В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

Резюме

Этот протокол описывает эффективный способ контроля за сохранение клеток и накопление жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) far-red флуоресценции маркировки в мышиной модели коленного остеоартрита (КОА) через Внутрисуставных инъекций (IA).

Аннотация

Чтобы поддерживать клиническое применение жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSC) терапии для коленного остеоартрита (КОА), мы изучили эффективность клеток сохранение и накопление haMSCs в животных моделях. Мы продемонстрировали метод для обозначения клеточной мембраны haMSCs с липофильных флуоресцентных красителей. Впоследствии Внутрисуставных инъекций помечены клетки крыс с хирургическим индуцированных KOA контролируется динамически в vivo imaging системы. Мы заняты липофильных carbocyanines сделал (ДППК₁₈ (5)), far-red флуоресцентные аналоговый Dil (диалкилкарбоцианины), которые использовали красный лазер, чтобы избежать возбуждения естественный зеленый аутофлюоресценция от окружающих тканей. Кроме того красный смещается выбросов спектры допустимое глубокие ткани изображений в живых животных и маркировки процедура вызвала не цитотоксических эффектов или функциональные повреждения haMSCs. Такой подход было показано, быть методом эффективного отслеживания для haMSCs в мышиной модели KOA. Применение этого метода может также использоваться для определения оптимального управления маршрут и дозировка MSCs из других источников в доклинических исследований.

Введение

Коленного остеоартрита (КОА) является результатом потери суставного хряща и прогрессирующим воспалением, который стал основным хронических заболеваний у пожилых людей во всем мире¹дегенеративные расстройства. Однако текущий терапии с использованием противовоспалительных препаратов, физической добавки и хирургических процедур может обеспечить лишь временное облегчение для симптоматического боли².

Жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) стали многообещающим регенеративной средство для коленного остеоартрита, ввиду их Multipotent с дифференциации, потенциал для регенерации хряща и иммуномодулирующие свойства^{3, 4}. По сравнению с фармакологическими маршрутов для изучения механизмов действий в естественных условиях, отслеживание жить haMSCs в небольших животных моделях KOA поучительно в настоящее время установить обоснование и целесообразности haMSC терапии до клинического применения. Для доклинических испытаний, медиальной meniscectomy (мм) дестабилизирует механической нагрузки совместной побудить KOA в крыс, которая обеспечивает относительно осуществимости модель с последовательной воспроизводимость⁵. Начала KOA индуцированных мм раньше чем передней крестообразной связки перерезка отдельно или в сочетании с частичным медиальный meniscectomy⁶. Таким образом долгосрочного взаимодействия между вводят haMSCs с патологическим микроокружения KOA часто оцениваются в крыс, вызванных мм^7,8.

Хотя Терапевтическая эффективность haMSCs был широко сообщалось, соответствующие знания на сохранение в vivo имплантированных haMSCs через Внутрисуставных инъекций (IA) является дефицитных^9,10. Таким образом были разработаны различные методы клеточной маркировки, включая immunohistology¹¹, Люцифераза¹², Зеленый флуоресцирующий белок¹³ трансфекции, оксид железа, маркировки для магнитно-резонансная томография (МРТ)¹⁴ и многочисленные люминесцентные клеток красители^8,,1516. По сравнению с трудоемкой гистология анализы, в естественных условиях неинвазивной визуализации использует оптические устройства для обнаружения реального времени распределение и динамика клеток, помечены флуоресцентные сигналов^10,17. Для функциональной живой клетки изображений, cytocompatible люминесцентные маркировки — сложные отслеживания радиоактивных бесплатно техника раскрыть клеточной деятельности после трансплантации стволовых клеток¹⁸. Кроме того многоцветный липофильных флуоресцентных красителей обладают преимуществами над амино реактивной гидрофильные красителей или флуоресцентных белков, включая их Улучшенная ячейка проницаемость и расширенной флуоресценции квантовой урожайности¹⁹.

Таким образом, здесь включены протоколы используют красный лазер для возбуждения клеток, помечены липофильных carbocyanines сделал (ДППК₁₈(5)), который является far-red флуоресцентные Дил (диалкилкарбоцианины) аналоговый²⁰. Красный смещается возбуждения и выбросов спектры избегает вмешательства autofluorescent и позволяет глубоко ткани изображений в течение длительного периода времени в живых животных⁸. Этот метод отслеживания-клеток в vivo помечены сделал действителен для мониторинга пересаженные стволовые клетки, такие как haMSCs, в моделях животных, которая необходима для понимания и улучшения текущей восстановительной терапии стволовой клетки.

протокол

процедур с участием животных темы были утверждены местных институциональных животное уход и Комитет по этике с целью свести к минимуму страдания животных. Следующий протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в девятой Шанхая ’ больница связанных Шанхай JiaoTong University School of Medicine с протоколом s номер [2017] 063.

1. Создание модели артроз колена крыса Surgically-Induced

1. для этой хирургической процедуры, использовать 8-12 недельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) с весом тела между 250 и 300 г.
2. Анестезировать животных с tiletamine 40 мг/кг и zolazepam 40 мг/кг через внутримышечного.
3. Место животного в левой боковой позиции на сцене с подогревом. Бритье тщательно правого колена с бритвой. Дезинфекция хирургические области с 10% providone йод раствор, затем на 70% этиловом спирте, повторить еще два раза и затем краски с 10% раствор providone йода и охватывают области нехирургических с хирургической pad.
4. С помощью хирургического скальпеля, сделать 2 см разрез сбоку вдоль коленного сухожилия подвергать jointcapsules.
5. Использовать хирургический скальпель трансектных медиальной коллатеральной связки. Отражать мениска к бедренной кости.
6. Капельно стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на поверхности суставного хряща в ходе операции для предотвращения высыхания хряща.
7. Захватить медиального мениска с щипцами и прорезать мениска в самом узком месте от голени вложение с помощью скальпеля ( рис. 1A). Избегайте, ранив хряща.
8. Закройте суставной капсулы с рассасывающиеся шовные 4-0.
9. Мониторинг хирургические крысы до тех пор, пока они восстановить сознание.
10. 20 мг/кг гентамицина для предотвращения инфекции и бупренорфина 0,05 мг/кг через внутримышечный путь для облегчения боли после операции вставки.
11. Поддерживать крыс в контролируемой температурой животных фонда под свет/темно цикл 12 h 3-8 недель до начала KOA. Животных по-прежнему получать боль лекарства, включая но не ограничиваясь бупренорфин (0,05 мг/кг, и.м.) и гентамицин (20 мг/кг, и.м.), если боль симптомы сохраняются.

2. Гистология оценки крыса KOA модель

1. жертву крыс с чрезмерным CO ₂ ингаляции (добавить скорость заполнения около 30% от объема камеры в минуту с двуокиси углерода в существующих воздух в камере, чтобы сделать животных бессознательного в течение 2-3 мин поток поддерживать CO2 менее 1 мин после дыхание перестает.) в указано время точек (представитель результаты показываются в 8 недель KOA индукции от 3 до 8 недель) после хирургии.
2. рассечения кожи и мышц вокруг коленных суставов и отрезали коленных суставов с помощью скальпеля.
3. Исправить коленных суставов в параформальдегида 4% (PFA) для 3 дней при комнатной температуре. После этого, известь образцы в 20% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) около 4 недель при температуре 4 ° C и измените ЭДТА каждые 3 дня.
   Предупреждение: Параформальдегида токсичных, носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), таких как перчатки и очки.
4. Дигидрат образцы с использованием автоматического ткани процессора. Установите в меню, чтобы начать флеш цикла следующим образом: 70% этиловом спирте в течение 1 ч; затем 80% этанола и этанола 95% за 1 ч соответственно; последовали 2 циклов 100% этанола за 1 ч; Впоследствии, ксилол дважды за 1 час каждый раз и парафиновые 3 раза на 58 ° C за 1 час каждый раз.
   Предупреждение: Ксилол токсичных, так что носить соответствующие средства индивидуальной защиты, как перчатки и очки.
   Примечание: При необходимости, использовать Coplin банок для ручной обезвоживания с же настройки как процессор автоматического ткани.
5. Место медиальной аспект нетронутыми совместных лицом вниз и вставлять его в блоке парафина с ткани, встроенных в центр.
   Примечание: При необходимости, использовать щипцы для внедрения образцы в парафин блок вручную.
6. Начинают сократить 5 мкм сагиттальной секций от медиального края шва для 30 мкм интервалов с 2 последовательных секций микротом роторный.
7. Монтировать разделы на стеклянных вставках и deparaffinize слайды в ксилоле. Между 2 последовательных секций, пятно один слайд с применением окрасок гематоксилин & эозином (H & E) пятная: 0.1% гематоксилином 15 мин, 1% раствор уксусной кислоты для 10 s и 0,5% эозина за 10 мин. И пятно другой слайд с Safranin O/Fast зеленой окраски: 0.1% гематоксилином 15 мин, 0,02% быстро зеленый 3 мин, 1% раствор уксусной кислоты для 10 s и 0,1% Safranin O на 3 мин
   Предупреждение: Ксилол токсичных, носить соответствующие средства индивидуальной защиты, например, перчатки, очки.
8. Оценка окрашенных слайды с помощью системы оценки гистопатология международного общества артроз исследований (OARSI) в крыс ⁶.

3. Маркировки человека мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентных красителей сделал

1. подготовить сделал клеток маркировки решение в 100% этанола в концентрации 1 мм. Защиты клетки маркировки решение от света и хранить его при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
2. Растут haMSCs со стандартной ячейки культуры процедурами в Дульбекко ' s изменение орел ' s среднего (DMEM) дополнены 1% пенициллина и стрептомицина и 10% плода телячьей сыворотки (FCS) в чашку Петри 10 см.
3. Отсоединение haMSCs трипсином 2 мл 0,25% с 1 мм слияния до примерно 80% ЭДТА.
4. Нейтрализовать трипсина с 4 мл питательной среды и спина клетки на 800 g x 3 мин при комнатной температуре.
5. Приостановить клетки на плотность составляет 1 x 10 ⁶ клеток/мл в 5 мл сыворотки свободной культуры среднего.
6. Этикетка клетки, добавляя 50 мкл сделал клеток маркировки решение в 5 мл сыворотки свободной культуры среднего при 37 ° C 50 мин
7. Спиновые помечены клетки на 800 x g на 3 мин
8. Мыть клетки, два раза с 5 мл буфера фосфатный (PBS) на 800 x г за 3 мин.
9. Проверить помечены haMSCs, используя флуоресцентный микроскоп с набором фильтров Cy5.
10. Подсчитать ячейки с Трипановый синий окрашивание и получить 2,5 х 10 ⁶ жизнеспособных клеток в 100 мкл PBS для инъекций.

4. В естественных условиях Флуоресцентный Imaging на трек haMSCs

1. через восемь недель после операции (шаг 1), анестезировать KOA крыс внутримышечно по 25 мг/кг tiletamine и 25 мг/кг zolazepam.
2. Бритья правого колена тщательно с бритвой подвергать общей зоне. Лечить области совместного с 70% этанол.
3. С помощью иглы шприца 26 G, придать 2,5 х 10 ⁶ помечены клетки, приостановлено в 100 мкл PBS в центре области треугольник, образованный стороне медиальной связки надколенника, медиального мыщелка бедренной кости и медиального мыщелка большеберцовой кости ( Рисунок 1B).
4. Открыть изображений программное обеспечение и инициализировать биолюминесценции в vivo изображений системы.
5. Позиция крыс в Супин позиции в Центральной сцене тепловизионные системы и закрыть дверь камеры.
6. Проверить " флуоресцентный " флажок и выберите флуоресцентный фильтр задает 640 Нм для возбуждения и 680 нм для выбросов ( рис. 2A).
7. Выберите поле зрения D. набор пикселей биннинга средний (8), F/Stop 2 и воздействия времени для авто. Поддержание оптимального время экспозиции, последовательно получить сопоставимые результаты через всего исследования ( рис. 2A).
8. Удаление животное от стадии и монитор для восстановления от анестезии.
   Примечание: Место животных на грелку покрыты 2-3 слоя полотенца.
9. Выбор единиц лучистого эффективности для измерения флуоресценции ( рис. 2B). Выберите регионы интереса (ROI) для анализа и количественной оценки флуоресцентные сигналы от каждого изображения ( рис. 2 c).
10. Повторить процедуру в vivo изображений для каждого крыса последовательно учиться haMSCs продольной удержания в совместном.
    Примечание: Мы предлагаем изображений животных ' флуоресцентные сигналы в естественных условиях тепловизионной системой каждые два дня в течение первой недели после инъекции и один раз каждую неделю до тех пор, пока сигнал не может быть обнаружен.

Результаты

Чтобы побудить KOA модель, мм была исполнена в правом коленном суставе SD крыс (рис. 3). Восемь недель после хирургической операции, крысы были принесены в жертву и последовательный разделы коленных суставов были оценены с обеих H & Е и Safranin O/Fast зеленой окр...

Обсуждение

Прежде чем мы можем принести регенеративной стволовых клеток лечение для Коа из скамейке в постели срочно необходимы стандарты безопасности и накопление исследования стволовых клеток. Однако среды патологических заболеваний играет важную роль в сохранение и накопление пересаженных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None