Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de la esterilización con gas cloro y el cloro en la germinación de la semilla de un genotipos gama de Arabidopsis crecen en medios estériles. Se han desarrollado protocolos de esterilización optimizado para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos mientras que proporciona la supervivencia satisfactoria de la semilla.

Resumen

Thaliana de Arabidopsis Plantas (Arabidopsis) a menudo deben ser cultivadas en medios estériles. Esto requiere esterilización previa de la semilla para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos presentes en la superficie de la semilla. Actualmente, las semillas de Arabidopsis se esterilizan utilizando dos técnicas diferentes de esterilización en condiciones que difieren ligeramente entre laboratorios y no han sido estandarizadas, a menudo resulta en la esterilización sólo parcialmente eficaz o en la mortalidad excesiva de semilla. También la mayoría de estos métodos no son fácilmente escalable a un gran número de líneas de semillas de genotipos diversos. Como tecnologías para el análisis de alto rendimiento de Arabidopsis siguen proliferando, técnicas estandarizadas para esterilizar grandes cantidades de semillas de genotipos diferentes se convierten en esenciales para llevar a cabo estos tipos de experimentos. Se evaluó la respuesta de un número de líneas de Arabidopsis a dos técnicas diferentes de esterilización basado en tasa de germinación de la semilla y el nivel de contaminación de la semilla con microbios y otros patógenos. Los tratamientos incluyeron concentraciones de esterilización agentes y tiempos de exposición, para determinar las condiciones óptimas para la esterilización de las semillas de Arabidopsis. Se han desarrollado protocolos optimizados para dos métodos de esterilización diferentes: bleach (fase líquida) y cloro (Cl₂) gas (fase vapor), tanto dando como resultado tasas de germinación de semillas alta y mínima contaminación microbiana. La utilidad de estos protocolos se ilustra a través de la prueba de tipo salvaje y mutantes semillas con una gama de potenciales de germinación. Nuestros resultados muestran que las semillas efectivamente esterilizable mediante cualquier método sin la mortalidad excesiva de semilla, aunque se observaron efectos perjudiciales de la esterilización de las semillas con menor potencial de germinación óptima. Además, se desarrolló una ecuación para ayudar a los investigadores aplicar las condiciones de esterilización estándar de cloro gas en envases herméticamente cerrados de diferentes tamaños. Los protocolos descritos aquí permiten la esterilización de semillas fácil, eficiente y económico para un gran número de líneas de Arabidopsis.

Introducción

Thaliana de Arabidopsis (Arabidopsis) es un organismo modelo principal para investigación básica y aplicada en planta biología^1,2,3. Mientras que condiciones estándar para el crecimiento de Arabidopsis se han establecido⁴, el efecto de la esterilización de las semillas en la viabilidad de la semilla no ha sido rigurosamente probado. Medio sólido en placas o cajas se utiliza habitualmente para facilitar el crecimiento de plántulas de Arabidopsis para muchas aplicaciones experimentales, tales como identificación de homocigotos mutantes letales en una población segregante, observación de fenotipos de brote y raíz a principios etapas, aislamiento de tejido libre de patógeno, colección de grandes cantidades de tejido de la planta de semillero, selección de transformantes o plantas resistentes a los medicamentos y la evaluación de germinación^1,2,3,4 . Las semillas cosechan de plantas cultivadas en un invernadero o cámara de crecimiento de vez en cuando están contaminados con microorganismos y polvo. Crecimiento de plántulas de Arabidopsis en diferentes tipos de medios estériles requiere esterilización previa de las semillas para eliminar contaminantes microbianos, tales como hongos y bacterias presentes en la superficie de la semilla. El uso de un régimen de esterilización efectiva semilla es esencial para un equilibrio de alta germinación, mínima contaminación y crecimiento vigoroso de las plantas.

Los dos métodos más comunes utilizados para la esterilización de las semillas de Arabidopsis se basan en lejía comercial (fase líquida) y cloro gaseoso (fase vapor). Varios procedimientos han sido empleados para ambos fase líquida esterilización^{1,4,5,6,7,8,9 , 10} y en la fase vapor de esterilización de Arabidopsis semillas^{8,10,11,12,13,14,15 ,16}. Sin embargo, aunque estos procedimientos han sido eficaces para lograr la esterilización de las semillas de los genotipos utilizados, un análisis detallado del efecto de los tratamientos de esterilización diferentes sobre las semillas de diferentes genotipos no se ha divulgado. Por lo tanto, la optimización de estos procedimientos de esterilización es necesaria para definir las condiciones en que esterilización eficiente combinada con alta germinación.

La Arabidopsis biológica recursos centro (EE) es una posición única para a) prueba de viabilidad de la semilla de una variedad de diferentes genotipos en la colección y b) tomar ventaja de los procedimientos de control de calidad aplicado internamente y en respuesta a comentarios de los usuarios sobre la germinación de la semilla. Los objetivos de los experimentos aquí presentados fueron determinar los efectos de diferentes métodos de esterilización en la germinación de las semillas de los genotipos de una gama de Arabidopsis. Procedimientos de esterilización optimizado que resultan en tasas de germinación de semilla alta manteniendo la contaminación mínima del patógeno se presentan para la esterilización con gas cloro y el cloro.

Protocolo

1. preparación de 1 x medio de Murashige y Skoog (MS)

1. añadir 4.31 g de MS basal mezcla sal, sacarosa 10 g y 0,5 g de 2-(N-Morpholino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (MES) a un vaso de precipitados que contiene 0,8 L de agua destilada y agitar para disolver. Comprobar y ajustar el pH a 5.7 utilizando 1 M hidróxido de potasio (KOH). Añadir agua destilada para hacer 1 L.
2. Dividir los medios de comunicación en dos botellas de 1 L, 500 mL. Añadir 5 g de agar a cada botella. Mantenga la tapa suelta.
3. Autoclave durante 20 min a 121 ° C, 15 psi con una barra de agitación magnética en la botella.
4. Después de autoclavar, coloque las botellas en una placa de agitación a baja velocidad y el medio MS a enfriar a 45-50 ° C (hasta que la botella puede ser sostenida con las manos desnudas).
5. a partir de este paso, realice todos los pasos en condiciones estériles en campana de flujo laminar. Añadir 500 μl Gamborg ' s solución de vitamina a cada botella y agitar el medio MS para distribuir uniformemente la solución de vitamina.
6. Vierta suficiente medios en placas para cubrir aproximadamente la mitad de la profundidad de la placa de.
7. Permitir que las placas se enfríe a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora permitir que el agar solidifique.
   Nota: Si las placas no deben ser utilizadas inmediatamente, envuelva en plástico y guardar a 4 ° C (temperatura de heladera). Las placas de cubierta, cajas o tubos con agar solidificado pueden almacenarse durante varias semanas a 4 ° C en un recipiente hermético.

2. Esterilización de las semillas de Arabidopsis con Bleach

1. preparar el MS placas conforme al artículo 1 del protocolo. 100 mL de agua destilada en el mismo tiempo que la Media MS del autoclave. Utilizar esto más adelante como agua de enjuague y a suspender las semillas para ayudar en la galjanoplastia de.
   Nota: Si lo desea, mezcla de agar 0.8% (w/v) (p. ej. phytagar) también puede ser esterilizado en este paso. La mezcla de agar puede sustituirse por agua destilada durante galjanoplastia (paso 2.5.3.). La viscosidad adicional de la mezcla de agar facilita semillas del espacio en la placa o la planta en filas si es necesario.
2. Prepare 50% (v/v) lejía solución a ser utilizado para esterilizar las semillas. Para diluir el cloro, añadir 100 mL de cloro en 100 mL de agua destilada. Añadir 50 μl de Tween 20 detergente para la solución de lejía.
   Nota: La solución de blanqueador preparada puede almacenarse por hasta un mes como sólo se abre en condiciones estériles.
3. Alícuota 100 semillas en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
4. Esterilizar las semillas con una solución de lejía de 50%.
   1. En una campana de flujo laminar, Añadir 500 μl de la solución de lejía de 50% en el tubo de microcentrífuga que contienen las semillas. Toque en la parte inferior del tubo para suspender las semillas en la solución de lejía.
      Nota: Como alternativa, un rotor o agitador de plataforma puede usarse para mantener las semillas suspendidas.
5. Enjuagar la solución de blanqueador del tubo de.
   1. Después de 10 minutos, retire la solución de lejía con una pipeta o un aspirador equipado con una punta de la pipeta en el extremo del tubo de microcentrífuga.
   2. Añadir 500 μl de agua destilada estéril en el tubo. Cierre el tubo e invertir para mezclar. Permiten las semillas para instalarse en la parte inferior del tubo. Una vez que las semillas se han asentado en la parte inferior del tubo cuidadosamente retire la solución de blanqueador por pipeteo. Repita este lavado proceso 6 veces.
   3. Añada 1 mL de agua destilada esterilizada al tubo para suspender las semillas.
6. Placa las semillas estériles en las placas de EM.
   1. En una campana de flujo laminar, etiqueta de la parte inferior de la placa MS con el nombre del stock y la fecha actual.
   2. Verter las semillas por el tubo de microcentrífuga en la placa MS. Extender las semillas alrededor de la placa MS utilizando un asa de inoculación estéril, desechable o una punta de pipeta estériles.
      Nota: Si las semillas son sembradas en hileras, puede utilizarse una pipeta con una punta de 200 μL individualmente colocar las semillas en las posiciones deseadas. Para mejorar el flujo de semillas, el extremo de la punta de la pipeta puede recortarse por 3-5 mm con unas tijeras. Cualquier semillas fuera de lugar o racimos de semillas entonces puede cambiarse o separados utilizando un asa de inoculación estéril de un solo uso.
   3. Coloque la placa de MS en la parte posterior de la de la campana de flujo laminar con la tapa medio cerrados. Permitir que el exceso de agua se evapore de la placa MS.
   4. Coloque la tapa sobre la placa MS. Sello de la placa MS envolviendo la placa con el papel microporoso quirúrgica de la cinta (véase la Tabla de materiales).

3. Esterilización de las semillas de Arabidopsis con Gas de cloro

1. preparar el MS placas conforme al artículo 1 del protocolo. Autoclave 100 mL de agua destilada en el mismo tiempo que la Media MS; Esto se utilizará más adelante para ayudar a suspender las semillas para ayudar en la galjanoplastia de.
   Nota: Si lo desea, mezcla de agar 0.8% (w/v) (p. ej. phytagar) también puede ser esterilizado en este paso. La mezcla de agar puede sustituirse por agua destilada durante galjanoplastia (paso 3.6.2.). La viscosidad adicional de la mezcla de agar facilita semillas del espacio en la placa o la planta en filas si es necesario.
2. Antes de comenzar la esterilización, calcular las cantidades de cloro y ácido clorhídrico (HCl) necesarias para producir cloro gas.
   1. Calcular la cantidad de HCl necesaria para producir el 6,1% Cl ₂ requerido para la esterilización de.
   2. Utiliza la siguiente fórmula:
      
      con 7.000 mL el volumen del recipiente de esterilización y 6.1% Cl ₂; el volumen de ácido clorhídrico se calcula en 3 mL.
      Nota: Una hoja de cálculo programada para llevar a cabo el cálculo para diferentes volúmenes de contenedor y % Cl ₂ se ofrece como suplemento tabla 1.
3. Alícuota 100 semillas en el tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL. Cerrar las tapas de cada frasco, coloque los frascos en un bastidor de plástico y dejar de lado.
   Nota: Semillas pueden almacenarse por un período prolongado de tiempo en este momento mientras se almacenan en condiciones adecuadas. Condiciones de almacenamiento pueden encontrarse en el punto 3.3.2 del Protocolo por Rivero y sus colegas ⁴. también se puede utilizar el formato de la placa de 96 pozos.
4. Preparar los materiales necesarios para llevar a cabo la esterilización con gas cloro.
   1. Obtener cloro y ácido clorhídrico de sus ubicaciones de almacenamiento de información.
   2. Corte una tira de parafina grande de la película (véase la Tabla de materiales) a utilizar en el paso 3.5.3. para sellar el recipiente de esterilización de.
   3. Colocar el envase de plástico con tapa en la cual la esterilización llevará a cabo dentro de una campana de humos. Abrir las tapas de todos los frascos de las semillas y coloque la rejilla de la semilla entera dentro del envase plástico.
5. Realizar la esterilización con gas cloro a temperatura ambiente.
   Atención: Trabajar con lejía y ácido por separado. No deje cualquier frasco destapado para reducir el riesgo de derrames. Utilice equipo de protección personal (EPP) incluyendo guantes y una bata de laboratorio. Si la lejía o ácido salpica en guantes, cambiar guantes antes de manipular otros materiales. Retire siempre guantes en la campana de humos en caso de contaminación de lejía o ácido.
   1. Coloque un vaso de precipitados de 250 mL en el contenedor y agregar 100 mL de lejía.
      Nota: La reacción entre el HCl y el cloro requiere por lo menos 22 volúmenes de exceso de blanqueador. La reacción se consume el ácido clorhídrico y bleach por liberación de gas de ₂ Cl con cloruro de sodio (NaCl) y agua como subproductos. Usando un exceso de cloro permite el consumo de d adicional de ácido clorhídricourante el período de ventilación, que disminuye la cantidad de bicarbonato de sodio (NaHCO ₃) necesarios para neutralizar la solución para la eliminación de.
      PRECAUCIÓN: El vaso debe ser al menos dos veces el volumen líquido total de bleach + HCl. Esto evitará salpicaduras de escapar el vaso durante el siguiente paso, que pueden dañar las semillas, blanqueador de ropa o quemar la piel expuesta.
   2. Añadir 3 mL de ácido clorhídrico en el vaso que contiene la lejía.
      PRECAUCIÓN: La reacción inicial produce burbujas, especialmente en las concentraciones de gas superiores a 6,1%. Una bata de laboratorio manga larga es necesario para este paso.
   3. Cerrar el recipiente de esterilización y sellado con la película de parafina inmediatamente.
   4. Controlar el recipiente de esterilización durante el tiempo de esterilización para asegurar la acumulación de gas, la acumulación de gas de cloro debe verse como una débil neblina amarilla dentro del contenedor.
      PRECAUCIÓN: Compruebe periódicamente el recipiente de esterilización para asegurar que la presión interior ha desbancó la tapa o película de parafina. Si la tapa ha sido destituida o la película de parafina se ha aflojado, cierre la tapa y envolver con cuidado el recipiente con una capa adicional de la película de parafina.
   5. Después de la 1 h-esterilización, abre el recipiente retirando la película de parafina y abrir la tapa en una esquina. Deje el recipiente ventilar durante 3 horas completar la reacción y eliminar el gas de cloro.
   6. Cerrar las tapas de los todos los tubos microcentrífuga en la canasta de semillas.
      Nota: Esterilizar las semillas pueden almacenarse hasta el momento de como se almacenan en condiciones secas de la galjanoplastia.
   7. Retire la rejilla de la semilla y colocarla en una campana de flujo laminar.
   8. Neutralizar la reacción del gas cloro
      1. añadir 1,5 g NaHCO ₃ polvo lentamente en el vaso que contiene la solución de lejía/HCl y agitar con una varilla de vidrio para disolver el NaHCO ₃ en solución. Continuar agregando NaHCO ₃ hasta que las burbujas de gas de dióxido de carbono (CO ₂) han dejado de forma.
         Atención: Añadir lentamente para evitar salpicaduras. Utilizar adecuado EPP incluyendo guantes y una bata de laboratorio.
      2. Prueba el pH de la solución utilizando las tiras de pH o un medidor de pH. Añadir más NaHCO ₃ si es necesario hasta que el pH de la solución es neutra (pH 7.0). En este punto la solución se puede quitar de la campana y elimine de acuerdo con todas las pautas de eliminación aplicable.
         PRECAUCIÓN: Si se nota cualquier olor durante la disposición, entonces la solución inmediatamente devuelva a la campana extractora.
6. Placa las semillas estériles en las placas de EM.
   1. En una campana de flujo laminar, etiqueta de la parte inferior de la placa MS con el nombre del stock y la fecha actual.
   2. Añadir 500 μl de agua destilada estéril a cada tubo de microcentrífuga para suspender las semillas. Verter las semillas en el plato MS y repartir las semillas uniformemente alrededor de la placa con un asa de inoculación estéril, desechable o una punta de pipeta estériles.
   3. Coloque la placa de MS en la parte posterior de la de la campana de flujo laminar con la tapa medio cerrados. Permitir que el exceso de agua se evapore de la placa MS.
   4. Coloque la tapa sobre la placa MS. Sellar la placa MS envolviendo la placa con cinta quirúrgica de papel microporoso.

4. Crecimiento de Arabidopsis en placas de MS

1. Coloque las placas con la tapa en la parte superior por tres días a 4 ° c y humedad ambiente.
   Nota: Este proceso se denomina estratificación y sirve para sincronizar la germinación de las semillas individuales.
2. Las placas de transferencia al medio de crecimiento.
   1. Mantenga la temperatura a 23 ° C y la intensidad de la luz a 120-150 μmol/m ² s con 16 h luz / 8 h oscuro fotoperiodo. Coloque placas plana en el ambiente de crecer con la tapa en la parte superior de modo que las raíces crecen en el medio.
3. Dejar crecen las plántulas en las placas de 8 días.
   Nota: Un período de 8 días de crecimiento permite tarde germinen semillas a germinar. Las placas pueden anotó antes de 8 días si todas las semillas han germinado.
4. Anotar las tasas de germinación.
   1. Registro el número de semillas que han germinado y que no han germinado. Calcular la tasa de germinación dividiendo el número de semillas que germinó por el número total de semillas en la placa de.
      Nota: La germinación se cuenta cuando la radícula ha proyectado fuera de la capa de semilla y los dos cotiledones son accesibles de forma.
   2. También contar el número de semillas afectadas por molde para determinar la efectividad de las condiciones de esterilización.

Resultados

Semillas de Arabidopsis de una cámara de crecimiento, invernadero o campo abierta a veces están contaminadas por diversos microorganismos como bacterias y hongos^1,4. Así, germinando las semillas en medios estériles puede ser especialmente difícil debido a la contaminación de las placas, especialmente cuando el suministro de semillas es limitado. El protocolo optimizado para esterilización con gas cloro y el cloro, cuyos resultados se presentan a continuación, minimiza este problema y preserva la viabilidad de las semillas necesarias para aplicaciones de alto rendimiento.

Efectos de la esterilización de la lejía en la germinación de semillas de Arabidopsis Col-0

Bleach es el agente más comúnmente utilizado para la esterilización de las semillas de numerosas especies de plantas. La concentración óptima del agente de la esterilización y el tiempo de exposición varía entre especies. Se han empleado un número de protocolos utilizando lejía para la esterilización de las semillas de Arabidopsis^{1,4,5,6,7,8,9 , 10}. cuatro diferentes concentraciones de cloro con el tiempo de exposición diferentes cinco períodos fueron probados y los resultados se presentan en figura 1. Los tratamientos se aplicaron a semillas de Columbia tipo salvaje (Col-0). El efecto de la concentración de cloro en la germinación de semillas de Col-0 varió según el tiempo de esterilización según lo demostrado por una interacción significativa entre la concentración de cloro y tiempo de esterilización (figura 1, P < 0.001, ANOVA-análisis de la varianza).

En los experimentos con tiempos de esterilización entre 5 y 10 min, tratamientos con todas las concentraciones de cloro provocaron igualmente alta germinación de semillas de Col-0 (figura 1). Tasas de germinación alta también fueron observadas para las concentraciones de cloro de 40% y 50% para todos los tiempos de esterilización. Tratamientos con lejía de 80% y 100% para periodos de más de 10 minutos resultaron en una significativa disminución de la tasa de germinación en comparación con los tiempos más cortos de remojo (P < 0.01, ANOVA). Además, para 80% y 100% bleach tratamientos por 20 min, germinación fue significativamente disminuida en comparación con los correspondiente 40% y 50% blanqueador tratamientos (P < 0,001, ANOVA).

Semillas muestran diversos niveles de blanqueamiento y arrugamiento al usar blanqueador de alta concentración durante 15 minutos o más. Además de relativamente alta (hasta un 32%) la mortalidad de semilla, las semillas germinadas esterilizadas en estas condiciones a menudo demostradas defectos de crecimiento, reflejados en una falta de cotiledones los hypocotyls para desplegar y alargado, dando por resultado la detención del desarrollo. Mayoría de los tratamientos (14 de 20) fueron completamente libres de molde, resultando en general molde nivel promedio de 0.21% ± 0.003 (tabla 1).

Un tratamiento con lejía 50% y un tiempo de remojo de 10 minutos fue seleccionado como el mejor régimen de esterilización porque combinó el porcentaje de germinación alto con buena inhibición del crecimiento de la superficie del patógeno. Este tratamiento fue seleccionado para probar el efecto de la esterilización de bleach en diferentes líneas mutantes como se describe a continuación.

Efectos de la esterilización con gas cloro en la germinación de semillas de Col-0

Para optimizar las condiciones de esterilización de gas cloro, tres diferentes concentraciones de cloro gas se utilizan para esterilizar semillas de Col-0 para dos periodos de tiempo (tabla 2). La concentración de gas se calculó con base en el volumen de HCl concentrado y el volumen del recipiente de esterilización mediante la siguiente ecuación:

Esta ecuación fue derivada usando la ley del gas ideal asume 12,3 M de HCl, una temperatura de 23 ° C y presión atmosférica normalizada de 101,3 kPa.

El efecto de la concentración de gas de cloro en la germinación de semillas de Col-0 mostró depende del tiempo de esterilización según lo indicado por una interacción significativa entre el tiempo y los factores de concentración (figura 2A, P < 0.01, ANOVA) . Concentración de gas de cloro no tuvo efectos significativos sobre germinación de semillas de Col-0 sometido a la esterilización de 1 h. Con este tiempo de esterilización, todas las concentraciones de cloro gaseoso promovieron igualmente altos niveles de germinación superior al 85% (P > 0.05, ANOVA). Por otro lado, esterilización 3 h de duración resultó en una disminución significativa en la tasa de germinación para la mayor concentración de cloro gas, en comparación con las dos concentraciones de gas inferiores (P < 0.05, ANOVA). Estos resultados indican que los tratamientos de semillas de Arabidopsis con cualquiera de las concentraciones de gas cloro probados durante 1 hora, o con concentraciones de gas debajo del 16.5% durante 3 horas, son igualmente eficaces para preservar la viabilidad de la semilla ya que las tasas de germinación fueron siempre mayores de 82%. Sin embargo, esterilizar las semillas por 3 h con 16.5% de gas era perjudicial para la germinación de la semilla.

La incidencia de moho también fue dependiente de la concentración de gas y tiempo de exposición. Crecimiento de moho se inhibió eficazmente con las relativamente altas concentraciones de gas cloro 6.1% y 16,5% para 1 h de duración de tratamiento y con todas las concentraciones de gas de 3 h (figura 2B).

Basado en estos resultados, un tratamiento con una concentración de gas de 6.1% para 1 h (tabla 2) fue seleccionado como la mejor condición de esterilización de fase de vapor para probar el efecto de la esterilización con gas en diferentes líneas mutantes, ya que combina alta germinación () tasa 85%) con muy bajo nivel de contaminación de moho (0,02%).

Efectos de la esterilización con gas cloro y cloro en semillas con germinación diferentes potenciales

El análisis estadístico demostró que la respuesta de germinación a los métodos de esterilización era dependiente en el potencial de germinación de las líneas (Figura 3A, P < 0.01, ANOVA). La esterilización con gas ni lejía ni cloro reduce tasa de germinación de semillas con potencial de germinación alta (grupos 4 y 5). Ningún tratamiento tuvo un efecto sobre la tasa de germinación ya bajo del grupo con la menor germinaciónpotencial (Grupo 1). En cambio, la esterilización con gas cloro resultó en una reducción significativa en aproximadamente 12-18% (P < 0.01, ANOVA) en la germinación de semillas con potencial de germinación intermedio (grupos 2 y 3). Esterilización de lejía también disminuyó tasa de germinación en un 13% del grupo 2, pero no disminuyó la tasa de germinación del grupo 3. Aunque no hubo ninguna diferencia significativa en la tasa de germinación entre el cloro y el cloro tratamientos de gas en cualquier grupo de germinación (Figura 3A, P > 0.442, ANOVA), semillas de esterilizado con lejía tenía ligeramente por encima de germinación de semillas esterilizado por el gas en todos los grupos de germinación.

Tratamientos de esterilización alterados (P < 0,001, ANOVA) el porcentaje de semillas afectadas por molde (figura 3B). Ambos esterilización de gas y el blanqueador de cloro resultaron en menos crecimiento de moho (P < 0.05, ANOVA) en comparación a la no esterilización. No hubo diferencias en nivel de molde detectado entre gas y cloro esterilización en cualquier grupo (figura 3B, P > 0.4, ANOVA).

Figura 1: efectos de la lejía concentración y tiempo de esterilización en la germinación de semillas de Arabidopsis Col-0. Los valores son medio ± SD de 5 repeticiones independientes del experimento. * indica diferencias significativas en relación a lo 5 min remojo duración para una gama de concentraciones de cloro (P < 0.01, ANOVA). ^#indica diferencias significativas de 80% y concentraciones de bleach 100% en comparación con 40% y 50% para 20 minutos período de tiempo (P < 0.01, ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: efectos de cloro gas de concentración y tiempo de esterilización de las semillas de Arabidopsis Col-0. (A) (B) molde nivel y tasa de germinación. Barras de error representan medio ± SD de 5 biológica y 5 técnicos repeticiones del experimento. Medios que no comparten una letra son significativamente diferentes (P < 0.05, ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: efectos de la esterilización con gas cloro y cloro en semillas con potencial de germinación diferentes. (A) (B) molde nivel y tasa de germinación. Las 100 líneas de SALK T-DNA fueron clasificadas en cinco grupos según su potencial de germinación de define como la tasa de germinación en ausencia de cualquier agente de esterilización. Los grupos basados en la tasa de germinación fueron los siguientes: Grupo 1 (0-20%), grupo 2 (21-50%), grupo 3 (51-70%), grupo 4 (71-90%) y Grupo 5 (91-100%). Las líneas fueron elegidas al azar y su germinación potencial no depende del genotipo. Los valores son medio ± SD Obtenido de tres repeticiones independientes del experimento. Letras ("a", "ab", "c", etc.) por encima de cada valor indican las agrupaciones estadísticas de medios de la categoría. Medios que no comparten una letra son significativamente diferentes (P < 0.05, ANOVA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tiempo de esterilización (min)	Concentración de cloro (%)
	40	50	80	100
5	0.00%	0.00%	0.00%	2.13%
8	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
10	0.00%	0.50%	0.00%	0.36%
15	0.00%	0.00%	0.00%	0,68%
20	0,19%	0.28%	0.00%	0.00%

Tabla 1: Nivel de molde de semillas de Col-0 blanqueador-esterilizado.

Bleach	JC.	Tiempo	% Cloro gas (mol Cl2/mol total de gas)
(mL)	(mL)	(h)
25	1	1	2.1
25	1	3	2.1
100	3	1	6.1
100	3	3	6.1
200	9	1	16.5
200	9	3	16.5

Tabla 2: Cloro (Cl₂) tratamientos de esterilización de semillas de tipo salvaje de Columbia usando un contenedor de 7 L de gas.

1 mesa adicional: Una hoja de cálculo programada para llevar a cabo el cálculo para diferentes volúmenes de contenedor y % Cl₂. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Al crecer las semillas de Arabidopsis en medios estériles, debe aplicarse algún tipo de esterilización. Tratamientos de esterilización de gas cloro y cloro provocar similares germinación tasa y molde de inhibición del crecimiento. Ningún método de esterilización causa una reducción significativa en tasa de germinación para las semillas con germinación alto potencial; sin embargo, se recomienda la esterilización de lejía para las líneas con menor potencial de germinación (20-70%), debido a la pequeña, aunque no significativa, mejoría en la tasa de germinación en comparación con la esterilización con gas (Figura 3A).

Esterilización de las semillas de Arabidopsis con concentraciones de cloro de 40-100% hasta 10 min ofrece porcentajes de germinación satisfactoria y la supresión de molde eficaz. Aunque las concentraciones de cloro menos que el 40% ofrecer esterilización adecuada para la mayoría los lotes de semillas, usando una concentración de 40% o mayor garantiza esterilización eficaz de incluso los lotes de semillas fuertemente contaminadas. Es importante no superar los 10 minutos de esterilización usando blanqueador con concentraciones iguales o superiores al 80% para evitar defectos en el desarrollo de la plántula y semilla alta mortalidad.

Tratamiento de semillas de Arabidopsis con concentraciones de gas cloro de 16,5% para resultados 1 h en tasas de germinación alta y eliminación de molde adecuada o 6.1%. Concentración de gas de cloro bajo (2,1%) puede ser utilizado con éxito por aumento de la duración de la esterilización 3 h.

Cuando algunas líneas deben ser esterilizados, se recomienda esterilización líquida en una solución de lejía de 50% durante 10 minutos. Para un mayor número de líneas, la esterilización con gas con una concentración de gas de 6.1% para el 1 h es una mejor opción ya que muchas líneas se pueden esterilizar fácilmente y rápidamente con la menos manipulación.

Nuestros resultados proporcionan condiciones estandarizadas para esterilizar gran cantidad de semillas de diferentes genotipos y las semillas con germinación más baja posibles. La única limitación de estas técnicas de esterilización es que no se puede aplicar a las semillas con las tasas de germinación inferior al 20% debido a la mortalidad extensa de semillas. Métodos alternativos, como sonicación¹⁷, para aumentar la tasa de germinación en la ausencia de esterilización podrían ser beneficiosos en estos casos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes	GeneMate	C-3260-5	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube	GeneMate	C-3262-1	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container	Sistema	1016265438	Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl	Sigma-Aldrich	320331	Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop	Fisher Scientific	22-363-603	Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019	Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach	Clorox	Regular-Bleach	Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933	Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape	3M	1530-1	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524	Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M	Bemis Company	#PM996	Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips	Whatman	2613991	Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar	Fisher Scientific	50-255-212	Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Chemical used in the process of making MS media
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100	Chemical used in the process of liquid sterilization
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	CS70000 (Col-0)	Arabidopsis wild-type seeds
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_037606C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_041402C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_059101C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_063470C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072048C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072240C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081989C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084124C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_089717C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107354C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110111C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111322C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113109C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114872C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115657C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_116803C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039445C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039782C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_043037C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_045828C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_048556C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
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Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083630C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
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Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110580C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110617C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111424C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111584C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115837C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_019535C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_026478C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_046565C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049258C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_056307C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081292C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083488C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110573C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112793C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113658C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113904C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114673C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114709C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115455C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_013186C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_018261C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_062509C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080639C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_088586C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_096651C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106900C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110131C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111051C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111245C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113223C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_121391C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_125097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_201905C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_210001C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_000662C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_029335C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_047760C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_071275C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080530C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103881C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110864C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_120294C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_124390C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_132808C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_137036C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_139519C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_140643C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_142288C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_143304C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_147597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_209076C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081081C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107487C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2