In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

Résumé

Ce protocole décrit un moyen efficace de contrôler la persistance de la cellule et la biodistribution des dérivés adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) par fluorescence rouge sombre étiquetage dans un modèle de l’arthrose (KOA) de genou de rat par injection intra-articulaire de (IA).

Résumé

Afin de soutenir l’application clinique de thérapie dérivée adipeux mésenchymateuses cellules souches humaines (haMSC) pour l’arthrose du genou (KOA), nous avons examiné l’efficacité de la persistance de cellules et de biodistribution des haMSCs dans des modèles animaux. Nous avons démontré une méthode pour étiqueter la membrane cellulaire de haMSCs avec un colorant fluorescent lipophile. Par la suite, une injection intra-articulaire des cellules marquées chez les rats avec KOA induite chirurgicalement surveillait dynamiquement par un in vivo système d’imagerie. Nous avons utilisé les lipophiles carbocyanines (DilC₁₈ (5)), un analogue de Dil (dialkylcarbocyanines) fluorescent rouge sombre, qui utilise un laser rouge pour éviter l’excitation de l’autofluorescence verte naturelle des tissus environnants. Par ailleurs, les spectres d’émission décalée vers le rouge d’autorisé imagerie profonde des tissus animaux vivants et la procédure d’étiquetage ne causé aucun effets cytotoxiques ou des dommages fonctionnel à haMSCs. Cette approche s’est avérée être une méthode de suivi efficace pour haMSCs dans un modèle de rat KOA. L’application de cette méthode pourrait également être utilisée pour déterminer l’itinéraire optimal d’administration et la posologie de MSCs provenant d’autres sources dans des études précliniques.

Introduction

L’arthrose du genou (KOA) est une affection dégénérative résultant de la perte du cartilage articulaire et de l’inflammation progressive, qui est devenu une maladie chronique importante chez les personnes âgées autour du monde¹. Toutefois, les traitements actuels à l’aide d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, les suppléments physiques et interventions chirurgicales ne peuvent fournir un soulagement temporaire pour douleur symptomatique².

Dérivé d’adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) sont devenus un remède prometteur régénératrice pour l’arthrose du genou, en raison de leur potentiel de régénération du cartilage et de propriétés immunomodulatrices^{3, la différenciation multipotente 4}. Par rapport aux routes pharmacologiques pour étudier les mécanismes d’action, en vivo, suivi haMSCs vivants dans des modèles animaux de petit KOA est actuellement instructif d’établir la raison d’être et de la faisabilité du traitement haMSC avant l’application clinique. Pour les essais précliniques, méniscectomie interne (MM) déstabilise la charge mécanique de l’articulation pour induire KOA chez les rats, qui fournit un modèle relativement faisable avec reproductibilité conforme⁵. L’apparition de KOA induite par MM est antérieure à la résection du ligament seule ou combinée avec une méniscectomie interne partielle⁶. Par conséquent, les interactions à long terme entre haMSCs injecté avec le microenvironnement pathologique de KOA sont souvent évaluées chez les rats induits par MM^7,8.

Bien que l’efficacité thérapeutique de haMSCs a été largement rapportés, les connaissances sur la persistance en vivo de haMSCs implantés par injection intra-articulaire de (IA) est rare^9,10. Par conséquent, différentes méthodes de marquage cellulaires ont été développés, y compris l’immunohistologie¹¹,¹²de la luciférase, transfection¹³ protéine fluorescente verte, oxyde de fer d’étiquetage pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM)¹⁴ et de nombreuses cellules fluorescentes colorants^8,15,16. Par rapport aux analyses histologiques à forte main-d'oeuvre, in vivo imagerie non invasive emploie des dispositifs optiques pour détecter la distribution en temps réel et la dynamique de cellules marquées avec signaux fluorescents^10,17. Pour l’imagerie de cellules vivantes fonctionnelle, cytocompatible marquage fluorescent est une technique de suivi sophistiqué radioactifs exempt de révéler des activités cellulaires après transplantation de cellules souches¹⁸. En outre, multicolores fluorochromes lipophiles possèdent des avantages par rapport aux colorants hydrophiles amino-réactifs ou des protéines fluorescentes, y compris leur perméabilité cellulaire améliorée et la fluorescence accrue de rendements quantiques¹⁹.

Ainsi, les protocoles inclus ici utilisent un rouge laser pour exciter des cellules marquées avec carbocyanines lipophiles a fait (DilC₁₈(5)), qui est un rouge sombre fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analogique²⁰. Les spectres d’excitation et d’émission décalée vers le rouge des évite les interférences auto-fluorescente et permet aux tissus profonds d’imagerie sur une longue période de temps dans les animaux vivants⁸. Cette méthode de suivi des cellules en vivo étiqueté avec est valide pour la surveillance des cellules souches transplantées, tels que haMSCs, dans des modèles animaux, qui est essentiel pour comprendre et améliorer l’actuel thérapie régénératrice des cellules souches.

Protocole

procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique et de locaux institutionnels animalier avec un effort pour minimiser les souffrances animales. Le protocole suivant a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Shanghai neuvième personnes ’ s hôpital affilié à Shanghai JiaoTong University School of Medicine avec le protocole numéro [2017] 063.

1. mise en place d’un modèle de l’arthrose du genou Surgically-Induced Rat

1. pour cette intervention chirurgicale, utilisation 8-12 semaines vieux rats Sprague Dawley (SD) mâles pesant entre 250 et 300 g.
2. Anesthésier les animaux avec 40 mg/kg tiletamine et zolazepam 40 mg/kg par injection intramusculaire.
3. Placer l’animal dans une position latérale gauche sur une platine chauffante. Raser complètement le genou droit avec un rasoir. Désinfecter la zone chirurgicale avec solution 10 % providone-iode, suivie de l’éthanol à 70 %, répéter deux fois et puis peindre avec une solution providone-iode 10 % et couvre la zone non chirurgical avec un tampon chirurgical.
4. à l’aide d’un bistouri, pratiquer une incision de 2 cm latéralement le long du tendon rotulien pour exposer le jointcapsules.
5. Utiliser un bistouri pour le ligament collatéral médial du transect. Reflètent le ménisque vers le fémur.
6. Goutte de solution de chlorure de sodium 0,9 % stérile sur la surface du cartilage articulaire pendant l’opération afin d’éviter le cartilage ne se dessèchent pas.
7. Prenez le ménisque interne avec une pince et couper à travers le ménisque au niveau du col de la fixation tibiale avec un scalpel ( Figure 1 a). Ne pas blesser le cartilage.
8. Fermer la capsule articulaire avec une suture résorbable 4-0.
9. Suivre les rats chirurgicales jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience.
10. Injecter 20 mg/kg de gentamicine pour prévenir l’infection et la buprénorphine de 0,05 mg/kg par voie intramusculaire pour soulager la douleur après la chirurgie.
11. Maintenir le rat dans une animalerie température contrôlée suivant un cycle de lumière/obscurité de 12 h pendant 3 à 8 semaines et l’apparition KOA. Animaux continue de recevoir des médicaments contre la douleur, y compris mais non limité à la buprénorphine (0,05 mg/kg, i.m.) et de la gentamicine (20 mg/kg, i.m.), si les symptômes persistent.

2. Histologie du Rat KOA modèle d’évaluation des

1. sacrifier les rats avec l’inhalation excessive de ₂ CO (ajouter un taux de remplissage d’environ 30 % du volume par minute avec le dioxyde de carbone de l’air existant dans la chambre de chambre pour faire l’inconscience animale dans 2-3 min. débit de CO2 de maintenir pendant un minimum de 1 min après la respiration cesse.) à indiqué points dans le temps (représentant résultats figurent à 8 semaines d’induction de KOA allant de 3 à 8 semaines) après la chirurgie.
2. disséquer la peau et des muscles autour des articulations du genou et coupée de l’articulation du genou avec un scalpel.
3. Fixer les articulations de genou à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pour 3 jours à température ambiante. Par la suite, détartre les échantillons à 20 % d’acide tétraacétique (EDTA) pendant environ 4 semaines à 4 ° C et changer tous les 3 jours de l’EDTA.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique, usure approprié équipement de protection individuelle (EPI), comme des gants et des lunettes.
4. Déshydrater les échantillons à l’aide d’un processeur de tissu automatique. Définissez le menu pour lancer un cycle de chasse comme suit : l’éthanol à 70 % pendant 1 h ; puis l’éthanol à 80 % et 95 % d’éthanol pendant 1 h respectivement ; suivie de 2 cycles d’éthanol à 100 % pendant 1 h ; par la suite, xylène deux fois pendant 1 h chaque fois et chaque fois de paraffine 3 fois à 58 ° C pendant 1 h.
   ATTENTION : Xylène est toxique, donc porter les EPI approprié, tels que des gants et des lunettes.
   Remarque : Utilisez Coplin Jars pour déshydratation manuelle avec la même mise en place du traitement des tissus automatique.
5. Poser la face médiale de la face commune intacte et incorporez-le dans le bloc de paraffine avec mouchoir incorporé dans le centre de.
   Remarque : Utilisez pince pour incorporer les échantillons dans le bloc de paraffine manuellement.
6. Commence à diminuer de 5 µm coupes sagittales de la marge médiale de l’articulation des intervalles de 30 µm avec 2 coupes sériées par microtome à.
7. Monter sections sur lames de verre et Déparaffiner les diapositives dans le xylène. Entre les 2 coupes sériées, détachant une diapositive avec l’hématoxyline & éosine (H & E) coloration : 0,1 % hématoxyline pendant 15 min, 1 % Solution pour 10 s et 0,5 % d’acide acétique éosine pendant 10 min. Et tacher les autres diapositives avec coloration de safranine O/Fast Green : 0,1 % hématoxyline pendant 15 min, 0,02 % Fast Green pendant 3 min, 1 % Solution d’acide acétique pour 10 s et 0,1 % safranine O pendant 3 min.
   ATTENTION : Xylène est toxique, porter les EPI approprié, tels que des gants, lunettes.
8. Score les teinté de diapositives à Osteoarthritis Research Society International (OARSI) Histopathologie du système d’évaluation rats ⁶.

3. Étiquetage des humain cellules souches mésenchymateuses avec le colorant Fluorescent n’a

1. préparer n’a pas de solution de marquage cellulaire dans l’éthanol à 100 % à une concentration de 1 mM. Protéger la solution de marquage cellulaire de la lumière et conserver à température ambiante pendant 6 mois.
2. Grow haMSCs avec les méthodes de culture cellulaire standard en Dulbecco ' s modified Eagle ' s de moyenne (DMEM) additionné de 1 % la pénicilline et de streptomycine et de 10 % sérum de veau foetal (FCS) dans un plat de Pétri de 10 cm.
3. Détacher haMSCs avec de la trypsine 0,25 % 2 mL avec confluence de préalable à environ 80 % EDTA 1 mM.
4. Neutraliser la trypsine avec 4 mL de milieu de culture et de faire tourner les cellules à 800 g pendant 3 min à température ambiante.
5. Suspendre les cellules à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules/mL dans le milieu de culture sans sérum 5 mL.
6. Label les cellules en ajoutant 50 µL a solution de marquage cellulaire dans le milieu de culture sans sérum de 5 mL à 37 ° C pendant 50 min.
7. Faire tourner les cellules marquées à 800 g pendant 3 min.
8. Laver les cellules deux fois avec 5 mL phosphate tampon salin (PBS) à 800 g pendant 3 min chaque.
9. Vérifier la haMSCs marquée à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un jeu de filtres Cy5.
10. Compter les cellules avec une coloration bleu trypan et obtenir 2,5 x 10 ⁶ cellules viables dans 100 µL de PBS pour injection.

4. In Vivo Fluorescent d’imagerie à la piste haMSCs

1. huit semaines après la chirurgie (étape 1), anesthésier les rats KOA par injection intramusculaire de tiletamine 25 mg/kg et de 25 mg/kg zolazepam.
2. Raser complètement le genou droit avec un rasoir pour exposer la zone mixte. Désinfecter la zone du joint avec l’éthanol à 70 %.
3. à l’aide d’une aiguille de seringue 26 G, injecter 2,5 x 10 ⁶ marqués de cellules en suspension dans 100 µL PBS au centre de l’aire du triangle formé par la partie médiane du ligament rotulien, le condyle fémoral et le condyle tibial médial ( figure 1 b).
4. Ouvrez le logiciel d’imagerie et d’initialiser la bioluminescence in vivo, système d’imagerie.
5. Position rats dans le supin position dans la scène centrale du système d’imagerie et fermer la porte de la chambre de.
6. Vérifier la " fluorescent " case et sélectionnez filtre fluorescent ensembles de 640 nm pour l’excitation et 680 nm pour l’émission ( Figure 2 a).
7. Select de champ à la valeur de D. pixel binning au milieu (8), F/Stop pour l’exposition et 2 fois pour auto. Maintenir l’optimal temps d’exposition cohérente afin d’obtenir des résultats comparables dans l’ensemble de l’étude ( Figure 2 a).
8. Retirer l’animal de la scène et le moniteur pour la récupération de l’anesthésie.
   NOTE : Place animal sur un coussin chauffant recouvert de 2 ou 3 couches de tissu éponge.
9. Choisir les unités d’efficacité radiante pour la mesure de la fluorescence ( Figure 2 b). Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) pour analyse et quantifier des signaux fluorescents de chaque image ( Figure 2).
10. Répéter la procédure de l’imagerie in vivo pour chaque rat séquentiellement étudier haMSCs rétention longitudinal dans le joint.
    NOTE : Nous vous suggérons d’imagerie des animaux ' signaux fluorescents par un appareil d’imagerie in vivo une fois tous les deux jours pendant la première semaine après l’injection et une fois par semaine jusqu'à ce que le signal ne peut pas être détecté.

Résultats

Afin d’inciter le modèle KOA, MM a été réalisée dans l’articulation du genou droit de rats SD (Figure 3). Huit semaines après la chirurgie, des rats ont été sacrifiés et les coupes sériées de l’articulation du genou ont été évalués avec les deux H & E et safranine O/Fast Green coloration (Figure 4). H & E coloration, la surface du cartilage articulaire présentait des frontières plus rude dans les ge...

Discussion

Normes de sécurité et les études de biodistribution de thérapie de cellules souches sont urgent avant que nous pouvons apporter le traitement régénérateur des cellules souches pour KOA à l’audience au chevet du malade. Cependant, l’environnement pathologique de la maladie joue un rôle important dans la persistance et la biodistribution des transplantés haMSCs¹⁰. Récemment, notre groupe a démontré que les injections intra-articulaires de haMSCs a persisté plus dans un environnemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrx VMR animal anesthesia system	Midmark	VIP3000
4-0 suture	Shanghai Jinhuan	KC439
Razor	Pritech	LD-9987
Gentamicin	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	None
0.9% Sodium chloride solution	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicillin	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	None
Buprenorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	None
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranin O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center	Thermo Fisher	B64100010
Fully Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm Petri Dish	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescent microscope	Olympus	BX53
0.4% Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	None