Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Resumo

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Resumo

Para oferecer suporte a aplicação clínica da terapia humana adiposo-derivados mesenquimais células-tronco (haMSC) para osteoartrite do joelho (KOA), examinamos a eficácia da persistência de célula e biodistribuição de haMSCs em modelos animais. Demonstrámos um método para rotular a membrana da célula de haMSCs com corante lipofílico fluorescente. Posteriormente, injeção intra-articular das pilhas etiquetadas em ratos com KOA cirurgicamente induzida dinamicamente foi monitorada por um na vivo sistema de imagem. Utilizamos o lipofílico carbocyanines fez (DilC₁₈ (5)), um análogo de Dil (dialkylcarbocyanines) far-red fluorescente, que utilizou um laser vermelho para evitar a excitação da autofluorescência verde natural dos tecidos circundantes. Além disso, os espectros de emissão avermelhado de permitiu a imagem do profundo-tecido de animais vivos e o processo de rotulagem não causaram nenhum efeitos citotóxicos ou dano funcional ao haMSCs. Esta abordagem tem demonstrada ser um método de controle eficiente para haMSCs em um modelo do rato KOA. A aplicação deste método também pode ser usada para determinar a rota ideal de administração e dosagem de MSCs provenientes de outras fontes em estudos pré-clínicos.

Introdução

Osteoartrose do joelho (KOA) é uma doença degenerativa resultante da perda de cartilagem articular e inflamação progressiva, que se tornou das principais doenças crônica em idosos ao redor do mundo¹. No entanto, terapias atuais usando anti-inflamatórios, suplementos de físicos e procedimentos cirúrgicos somente podem proporcionar alívio temporário para sintomáticos dor².

Adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) tornaram-se um remédio promissor regenerativo para osteoartrite do joelho, devido à sua diferenciação multipotent potencial para regeneração de cartilagem e imunomoduladores propriedades^{3, 4}. Comparado com rotas farmacológicas para investigar os mecanismos de ação na vivo, acompanhamento ao vivo haMSCs em modelos animais de pequeno KOA é atualmente instrutivo para estabelecer a fundamentação e a viabilidade da terapia haMSC antes da aplicação clínica. Para testes pré-clínicos, meniscectomia medial (MM) desestabiliza a carga mecânica da articulação para induzir KOA em ratos, que fornece um modelo relativamente viável com reprodutibilidade consistente⁵. O aparecimento de KOA induzida por MM é anterior à transecção do ligamento cruzado anterior, sozinha ou combinada com meniscectomia medial parcial⁶. Portanto, as longo prazo interações entre haMSCs injetado com o microambiente patológica de KOA frequentemente são avaliadas em ratos induzidos por MM^7,8.

Embora a eficácia terapêutica de haMSCs tem sido amplamente relatado, relevante o conhecimento sobre a persistência na vivo do haMSCs implantado através de injeção intra-articular de (IA) é escasso^9,10. Assim, vários métodos de rotulagem celulares foram desenvolvidos, incluindo immunohistology¹¹luciferase¹², transfecção de¹³ proteína verde fluorescente, óxido de ferro, rotulagem por ressonância magnética (MRI)¹⁴ e numerosas células fluorescentes corantes^8,15,16. Em comparação com análises de trabalho intensivo de histologia, na vivo não-invasivo imagem emprega dispositivos ópticos para detectar a distribuição em tempo real e a dinâmica das células rotuladas com sinais fluorescentes^10,17. Para a imagem latente funcional de células vivas, cytocompatible fluorescente rotulagem é uma técnica de rastreamento sofisticado radioativo livre para revelar atividades celulares após transplante de células-tronco¹⁸. Além disso, multicoloridos fluorescentes corantes lipofílicos possuem vantagens sobre amino-hidrofílicos corantes ou proteínas fluorescentes, incluindo sua permeabilidade celular melhorada e reforçada fluorescência quântica rendimentos¹⁹.

Assim, os protocolos incluídos aqui utilizam um vermelho laser para excitar as células rotuladas com carbocyanines lipofílicos fez (DilC₁₈(5)), que é um far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico²⁰. Os espectros avermelhado da excitação e emissão de evita a interferência de autofluorescent e permite que a imagem latente durante um longo período de tempo em animais vivos⁸tecidos profundos. Esse método de rastreamento de células na vivo rotulado com que é válido para monitoramento transplantadas células-tronco, tais como haMSCs, em modelos animais, que é essencial para compreender e melhorar a atual terapia regenerativa de células-tronco.

Protocolo

procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética e local institucional Animal conta com um esforço para minimizar o sofrimento dos animais. O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Shanghai Ninth pessoas ’ s Hospital afiliado para Shanghai JiaoTong University School of Medicine com o protocolo número [2017] 063.

1. estabelecimento de um modelo de osteoartrite do joelho de rato Surgically-Induced

1. para este procedimento cirúrgico, uso 8-12 semanas velhos ratos machos Sprague Dawley (SD) com peso entre 250 e 300 g.
2. Anestesiar os animais com 40 mg/kg de tiletamina e eficiente de 40 mg/kg através de injeção intramuscular.
3. Colocar o animal na posição de lateral esquerda num palco aquecida. Raspe o joelho direito completamente com uma navalha. Desinfetar a área cirúrgica com solução de iodo-providone de 10%, seguida por 70% de etanol, repita mais duas vezes e depois pintar com solução de providone-iodo 10% e cobrir a área não-cirúrgico com um bloco cirúrgico.
4. Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de 2 cm lateralmente ao longo do tendão patelar para expor o jointcapsules.
5. Usar um bisturi cirúrgico para transecto o ligamento colateral medial. Refletem o menisco em direção ao fêmur.
6. Gotejar solução de cloreto de sódio 0,9% estéril na superfície da cartilagem articular durante a operação para impedir a cartilagem desseque.
7. Pegar o menisco medial com fórceps e cortam o menisco em seu ponto mais estreito do acessório da tíbia com um bisturi ( figura 1A). Evitar ferir a cartilagem.
8. Fecha a cápsula da articulação com uma sutura absorvível 4-0.
9. Monitorar os ratos cirúrgicos até que recupere a consciência.
10. Injetar gentamicina 20 mg/kg para evitar a infecção e a buprenorfina de 0,05 mg/kg, através de uma rota intramuscular para aliviar a dor após a cirurgia.
11. Manter os ratos em instalações animais sob um ciclo de luz/escuro de 12 h por 3-8 semanas para início KOA temperatura controlada. Os animais continuam a receber medicação para a dor, incluindo mas não limitado a buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistirem os sintomas de dor.

2. Histologia do rato KOA modelo de avaliação

1. sacrificar os ratos com excessiva CO ₂ inalação (adicionar uma taxa de preenchimento de cerca de 30% do volume por minuto com dióxido de carbono para o ar existente na câmara câmara tornar a inconsciência animal dentro de 2-3 min. fluxo de CO2 manter por um período mínimo de 1 min após a respiração cessa.) no indicado pontos de tempo (representante os resultados são apresentados em 8 semanas de indução KOA, variando de 3 a 8 semanas) após a cirurgia...
2. dissecar a pele e os músculos em torno das articulações do joelho e cortar as articulações de joelho com um bisturi.
3. Corrigir as articulações de joelho em paraformaldeído 4% (PFA) por 3 dias à temperatura ambiente. Depois, descalcificar as amostras em 20% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cerca de 4 semanas a 4 ° C e alterar o EDTA a cada 3 dias.
   Atenção: Paraformaldehyde é tóxico, usar equipamento de protecção adequado (EPI), tais como luvas e óculos.
4. Desidratar as amostras usando um processador automático de tecidos. Definir o menu para iniciar um ciclo de descarga, da seguinte forma: 70% de etanol por 1h; Depois de 80% de etanol e 95% de etanol por 1h respectivamente; seguido por 2 ciclos de 100% de etanol por 1h; posteriormente, xileno duas vezes por 1h cada vez e parafina 3 vezes em 58 ° C, durante 1 h a cada vez.
   Atenção: Xileno é tóxico, então use EPI apropriado, como luvas e óculos.
   Nota: Opcionalmente, usar potes de Coplin para desidratação manual com a mesma afinação que o processador automático de tecidos.
5. Coloque a face medial da face comum intacta para baixo e incorporá-lo no bloco de parafina com tecido incorporado centro.
   Nota: Opcionalmente, usar fórceps para incorporar as amostras para o bloco de parafina manualmente.
6. Começar a cortar 5 µm sagital seções da margem medial da articulação para intervalos de 30 µm com 2 seções seriais por micrótomo rotativo.
7. Montar seções em lâminas de vidro e deparaffinize os slides em xilol. Entre as 2 seções seriais, manchar um slide com hematoxilina & eosina (H & E) coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0,5% eosina por 10 min. E manchar o outro slide com safranina O/Fast Green coloração: 0,1% hematoxilina por 15 min, 0,02% Fast Green por 3 min, 1% de solução de ácido acético por 10 s e 0.1% safranina O por 3 min.
   Cuidado: O xileno é tóxico, vestir os EPI adequado, tais como luvas, óculos.
8. Marcar as lâminas coradas utilizando o sistema de avaliação de histopatologia osteoartrite Research Society International (OARSI) em ratos ⁶.

3. Rotulagem de células-tronco mesenquimais humanas com o corante fluorescente fez

1. preparar fez célula-rotulagem solução em etanol 100% na concentração de 1 mM. Proteger a solução de criação de etiquetas de célula de luz e armazená-lo em temperatura ambiente por mais 6 meses.
2. Crescer haMSCs com procedimentos de cultura de pilha padrão em Dulbecco ' s modificado águia ' s suplementado (DMEM) com 1% penicilina e estreptomicina e 10% fetal soro de vitelo (FCS) em um prato de petri de 10 cm.
3. Desanexar haMSCs com tripsina 0,25% de 2 mL com confluência de prévia para cerca de 80% de EDTA 1 mM.
4. Neutralizar tripsina com 4 mL de meio de cultura e girar as células a 800 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
5. Suspender as células em uma densidade de 1 x 10 ⁶ células/mL em 5 mL de meio de cultura de soro livre.
6. Rotular as células pela adição de 50 µ l fez solução de criação de etiquetas de célula em meio de cultura 5 mL soro livre a 37 ° C, durante 50 min.
7. Girar as pilhas etiquetadas a 800 x g, durante 3 min.
8. Lavar as células duas mais vezes com 5 mL fosfato tampão soro fisiológico (PBS) a x 800 g por 3 min cada.
9. Olha o rotulado haMSCs usando um microscópio fluorescente com um conjunto de filtro de Cy5.
10. Contar as células com coloração azul trypan e obter 2,5 x 10 ⁶ células viáveis em 100 µ l PBS para injeção.

4. Na Vivo Fluorescente de Imaging para faixa haMSCs

1. oito semanas após a cirurgia (etapa 1), anestesiar os ratos KOA pela injeção intramuscular de 25 mg/kg de tiletamina e eficiente de 25 mg/kg.
2. Raspar o joelho direito cuidadosamente com uma lâmina de barbear para expor a área comum. Desinfetar a área conjunta com etanol a 70%.
3. Usando uma agulha de seringa 26g, injetar 2,5 x 10 ⁶ rotulado células suspendidas em 100 µ l PBS, no centro da área do triângulo formado pelo lado medial do ligamento patelar, o côndilo femoral medial e o côndilo medial da tíbia ( figura 1B).
4. Abrir o software de imagem e inicializar a bioluminescência na vivo, sistema de imagem.
5. Posição ratos em supino a posição na fase central do sistema de imagem e fechar a porta da câmara.
6. Verificar o " fluorescente " caixa de seleção e selecione filtro fluorescente conjuntos de 640 nm para a excitação e 680 nm para emissão ( Figura 2A).
7. Selecionar campo de visão de conjunto D. pixel binning para médio (8), F/Stop para exposição e 2 hora de auto. Manter o ideal tempo de exposição consistente para obter resultados comparáveis em todo o estudo inteiro ( Figura 2A).
8. Retire o animal do palco e monitor para a recuperação da anestesia.
   Nota: Animal lugar sobre uma almofada de aquecimento coberto com 2-3 camadas de toalha.
9. Escolher as unidades de eficiência radiante para a medição de fluorescência ( Figura 2B). Selecione as regiões de interesse (ROI) para análise e quantificar os sinais fluorescentes de cada imagem ( Figura 2).
10. Repita o procedimento da imagem latente na vivo para cada rato sequencialmente estudar haMSCs retenção longitudinal na articulação.
    Nota: Sugerimos que os animais de imagem ' sinais fluorescentes pelo sistema de imagens in vivo, uma vez a cada dois dias para a primeira semana após a injeção e uma vez por semana até que o sinal não pode ser detectado.

Resultados

A fim de induzir modelo KOA, MM realizou-se na articulação do joelho direito de ratos SD (Figura 3). Oito semanas após a cirurgia, ratos foram sacrificados e as seções série de articulações de joelho foram avaliadas com as duas H & E e safranina O/Fast Green coloração (Figura 4). Para H & E coloração, a superfície da cartilagem articular exibiu fronteiras mais ásperos nos joelhos cirurgia do que a articulaç...

Discussão

Normas de segurança e estudos de biodistribuição de terapia com células estaminais são urgentemente necessários antes de trazermos o tratamento de células-tronco regenerativa para KOA do banco ao lado do cama. No entanto, o ambiente patológico de doença desempenha um papel importante na persistência e biodistribuição de transplantado haMSCs¹⁰. Recentemente, nosso grupo demonstrou que injeção intra-articular de haMSCs mais persistentes em um ambiente de KOA patológico do que injeçõ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None