clinica. Per i test preclinici, meniscectomia mediale (MM) destabilizza il carico meccanico del giunto per indurre KOA in ratti, che fornisce un modello relativamente fattibile con riproducibilità costante⁵. L'insorgenza di KOA indotta da MM è antecedente il transection del legamento crociato anteriore da solo o combinato con parziale meniscectomia mediale⁶. Pertanto, le interazioni a lungo termine tra haMSCs iniettato con il microambiente patologico di KOA sono spesso valutate in ratti indotti da MM^7,8.

Anche se l'efficacia terapeutica di haMSCs è stato ampiamente riferita, pertinenti conoscenze sulla persistenza in vivo di haMSCs impiantato tramite iniezione intra-articolare (IA) è scarsa^9,10. Quindi, sono stati sviluppati vari metodi di etichettatura cellulare, tra cui immunohistology¹¹, luciferasi¹², trasfezione¹³ proteina fluorescente verde, ossido di ferro di etichettatura per imaging a risonanza magnetica (MRI)¹⁴ e numerose cellule fluorescenti coloranti^8,15,16. Confrontato con analisi di istologia laborioso, in vivo imaging non-invasivo si avvale di dispositivi ottici per rilevare la distribuzione in tempo reale e dinamica delle cellule identificate con segnali fluorescenti^10,17. Per l'imaging funzionale di cellule vive, citocompatibili Contrassegno fluorescente è una tecnica di sofisticato monitoraggio radioattivo senza rivelare attività cellulari dopo trapianto di cellule staminali¹⁸. Inoltre, multicolore tinture fluorescenti lipofili possiedono vantaggi rispetto ai coloranti idrofiliche ammino-reattivi o proteine fluorescenti, compresi i loro permeabilità cellulare migliorata e rafforzata fluorescenza quantistica rendimenti¹⁹.

Così, i protocolli inclusi qui utilizzano un rosso laser per eccitare le cellule identificate con lipofilico carbocyanines fatto (DilC₁₈(5)), che è un da' fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analogico²⁰. Gli spettri rosso-spostato di eccitazione e di emissione di evita interferenze autofluorescent e permette deep tissue imaging per un lungo periodo di tempo in animali vivi⁸. Questo metodo di rilevamento delle cellule in vivo etichettato con fatto è valido per il monitoraggio cellule staminali trapiantate, come haMSCs, in modelli animali, che è essenziale per capire e migliorare l'attuale terapia rigenerativa con cellule staminali.

Protocollo

procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di etica e locali istituzionali Animal Care con uno sforzo per ridurre al minimo la sofferenza animale. Il seguente protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) a Shanghai Ninth People ’ s ospedale affiliato a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con il protocollo numero [2017] 063.

1. istituzione di un modello di osteoartrite del ginocchio del ratto Surgically-Induced

1. per questa procedura chirurgica, uso 8-12 settimana vecchi ratti Sprague Dawley (deviazione standard) con un peso corporeo tra 250 e 300 g.
2. Anestetizzare gli animali con 40 mg/kg tiletamina e zolazepam 40mg/kg tramite iniezione intramuscolare.
3. Metti l'animale in posizione laterale sinistra su un piatto riscaldato. Shave accuratamente il ginocchio destro con un rasoio. Disinfettare l'area chirurgica con soluzione di providone-iodio 10% seguita da etanolo al 70%, ripetere altre due volte e poi dipingere con soluzione di 10% providone-iodio e coprire l'area non chirurgica con un tampone chirurgico.
4. Usando un bisturi chirurgico, praticare un'incisione di 2 cm lateralmente lungo il tendine rotuleo per esporre il jointcapsules.
5. Utilizzare un bisturi chirurgico per recidere il legamento collaterale mediale. Riflettere il menisco verso il femore.
6. Gocciolare soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% sulla superficie della cartilagine articolare durante il funzionamento per evitare che la cartilagine dall'asciugarsi.
7. Afferrare il menisco mediale con il forcipe e tagliare attraverso il menisco al suo punto più stretto dal pignoramento tibial con un bisturi ( Figura 1A). Evitare di ferire la cartilagine.
8. Chiudere la capsula articolare con un suturare assorbibile 4-0.
9. Monitorare i ratti chirurgici fino a quando non riacquistano coscienza.
10. Iniettare 20 mg/kg di gentamicina per prevenire l'infezione e buprenorfina 0,05 mg/kg attraverso un itinerario intramuscolare per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico.
11. Mantenere i ratti in una struttura animale temperatura controllata sotto un ciclo di luce/buio di 12 h per 3-8 settimane all'insorgenza KOA. Gli animali continuano a ricevere il farmaco di dolore, compreso ma non limitato a buprenorfina (0,05 mg/kg, i.m.) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistono i sintomi di dolore.

2. Valutazione di istologia del ratto KOA modello

1. sacrificare i ratti con eccessiva CO ₂ inalazione (Aggiungi un tasso di riempimento di circa il 30% del volume camera al minuto con l'anidride carbonica dell'aria esistente nella camera per rendere l'incoscienza animale entro 2-3 min flusso di CO2 di mantenere per un minimo di 1 min dopo respirazione cessa.) al indicato punti temporali (rappresentante risultati sono mostrati a 8 settimane di induzione di KOA che vanno da 3 a 8 settimane) dopo la chirurgia.
2. sezionare la pelle e i muscoli intorno alle articolazioni di ginocchio e tagliare i giunti del ginocchio con un bisturi.
3. Fissare i giunti di ginocchio in paraformaldeide al 4% (PFA) per 3 giorni a temperatura ambiente. In seguito, decalcificare i campioni in 20% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per circa 4 settimane a 4 ° C e cambiare l'EDTA ogni 3 giorni.
   Attenzione: Paraformaldeide è tossico, indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE), come guanti e occhiali da vista.
4. Disidratare i campioni utilizzando un processatore automatico. Impostare il menu per avviare un ciclo di risciacquo come segue: etanolo al 70% per 1 h; quindi 80% etanolo ed etanolo al 95% per 1 h rispettivamente; seguita da 2 cicli di etanolo al 100% per 1 h; Successivamente, xilene due volte per 1 h ogni volta e ogni volta di paraffina 3 volte a 58 ° C per 1 h.
   Attenzione: Xilene è tossico, quindi indossate PPE appropriato, come guanti e occhiali da vista.
   Nota: Facoltativamente, utilizzare vasi di Coplin per disidratazione manuale con la stessa impostazione come il processatore automatico.
5. Posare la funzione mediale della faccia comune intatta e incorporarlo nel blocco paraffina con tessuto incastonato nel centro.
   Nota: Facoltativamente, utilizzare pinze per incorporare i campioni il blocco di paraffina manualmente.
6. Iniziare a tagliare 5 sezioni sagittali µm dal margine mediale del giunto per intervalli di 30 µm con 2 sezioni seriali di microtomo rotativo.
7. Montare profili sulle lastre di vetro e deparaffinizzare le diapositive in xilene. Tra le 2 sezioni seriali, macchiare una diapositiva con ematossilina & eosina (H & E) colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,5% eosina per 10 min. E macchia l'altra diapositiva con safranina O/Fast Green colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 0,02% Fast Green per 3 min., 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,1% O di safranina per 3 min.
   Attenzione: Xilene è tossico, indossare i dpi appropriati, come guanti, occhiali da vista.
8. Punteggio ottenuto i vetrini colorati utilizzando il sistema di valutazione istopatologia di osteoartrite Research Society International (OARSI) in ratti ⁶.

3. Etichettatura di cellule staminali mesenchimali umane con la tintura fluorescente, ha fatto

1. preparare fatto d'etichettatura delle cellule soluzione in etanolo al 100% ad una concentrazione di 1 mM. Proteggere la soluzione d'etichettatura delle cellule dalla luce e conservare a temperatura ambiente per 6 mesi.
2. Crescere haMSCs con procedure di cultura cella standard in Dulbecco ' s modificato Eagle ' medium s (DMEM) completato con siero di vitello fetale penicillina e streptomicina e 10% 1% (FCS) in una capsula Petri 10cm.
3. Staccare haMSCs con tripsina 0,25% 2ml con confluenza prima circa l'80% di 1 mM EDTA.
4. Neutralizzare la tripsina con 4 mL di terreno di coltura e girare le cellule a 800 x g per 3 min a temperatura ambiente.
5. Sospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule/mL nel mezzo di coltura privo di siero 5ml.
6. Etichetta le cellule aggiungendo 50 µ l fatto soluzione d'etichettatura delle cellule nel mezzo di coltura privo di siero da 5 mL a 37 ° C per 50 min.
7. Girare le cellule con etichettate a 800 x g per 3 min.
8. Lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato (PBS) a 800 x g per 3 minuti ciascuno,.
9. Verifica la haMSCs etichettati utilizzando un microscopio a fluorescenza con un set di filtri Cy5.
10. Contare le celle con la macchiatura blu di trypan e ottenere 2.5 x 10 ⁶ cellule vitali in 100 µ l PBS iniettabile.

4. In Vivo Fluorescente Imaging per pista haMSCs

1. otto settimane dopo l'intervento chirurgico (passaggio 1), anestetizzare i ratti KOA mediante iniezione intramuscolare di 25 mg/kg tiletamina e zolazepam 25 mg/kg.
2. Radere accuratamente il ginocchio destro con un rasoio per esporre l'area del giunto. Disinfettare la zona comune con etanolo al 70%.
3. Utilizzando un ago di siringa 26 G, iniettare 2,5 x 10 ⁶ etichettati cellule sospese in 100 µ l PBS al centro della zona del triangolo formato dal lato mediale del legamento patellar, il condilo femorale mediale e del condilo tibiale mediale ( Figura 1B).
4. Aprire il software di imaging e inizializzare la bioluminescenza in vivo imaging system.
5. Posizione ratti nella posizione supina posizione nella fase centrale del sistema di imaging e chiudere la porta della camera.
6. Verifica la " fluorescente " casella di controllo e seleziona Filtro fluorescente imposta di 640 nm per l'eccitazione e 680 nm per emissione ( Figura 2A).
7. Selezionare campo di vista a D. impostare Pixelbinning su medio (8), F/Stop per esposizione e 2 ora di auto. Mantenere l'ottimale tempo di esposizione coerenza per ottenere risultati comparabili tra l'intero studio ( Figura 2A).
8. Rimuovere l'animale dal palco e monitor per il recupero dall'anestesia.
   Nota: Animale posto su un rilievo di riscaldamento coperto con 2-3 strati di spugna.
9. Scegliete le unità di efficienza radiante per la misura della fluorescenza ( Figura 2B). Selezionare le regioni di interesse (ROI) per l'analisi e quantificare i segnali fluorescenti da ogni immagine ( Figura 2).
10. Ripetere la procedura di imaging in vivo per ogni ratto in sequenza studiare haMSCs ritenzione longitudinale nel giunto.
    Nota: Consigliamo di imaging gli animali ' segnali fluorescenti da sistema di imaging in vivo una volta ogni due giorni per la prima settimana dopo l'iniezione e una volta ogni settimana fino a quando il segnale non può essere rilevato.

Risultati

Al fine di indurre modello KOA, MM è stato effettuato nel giunto di ginocchio destro di ratti SD (Figura 3). Otto settimane dopo la chirurgia, i ratti sono stati sacrificati e le sezioni di serie di giunti di ginocchio sono state valutate con entrambi H & E e Safranina O/Fast Green macchiatura (Figura 4). Per H & E colorazione, la superficie della cartilagine articolare ha esibito confini più ruvide al ginocchio chirurg...

Discussione

Norme di sicurezza e studi di biodistribuzione di terapia della cellula formativa sono urgentemente necessari prima che possiamo portare il trattamento rigenerativo delle cellule staminali per KOA dalla panchina al capezzale. Tuttavia, l'ambiente patologico della malattia svolge un ruolo importante nella persistenza e biodistribuzione di trapiantati haMSCs¹⁰. Recentemente, il nostro gruppo ha dimostrato che iniezione intrarticolare di haMSCs più persistenti in un ambiente di KOA patologico quanto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None